材料和试剂

甲NTI-FLAG的Fab生成和染料-缀合
Pierce Fab 制备试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：44985）
0.6毫升或1.7毫升低保持管（托马斯科学，产品目录号：1149K01和1159M35PK ，分别）
PD-mini G-25 脱盐柱（GE Healthcare，目录号：95055-984）
Amicon Ultracel-50（50 kDa -cutoff）15 - ml 离心过滤装置（Millipore Sigma，目录号：UFC9050）
Amicon Ultracel-10（10 kDa -cutoff）15 - ml 离心过滤装置（Millipore Sigma，目录号：UFC9010）
Amicon Ultracel-10（10 kDa -cutoff）0.5 - ml 离心过滤装置（Millipore Sigma，目录号：UFC5010）
FLAG抗体（FujiFilm Wako Pure Chemical Corporation，目录号：012-22384（Anti-DYKDDDDK小鼠单克隆IgG2b抗体）
Cy3 N-羟基琥珀酰亚胺酯单反应染料包（VWR，目录号：95017-373 PK）
二甲基小号ulfoxide（DMSO）（Millipore公司Sigma，目录号：D8418）
碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Millipore Sigma，目录号：S5761-500G）
磷酸盐-b uffered小号艾琳（PBS）（热Fisher Scientific公司，目录号：AM9625）

晕-MCP和抗SunTag的scFv -GFP p urification
BL21大肠杆菌（DE3）pLysS感受态细胞（Novagen ，EMD微孔，目录号：69451-3）
2 × YT生长培养基（Research Products International，目录号：X15600-5000.0）
氨苄西林升林（钠）USP级（GoldBio ，目录号：A-301-100）
氯霉素 USP 级（GoldBio ，目录号：C-105-100）
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（GoldBio ，目录号：I2481C100）
磷酸盐-b uffered小号艾琳（PBS）pH 7.4的
钠Ç hloride（氯化钠）ACS克RADE
蛋白酶抑制剂混合物片剂小号（皮尔斯TM无EDTA蛋白酶抑制剂片剂迷你，热科学，目录号：A32955）
4-（2-氨基乙基）苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF丝氨酸蛋白酶抑制剂）（GoldBio ，目录号：A-540-10）
咪唑 ACS 试剂，≥ 99% 滴定（Sigma-Aldrich）
Amicon Ultracel-30（30 kDa -cutoff）15 - ml 离心过滤装置（EMD Millipore，目录号：UFC903024 ）
基于 HEPES 的缓冲液（见配方）
HisTrap缓冲液 A （见配方）
HisTrap缓冲液 B （见配方）
Superdex缓冲液（见配方）

U-2 OS 细胞培养
U-2 OS 细胞（ATCC，目录号：ATCC HTB-96）
DMEM （+/-），高葡萄糖，无谷氨酰胺（参见 DMEM（+）培养基配方）（Thermo Fisher Scientific，目录号：11960069）
胎b绵羊小号erum（阿特拉斯生物制剂，目录号：F-0050-A）
青霉素小号treptomycin（赛飞世尔科技，目录号：15140-122）
L-克lutamine ，200毫（100 × ）（热Fisher Scientific公司，目录号：25030081）
胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：25300062）
100 - mm 细胞培养皿（VWR，目录号：82050-916）

珠加载和染色 Halo-MCP 与 JF646 配体
106 - µm 玻璃珠（Millipore Sigma，目录号：G4649）
Spectramesh编织过滤器聚丙烯开口：105 - µm（Spectrum Labs，目录号：148496）
感兴趣的质粒 DNA
Cy3 anti-FLAG Fab（如步骤 B8 中所述制备）
纯化的抗SunTag scFv -GFP（如步骤 C19 所述制备）
纯化的 Halo-MCP（如步骤 C19 中所述制备）
无酚 DMEM（Thermo Fisher Scientific，目录号：31053036）
Janelia氟646 HaloTag升igands（Promega公司，目录号：GA1120）
0.6 -毫升升流保持管（托马斯科学，目录号：1149K01）
磷酸盐-b uffered小号艾琳（赛飞世尔科技，产品目录编号：AM9625）

成像
玻璃-底部ED菜，35 -毫米，＃1.5，14 -毫米的玻璃，未涂覆的（马蒂克公司，目录号：P35G-1.5-14-C）
Opti -MEM，减少血清培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：31985070）
嘌呤霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：A1113803）
Harringtonine（Cayman Chemical Company，目录号：26833-85-2）
钠一rsenite （NAAS ）（Millipore公司Sigma，目录号：S7400-100G）
二硫苏糖醇（DTT）（Thermo Fisher，目录号：R0861）

设备

紫外可见小号pectrophotometer（赛飞世尔科技，型号：纳米滴OneC ）
台式离心机（Beckman Coulter，型号：Microfuge 20）
冷却离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall Legend XFR with F14 6x250LE）
声波器
HisTrap HP ，5 - ml（Cytiva ，原 GE Healthcare目录号：17524801）
HiLoad 16/600 Superd ex 200 pg柱（Cytiva目录号 28989335）
荧光显微镜（能够进行薄切片；推荐使用共聚焦显微镜、光片显微镜和 HILO 显微镜），带有台顶培养箱

软件

单软件-分子跟踪，例如，TrackMate （Tinevez 。等人，2017年），或者我们自定义的数学代码中发现的：
https://github.com/Colorado-State-University-Stasevich-Lab/mRNA_Tracking_BioProtocol

程序

浓缩抗FLAG抗体并制备抗FLAG Fabs
一般评论：5 mg 抗 FLAG 抗体以 ~0.4 - 0.6 mg/ml的浓度运输。在该步骤中，4毫克抗体被浓缩至4 -8毫克/毫升到穿心莲Ë所述的Fab。注意：Ultracel-50 过滤器允许小于 50 kDa 的任何物质通过。全长抗体是〜150 kDa的和第我们不传递通过，但的Fab确实。因此，该过滤器不适合在下面的程序B 中浓缩 Fab 。
将离心机冷却至 4 °C。
从运输容器中吸取 4 mg anti-FLAG AB 到 Ultracel-50 离心过滤装置中（最多 15 ml 样品体积）。添加 1 × PBS 以将过滤器单元填充至 15 ml。
在 4°C 下以 5,000 × g离心10-20 分钟。
丢弃流出液并添加 1 × PBS 以将过滤器单元填充至 15 ml。
重复4 ×至缓冲器完全替换为1 × PBS和充分浓缩的抗体。
离心后，大约 0.5 - 1 ml 抗体应保留在Ultracell室的顶部。将其转移到低保留管中。
转移后，通过移液 50 μl 1 × PBS清洗 Ultracel-50 过滤器的两侧。上下移液几次，让 PBS 冲洗过滤器表面，以便将所有残留的抗体冲洗到过滤器单元的底部，在那里可以轻松吸取并添加到低保留管中的浓缩抗体（从上面的步骤）。
使用NanoDrop测量浓度。
最终浓度应在 4-8 毫克/毫升左右。
使用皮尔斯的Fab制备试剂盒产生的的Fab按照制造商的说明。
提示：建议执行的Fab制备只是一次用4毫克浓缩抗FLAG抗体（保持1毫克全长抗体作为备用）。这不仅具有成本效益和时间效益，而且在我们的手中还可以在 Fab 制备过程中最大限度地减少抗体损失。
Pierce Fab 制备套件说明可在以下位置找到：
https://assets.fishersci.com/TFS - Assets/LSG/manuals/MAN0011651_Pierce_Fab_Prep_UG.pdf。
需要注意的是2个的Fab小号为每个抗体产生的，具有各Fab大致50 kDa的（或三分之一的全长抗体）。因此，4 mg 抗体起始材料将产生 2.67 mg Fab。一般地，我们失去一些抗体材料在制造过程中的Fab，所以我们通常最终得到1.5 - 2毫克的Fab。
使用 15 - ml Ultracel-10 离心过滤装置浓缩抗 FLAG Fab ，如上述程序A。
注意小号：
请勿意外使用 Ultracel-50 离心过滤装置！Ultracel-10 将允许小于 10 kDa 的所有物质通过。因此，的Fab，这是〜50 kDa的，将不通过，并将成为集中于过滤器单元的顶部。
你Ç一个还使用0.5 -毫升Ultracel-10离心过滤装置进行该步骤; ħ H但是，这将需要更多的时间，因为只有0.5毫升可以同时进行浓缩。
使用NanoDrop测量浓度。
理想情况下，最终浓度应在 2 mg/ml 左右，这样 0.5 ml 将是 1 mg Fab。
将浓缩的抗 FLAG Fab 储存在 4°C。
提示：我们发现这两种抗FLAG全长抗体和Fab可以存储在一个标准的4℃冰箱十年不降解。重复冻融循环将对 Fab 功能有害，因此不推荐使用。

甲NTI-FLAG的Fab染料缀合（Cy3的抗FLAG FAB）
一般评论：起始组分是在程序A 中制备的纯化的抗 FLAG Fab 。
采取一从小瓶一个5包的Cy3的单反应性NHS酯。
将 Cy3-NHS 酯试剂溶解在小瓶中的 100 μl DMSO 中，并在 -20°C 下储存。
将步骤 A 中的100 μg纯化 Fab（~50 μl ）移入低保留管中。
添加灭菌的 1 × PBS 以达到 90 μl的总体积。
加入10微升的1M小号裂果碳酸氢达到100的总体积微升。
提示：建议以制备新鲜的1M小号反应之前裂果碳酸氢盐。
添加的染料的正确量（此量我š经验发现，参见Hayashi- Takanaka等人，2014）。
对于在 100 μl DMSO 中稀释的 Cy3 ，添加 1.33 μl 。
轻轻敲击管子以均匀分布。
将在管防光包和附加到肩，或能有效地旋转管的任何设备。
在室温下旋转孵育 1 小时。
用 G-25 minitrap 纯化Cy3 抗标志 Fab 。
将离心机冷却至 4°C。
d iscard的从缓冲器的G-25 minitrap通过允许500和平衡体微升1 × PBS中，以通过充分运行通过重力流动。
ñ OTES：
重复 3 次以完全平衡。
注意不要让 G-25 minitrap柱变干。
简单地将装有孵化 Fab 的管子向下旋转，以从盖子和侧面去除结合的 Fab。
将所有 100 μl孵育的 Fab移液到 G-25 minitrap 的顶部。
注：请确保列是直的，吸管混合自命直接进入市中心。
移取 450 μl 1 × PBS 到柱顶以进行循环。
注意：您可以用移液器再吸 50-100 μl以迫使结合的 Fab（较低的粉红色条带）移近色谱柱底部。
当共轭 Fab 带接近柱底时，获得新的低保留管以捕获共轭 Fab。
吸移管500微升1 × PBS我n要该柱的中心。较低的 Fab 带将流出并应被捕获在低保留管中。
注意：含有共轭 Fab 的溶液会呈粉红色。
将捕获的结合 Fab 蛋白转移到 Ultra-10 0.5 - ml 离心过滤装置中，将其浓缩。
对齐的过滤器垂直于所述离心机。
以12,000 × g离心5 分钟。
d iscard的流过液和500加起来微升1 × PBS到过滤器。
通常，该流出液是明确的，表明大部分的染料缀合到所述Fab。
离心机在4℃ ，12000 ×克5分钟。
丢弃的flowthr ough 。
添加 500 μl 1 × PBS。
以12,000 × g离心10 分钟。
移液管出来的缀合的Fab其保持在顶部的Amicon超过滤并转移到一个新的0.6 -毫升低保持管（通常，这是体积约50微升）。
转移后，洗Ultracel-10 0.5的侧面-吹打20-30毫升滤波器微升1 × PBS中。上下吸管几次，让 PBS 冲洗过滤器表面，以便将所有残留的缀合 Fab 冲洗到过滤器单元的底部，在那里可以轻松吸取并添加到 0.6 - ml 中的浓缩缀合 Fab 中低保留管（来自上面的步骤）。
测量的浓度，并用吸收光谱一个纳米滴。
首先LY ，选择蛋白质和标签; 吨母鸡Ç hoose的样品类型为IgG和所述适当的Cy3染料。测得的浓度应接近1毫克/毫升用吸光度比的〜1-2。
计算标注度：

其中ε Fab是Fab的消光系数 (70,000 )，是用于偶联的染料的消光系数（Cy3为 150,000 ），并且是染料偶联的 Fab 片段在 280 nm 和发射峰值处的测量吸光度分别为染料的光谱（Cy3 为 570 nm），并且是染料的校正因子（染料在 280 nm 处的吸光度与峰值处的吸光度之比；Cy3 为 0.08）。

理想情况下，DOL 应接近 1，对应于每个 Fab 约 1 个染料。如果该DOL太低，整个过程可以重复。
对于工作库存，将 Cy3 anti-FLAG Fab 在 1 × PBS 中稀释至 0.5 mg/ml 的浓度。
注意：在 4°C 下储存。

纯化的MCP融合至HaloTag （光晕-MCP）和抗SunTag的scFv融合至的eGFP （抗SunTag的scFv -GFP）
变换大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞用所述表达质粒（PHIS卤代2MCP或PHIS -的scFv -GFP -质粒是根据要求提供）。
生长，并在37℃下在摇2转化细胞× YT肉汤含有100mg / L一mpicillin和25mg / L ç hloramphenicol直到细胞达到OD600。
当达到此密度时，将温度降低至 30°C（Halo-MCP）或 18°C（抗SunTag scFv -GFP）。
添加 0.4 mM IPTG。
分别为 Halo-MCP 或抗SunTag scFv -GFP孵育 3 或 16 小时。
将离心机冷却至 4°C。
沉淀的离心细胞以2041 ×克30分钟，在4℃。
重悬的沉淀物在的HisTrap缓冲器甲（20毫升，每1个培养物）和添加p rotease抑制剂混合物（制造的r建议）。
裂解的，在50％的输出细胞通过超声处理; 开启30秒，关闭 90 秒。
沉淀的离心裂解物在30186 ×克，4℃30分钟。
将两个HisTrap HP 5 - ml 色谱柱串联并使用HisTrap缓冲液 A预平衡色谱柱。
将上清液加载到柱子上。
用 5 个柱体积（CV，50 毫升）的HisTrap缓冲液 A洗涤柱。
用 10 CV (100 ml) 的线性梯度 0-500 mM咪唑（HisTrap缓冲液 B）洗脱。
浓缩纯化的蛋白质（光晕-MCP或抗SunTag的scFv使用-GFP）级分的的Amicon Ultracel-30（30 kDa的-cutoff）15 -毫升离心过滤器单元的约2毫升的最终体积。
平衡一个的HiLoad 600分之16的Superdex 200皮克用柱的Superdex缓冲器。
将浓缩样品加载到平衡的HiLoad 16/600 Superdex 200 pg色谱柱上。
通过 15% SDS - PAGE检查馏分的纯度。浓缩含纯化，使用蛋白质的级分的的Amicon Ultracel-30 15 -毫升离心过滤装置。
使用NanoDrop确定蛋白质浓度。
分装成小体积小号，闪速冷冻用液氮，并储存在-80℃。
对于工作储备，稀纯化晕-MCP到0.13毫克/毫升1的浓度× PBS和抗SunTag的scFv -GFP至0.5mg / ml，在1 × PBS中。
储存在 4°C。
提示：尝试制作 10-20 μl的小工作储备体积。稀释的纯化蛋白在 4°C 下可保存约 2 个月。

酸洗制备玻璃珠
注意：请小心不要吸入的玻璃珠; 吨哎是有毒的肺部。
消毒在25毫升的2M5毫升玻璃珠的NaOH 2小时，在50 -温和混合毫升锥形管，优选地使用一个旋转器。
倒出NaOH ，保留尽可能多的珠子。如果珠子处于悬浮状态，它们可以在离心机中短暂旋转。
用细胞培养物彻底清洗珠粒级水直到pH为中性（使用一对pH值的测试条的eluat ë ）。每次倒出洗涤水，就像以前一样。
用 100% 乙醇彻底冲洗珠子 2-3 次。每次倒出乙醇，就像以前一样。
洒珠至无菌容器（例如，100 -毫米P ETRI皿）和允许空气干燥在生物安全柜过夜。
注意：当珠子完全干燥时，它们看起来是沙质的，即在轻敲容器时它们不会结块或剥落。
如果可能的话，对珠子进行紫外线消毒 30 分钟。
储存在干燥器中以保持珠子干燥。

U-2 OS 细胞培养
制作 DMEM (+) 。请参阅下面的食谱。
储存在 4°C。
将 U-2 OS 细胞保持在不超过 90% 的汇合处。
成像前一天，将细胞分成MatTek室，如下所示：
热身的胰蛋白酶和DMEM（+）。
除去的从细胞中的37℃ ，5％CO 2培养箱中。
取出所有介质。
用 1 × PBS洗涤 2-3 次。
添加足够的胰蛋白酶以覆盖盘子的底部。
在室温下孵育 30 秒。
吸出或移出胰蛋白酶。这将使在上面薄薄的一层足够用于细胞分离换货。TI为lt的菜来回几次，以确保胰蛋白酶的一层薄而均匀的扩散。
等待 1-5 分钟，让细胞分离。这可以通过摇动/敲击培养皿或将培养皿短暂放入 37°C 的培养箱中来促进。
添加DMEM（+）（10毫升一100 -毫米皿）。
将盘子倾斜45 °角。
为了确保这最取出细胞，吸液管的顶部媒体的菜这么认为它运行下来，洗朝下方，在那里他们可以吸取细胞。反复吹打还可以帮助以去除细胞团块。
转移的细胞和培养基进入15 -毫升锥形管中。这是可选的，但将有助于以防止再次秉承菜细胞，如果有镀到前一段时间马蒂克室。
上板细胞到马蒂克室在75％confluenc È （约9.0 × 10 5细胞）。
在装入珠子前 1-2 小时，将培养基从 DMEM (+) 更改为Opti -MEM，并辅以 10% FBS (v/v)：
洗的细胞两次用1 × PBS。
添加Opti -MEM + 10% FBS (v/v)。
在 37°C 下孵育。
注意：此步骤是可选的。细胞可以留在 DMEM (+) 之前装载。我们的实验室凭经验发现 OPTI-MEM + FBS 中的细胞更有可能表达感兴趣的质粒，并且通常更健康。

装珠
注：应用玻璃珠的顶部的电池可以实现多种方式。我们建议使用手工制珠器，它可以有效地将均匀分布的单层珠子撒在细胞上。另见（Cialek 等，2021）。
创建一个自定义的珠加载器（图 2 ）。
从MatTek室中取出玻璃底部。
在孔上放置一个~100 - µm 尼龙网。用胶带固定。
加入玻璃珠。
用MatTek盖子盖住顶部。用封口膜固定。
用另一个MatTek盖子盖住盘子的底部（有网的一面）。
倒置存放在干燥器中，以保持珠子干燥并在室内。

图 2. 描述如何制作自定义珠子加载器的步骤。

在工作台上，将以下物质添加到低保留 0.6 - ml 管中：
~0.5 µg Cy3 anti-FLAG Fab（在步骤 B8 中制备的 ~1 µl 工作原液）。
~0.5 µg 抗SunTag scFv -GFP（在步骤 C19 中制备的 ~1 µl 工作原液）。
~0.13 µg 纯化的 Halo-MCP（在步骤 C19 中制备的 ~1 µl 工作储备）。
750 ng 目的质粒 DNA。
1 × PBS 至总体积为 4 μl 。
通过移液和轻弹管混合均匀；不要涡旋。
S快速锁定。
取的马蒂克室含有细胞出来的培养箱并进入无菌罩。
除去的MEDI微米（的Opti -MEM + FBS）和p花边在一个15 -毫升锥形管中。
提示：请务必删除所有中介嗯，以避免稀释样品溶液，特别是从盖玻片区域，可以保留一些中介嗯，因为它的凹状的。如果MEDI微米留在盖玻片，玻璃珠在步骤8在上面洒下面有时会浮起，而不是实际接触的细胞。要小心，不要让细胞来通过以下步骤及时跟进干燥。
将 4 µl 溶液添加到细胞顶部。
通过轻轻敲击自制洒玻璃珠到细胞beadloader抵靠腔室。
提示小号：
该beadloader帮助到洒在珠一种统一的方式，所以这很容易获得整个盖玻片单层。然而，这可以被实现，而不一个beadloader通过简单地吹吸的珠使用一个1 ，000 -μ升移液管尖端，并简要摇动尖端在细胞上洒在上顶珠。虽然这种方法可行，有时该珠将落在上团块的细胞，这往往小号到导致细胞剥离更容易。
最容易装载的细胞是贴壁细胞，例如 U-2 OS、HeLa、RPE1 或成纤维细胞。其他细胞分离容易（例如，HEK293细胞）是比较困难beadload因为他们往往剥离。在这种情况下，我们建议多聚赖氨酸，以方便坚持NCE盖玻片，防止脱皮后beadloading 。
如果该细胞是太汇合，他们可以在后一个庞大层剥离beadloading 。理想的confluenc ê是70-90％。
卸下装珠机。
对着引擎盖工作台敲击腔室 5-12 次。
注：此操作会导致玻璃珠翻转，爆炸针对的细胞。与电穿孔的作用类似，滚珠会在细胞膜上产生微小的撕裂。吸取到细胞顶部的纯化蛋白质/DNA 然后可以通过这些微小的眼泪扩散（虽然珠子太大而无法进入）。尽管这些眼泪物理破坏细胞，我们发现了细胞很快恢复。根据我们的经验，在2-3小时，孔细，显示没有压力颗粒，并有准备成像。
以45 °角倾斜腔室。
倒入的Opti -MEM + FBS MEDI微米这是在步骤5中返回到取出的细胞。
提示：当浇MEDI嗯放回电池，要小心，不要打扰的细胞太多。我们建议浇筑中介微米到的角落马蒂克室，并允许它轻轻地洗了盖玻片。通过倾斜所述腔室中，该步骤也有助于珠以浮起于边缘，在那里他们可以很容易地除去使用吸液管或吸气。
在 37°C 、5% CO 2下孵育1 小时。
在该温育时间，温苯酚-自由（瓦特海特）的DMEM +/-媒体至37℃。

使用Janelia Fluor 646 HaloTag配体（JF646-Halo 配体）染色 Halo-MCP
将JF646-Halo 配体溶解到DMSO中的浓度为 10 mM作为库存溶液。在 DMSO中将库存溶液稀释到 0.2 mM的浓度作为工作库存。
储存在-20°C。
分装 10-15 μl以避免过度冻融循环。
从 -20°C 取出一份 JF646-Halo 配体。
带来的JF646卤代配体和加温瓦特海特DMEM（+/-）MEDI微米到罩。
制备1：1000稀释的JF646卤代配体在瓦特海特DMEM（+）MEDI微米。
稀释液的最终体积应足以覆盖细胞表面。
对于 35 - mm MatTek腔室，500 μl就足够了。
从去除细胞的孵化器，并把他们带入罩。
在倾斜室一个45 °角。
删除所有中介嗯。
洗涤细胞轻轻地用w ^海特DMEM（ - ），直到大部分的珠子已经删除。
在JF646-晕配体稀释添加到顶部的细胞。
在 37°C 、5% CO 2下孵育20 分钟。
洗涤细胞两次W¯¯海特DMEM（ - ）中介嗯。
加入2mL瓦特海特DMEM（+）至该细胞。
细胞可以在洗涤后立即成像。
将细胞保持在 37°C和 5% CO 2 下，直到准备好成像。

成像 [视频1 - 3色电影示例]
注：成像可以进行在配备有〜488，〜563任何显微镜，和〜647个纳米的激光器，适当的过滤器，一台顶培养箱，并且敏感EMCCD或SCMOS摄像机。我们建议使用HILO显微镜（德永等人，2008），光片显微镜，或共焦显微镜，以减少的背景信号。TIRF 显微镜可用于检查盖玻片附近的翻译位点。也可以使用宽场，但由于没有切片，单个 RNA 翻译位点的信噪比会有所降低。
提示：自发荧光看起来像平移点，因为它在很宽的波长范围内发出荧光，因此同时出现在多个通道中。因此，重要的是要增加嘌呤霉素，以确认该点的翻译网站。
将细胞置于平台顶部培养箱（37°C，5% CO 2 ）
添加p uromycin到测试活动翻译
设置了成像实验，以捕获整个细胞与1 -每个卷捕获15周总之间分钟间隔的时间点。
注意小号：
每个卷捕获之间的间隔可以减小以更精确地测量翻译截止的动力学在一个单元格。
体积表示的所需的图像整个小区的z堆叠从顶部到底部。出于我们的目的，我们对 13 个 z 堆栈进行成像，其中每个堆栈为 0.5 μm 。可以调整堆栈数量和大小以满足特定需求。
获取五个时间点。
在前五个时间点后，将最终浓度为 50 - 100 μg /ml 的嘌呤霉素直接添加到细胞顶部。
注意：避免直接接触腔室，因为这可能会移动腔室并改变您的成像视野。
继续对细胞成像 10 分钟（10 帧）。如果翻译网站是真实的，它们会很快消失，通常在一两分钟内。
注意：作为细胞压力源和哈灵顿碱诱导的核糖体流失测定的初步测试，我们建议以更大的间隔（3-5 分钟）进行数小时的成像实验。确定响应时间后，可以相应调整间隔和成像时间。以下描述小号的成像条件在U-2 OS细胞的是，我们发现对于卓有成效压力源和三尖杉酯实验。
添加 Harringtonine 以测试核糖体流失时间
设置了成像实验，以捕获整个细胞与1 -每个卷捕获50周总之间分钟间隔的时间点。
获取五个时间点。
在前五个时间点后，将最终浓度为 3 - 5 μg /ml 的Harringtonine直接添加到细胞顶部。
注意：避免直接接触腔室，因为这可能会移动腔室并改变您的成像视野。
继续为剩余的 45 帧（45 分钟）对细胞进行成像。
加入压力源如小号裂果一个rsenite （NAAS ）和ð ithiothreitol （DTT）
设置您的成像实验，以便在每次体积捕获 35 个总时间点之间以 3 分钟的NaAs和 DTT 的间隔捕获整个细胞。
获取五个时间点。
在前五个时间点之后，分别以 0.5 mM或 0.75 mM的终浓度添加NaAs或 DTT 。
注意：避免直接接触腔室，因为这可能会移动腔室并改变您的成像视野。
继续对剩余的 30 帧进行成像。
视频1. 图像预处理步骤（步骤 I1）后细胞的代表性电影。电影以每 6 秒一帧的速度获取。视场为 512 像素× 512 像素 = 66.56 μm × 66.56 μm 。

数据分析（图3 ）
预处理电影（视频 1）
通过 z 创建最大强度投影。
减去所述背景强度从每个信道。
注意：背景水平是通过测量所用相机的固有噪声来确定的。这可以实现通过拍摄图像与关闭相机快门和然后计算这些图像的平均像素强度。
制作一个包含整个单元格的蒙版。此掩蔽步骤将避免包括来自相邻细胞的任何分子。
随着时间的推移创建一个运行平均投影（使用几帧）。这是必要的，如果信号-到-信噪比较差。
注：我们使用了ImageJ软件为小号TEPS我1A-我1b和数学为小号TEPS我1C-我1D。

图3 。的例子生物物理参数示意图该分析ö ˚F所获取的数据可以提供。

跟踪 mRNA 。甲NY单-分子跟踪包都可以使用。我们推荐TrackMate，因为它易于使用（Tinevez等人，2017 年）。我们还在Github上提供了自定义 Mathematica 代码：
https://github.com/Colorado-State-University-Stasevich-Lab/mRNA_Tracking_BioProtocol
检测每个时间范围内的 mRNA 分子。
应用G差值 aussian 滤波器来增强单个分子的信号。
设置阈值对图像进行二值化，以便识别所有 mRNA。
检测物体及其强度质心。
过滤掉太大或太小的对象。这将分别排除聚合和噪声。
如果分析 Harringtonine 或压力实验，请跳到步骤I 5。
Link随时间检测到 mRNA 。
可以使用最近邻跟踪算法。我们允许后续帧之间的最大 mRNA 跳跃大小为 5 个像素（650 nm）（假设间隔<10 秒）。
手动策划轨道以合并由于几帧的 mRNA 信号较暗而意外分裂的轨道和/或省略由于密集环境而与其他 mRNA 无法区分的轨道。
将 mRNA 分为四种不同类型的翻译状态（无翻译、ORF 1 翻译、ORF 2 翻译以及 ORF 1 和 ORF 2 同时翻译）。
通过定心使所有通道作物周围跟踪的mRNA。
在使用多个相机的情况下，必须应用校正因子来调整潜在的相机未对准。为此，根据跟踪的 mRNA 信号的质心位置将计算的转换函数应用于其他通道。可以通过对在所有通道中同时发出荧光的固定珠进行成像来确定转化函数（例如，TetraSpeck微球，0.1 μm ，Thermo Fisher Scientific，T7279）。
平均所有通道中每个轨道的裁剪图像。
检测其他通道（即非 mRNA 通道）中的信号，并根据其他通道中信号的存在与否分为四组。
手动整理分类。这是一项检查，以确保生成的分类是正确的。
使用这些结果来分析细胞内不同 mRNA 的数量。
适合2D ģ aussian到的经裁剪的数据; 牛逼的所有通道和超他会计算强度-决心的mRNA的定位。
使用这些结果来分析核糖体密度和均方位移。
压力和 Harringtonine 分析
使用在步骤I 2a 中发现的检测到的 RNA 分子。
注意：在每帧之间使用较大的时间间隔时，无法随时间链接曲目。由于三尖杉酯和应激诱导核糖体径流可以采取几十分钟的小号到一个小时，我们通常的图像很少（每分钟或更长时间一次），所以个人的翻译网站不能全部被跟踪（虽然通常有几个可跟踪偶然，因为它们相对固定）。因此，下面的分析不需要跟踪单个翻译站点。
通过以检测到的 mRNA 信号为中心，在所有通道中制作作物。
检测其他通道中的信号，并根据其他（非 mRNA）通道中信号的存在与否分为四组。
适合2D ģ aussian到的经裁剪的数据; Ť他将计算的所有通道强度。
结合来自所有细胞和所有实验的翻译站点强度数据。
随着时间的推移绘制强度或翻译站点编号。
食谱

1. 1 M HEPES 缓冲液
25毫HEPES pH值7.9，12.5毫氯化镁，100毫的KCl ，0.1毫摩尔EDTA，0.01％NP40，10％甘油，1 mM的DTT
2. HisTrap缓冲区 A
1 × PBS pH 7.4中，300毫摩尔氯化钠，0.2毫AEBSF，5 mM的B-巯基乙醇
3. HisTrap缓冲区 B
1 × PBS pH 7.4中，300毫摩尔氯化钠，500毫咪唑的0.2毫AEBSF，5 mM的B-巯基乙醇
4. Superdex缓冲区
25 mM HEPES pH 7.9、12.5 mM MgCl 2 、100 mM KCl 、0.1 mM EDTA、0.01% NP40、10% 甘油、1 mM DTT
5. DMEM（+）介质（p苯酚的制备-自由以及）
向500 ml DMEM 中加入 50 ml FBS、5 ml Pen/ s trep、5 ml L- Glu

致谢

我们衷心感谢博士Hataichanok （MAM）Scherman的协议，以净化晕-MCP和抗SunTag的scFv -GFP。我们感谢卢克博士拉维斯友好地提供了JF646 -标记HaloTag配体。我们感谢Stasevich实验室的所有成员的支持和有益的讨论。TJS、ALK 和 TM 得到 NIH 的支持（授权号 R35GM119728）。TJS 也得到了 NSF 的支持（授权号 MCB-1845761）。该协议源自Koch等人发表的工作。（2020 年）。所述beadloading协议最初是在Hayashi-描述Takanaka等。( 2011) 和单分子翻译成像测定首先在Morisaki等人中描述。（2016 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

没有人类和/或动物受试者小号在此协议中使用。

参考

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