材料和试剂

1.在浓FUS样品entration的1-10 μ M（FUS 的生产和纯化在之前发布的协议中进行了讨论（Qamar等人，2018 年）
2. ZnSe 窗口（Thorlabs，目录号：WG70530）
3. MilliQ 水

设备

AFM-IR与热检测：nanoIR1，nanoIR2 ，或nanoIR3（ANASYS仪器，布鲁克，USA）
PR-EX-nIR2 AFM 探针：硅，镀金，标称半径为 30 nm，弹簧常数为0.2 N/m（用于接触模式测量；Anasys, Bruker, USA）
P10 移液器（Starlabs，英国）

软件

内置 nanoIR 软件，（美国布鲁克）
SPIP（丹麦图像计量学，https: //www.imagemet.com/products/spip/ ）
OriginPRO（美国Origin Labs，https: //www.originlab.com/origin ）

程序

AFM-IR 测量的样品制备
移液管10 μ升样品到疏水ZnSe晶体。孵育 1分钟以进行物理吸附。更长的沉积时间是可能的，但这可能会由于表面上的人工自组织而导致伪影。
用1个冲洗三次毫升中号illiQ水以除去所述过量的盐。
在温和的氮气流下干燥。

液-液相的红外线nanospectroscopy测量-分离液滴
打开 AFM-IR 系统和红外 (IR) 激光。这应该在测量前30 - 60 分钟完成，以使系统达到热平衡。
打开内置软件来控制AFM-IR （图URE 3）。选择file>new打开一个新的nanoIR文件。按初始化按钮启动 AFM-IR 系统。

图 3. nanoIR 软件概述。在控制窗口中，成像参数作为输入给出。在显微镜窗口中，相关信息随着成像的进行而呈现。

打开仪器盖和安装探头（图URE 4）。

图 4. AFM 头的照片。悬臂安装在 AFM 头（红色框）上。然后，AFM 头上的旋钮用于调整检测激光的位置。

现在，将光学相机聚焦在悬臂上。选择AFM 探针 >加载> 下一步。在探头焦点下，单击箭头以更改焦点。在示例 XY 移动下，使用箭头将十字准线定位在悬臂上。
使用旋钮将检测激光聚焦在悬臂的末端。四象限光电二极管测量的总和值应至少为 3 V。使用AFM 头中的偏转旋钮，将悬臂偏转调整为 -1 V，然后单击下一步。
关闭仪器的盖子。
将照相机聚焦在使用下的箭头样品焦点上的样品（图URE 5）。

图5插图小号TEPS乙4-乙7.悬臂加载和光学相机和激光聚焦在悬臂的端部。然后，相机聚焦在样品表面上。箭头可用于在样本中导航。

要选择样本上的感兴趣区域，请选择样本 XY 移动。使用箭头在样品表面周围移动。当您确定了感兴趣的区域后，单击方法并参与。
在蛋白质的液滴，形态学的信息，IR吸收研究中的这种情况下，和刚度是特别感兴趣的。要测量这些参数，请选择显微镜窗口下的显示通道。选择高度为形态，振幅2为IR吸收，和PLL频率映射针尖-样品接触共振（图URE小号6和7 ）。
注意：在形态采集过程中，接触的尖端和样品可以被认为是一个耦合弹簧系统。这些弹簧的接触共振与样品的固有刚度有关。较硬的样品引起的增加在接触共振，由此我们可以术语“频移。'

图6.示范小号TEP乙9 ，其中显示频道根据感兴趣的参数中选择。在这种情况下，它们的形态（高度），尖端-样本接触共振频率（PLL频率），以及IR吸收（器Amp2）。

图 7. 尖端和样品之间的接触共振与固有样品刚度单调相关。较硬的样品引起的移位至一个较高的频率，其可被用于研究异质样品的相对刚度。

在控制窗口的AFM 扫描部分设置形态测量的成像参数（图 8）。
注意：在选择成像参数时考虑样品特性很重要。例如，选择较低的扫描速率将减少施加在样品上的侧向力，这与生物样品相关；^ h H但是，这种选择将增加的图像采集时间。甲ħ像素igher数目将增加的图像分辨率，但同样会增加的图像获取时间。应根据样品粗糙度选择增益值（即，较高的积分增益将使系统能够响应样品高度的变化，但也会引入噪声）。以下是推荐的值范围：扫描速率 0.1 - 1.0 Hz和256 × 256 - 1024 × 1024 像素。增益值的适当范围如下：积分 I = 1 - 10 和比例 P = 5 - 30。增益值应选择为具有重叠跟踪和回扫扫描线的最小值。

图8.示范小号TEP乙10 ，其中成像参数是用于形态学映射输入。参数即应当首先考虑的是扫描速度，图像尺寸，分辨率（像素），给定值，并且增益（积分和比例）。

选择扫描以获取形态图。FUS 液滴的代表性形态图和接触共振值如图9 和10 所示。
注意：形态可在动态轻敲模式可以类似地测量，但AFM-IR测量在这里进行接触模式具有更高的信号-到-红外光谱和地图获取期间信噪比。
当形态的映射结束（图URE 9），设置为执行所述IR仪器和接触共振（图URE 10）测量。在显微镜窗口中，单击高度图以将探头放在一个液滴的顶部。然后在控制窗口的nanoIR部分，单击启动 IR以使用 IR 激光照亮样品。

图 9. FUS 液滴形态的代表性图像。液滴的 3D 形态表示为 2D 颜色图，颜色较浅表示高度增加。

图 10. FUS 液滴的代表性接触共振图。在形态学采集期间同时采集接触频率图。尖端-样品接触共振提供有关样品刚度的信息。较硬的样品将导致增加在接触共振，由此我们可以术语“频移。'

要将红外激光聚焦在悬臂上，请单击优化。在这个窗口中，写下你选择的波数，点击添加。
注意：应选择波数，以便您的样品具有显着的吸光度。如果样品在特定波长下吸收IR光，化学键会振动，从而导致样品的热膨胀的是可以通过在与液滴接触针尖来检测。甲典型值˚F或蛋白质样品是1 ，655厘米-1 ，这对应于酰胺I带。悬臂梁的响应与样品对红外光的吸收成正比；因此，红外吸收的差异可以被映射并与相应的形态图相关联。
选择扫描以找到IR激光位置，然后更新对准其与悬臂位置（图URE 11）。关闭窗口。

图11.一种示范步骤B13和B14 ，其中所关注的波数，在这种情况下1 ，655厘米-1 ，被输入。然后选择扫描以找到红外激光位置并更新以将其位置与悬臂对齐。

选择一般在该nanoIR设置小号。输入预期 IR 吸收的波数。然后，停用带通滤波器选项并查看悬臂梁响应的仪表读数和快速傅立叶变换 (FFT)。在 FFT 窗口中，移动绿色光标以读取悬臂梁的共振频率（图 12）。悬臂梁共振的典型值 f或FFT 约为 300 kHz。写在找到的共振频率值一般部分的的频率。中心场并使用频率。50 kHz 的窗口。选择激光功率是足够低，以避免饱和的电表读数，扭曲悬臂响应，和样品过热。

图 12 。B15 的演示，其中设置了红外激光器的参数。在左侧，输入如上所述的参数。在右手侧，仪表读取显示器š悬臂的热机械响应。使用光标将绿色路线置于共振频率的峰值处。确定谐振频率的值后，将其输入Freq. 以左侧为中心。

单击激光脉冲调谐窗口以使用共振增强模式。选择300kHz的频率中心，50kHz的调范围，和占空比为5％的激光的（占空比是在其期间存在分数时间激光脉冲发射）。点击上获取扫激光的脉冲速率。使用图中的光标将激光脉冲调整到吸收红外光的样品热膨胀的机械响应频率（图 13）。

激光调谐的图13.示范（小号TEPS B16和B17）。在激光脉冲调窗口，如在输入的参数小号TEP B19 。单击获取以显示接触共振频率和相位。在自动调谐窗口下，选择PLL以跟踪共振增强模式的接触共振频率。

为了避免样品中化学和机械信息之间的串扰，重要的是通过锁相环 (PLL)在共振增强模式下跟踪接触共振频率。选择PLL，然后单击PLL 窗口中的零按钮并勾选enable 。选择积分增益 I = 0.5 和比例增益 P = 10。
打开优化再次窗口并识别IR激光器的位置至少3米波的长度对应于所述样品的主要吸收谱带。用于蛋白质样品，这应该是酰胺频带I，II ，和III。此外，识别至少一个波的位置的长度为激光的每个芯片。
点击工具>红外背景校正>新建（图URE 14）。在窗口中，选择感兴趣的光谱区域，在蛋白质样品的情况下为 1 , 800 - 1 , 200 cm -1 。选择相同的脉冲率在确定的小号TEP乙16和5％的占空比。

图14.一种示范的步骤为背景校准（步骤小号B19 - B21）。如上所述输入参数。然后，选择获取以生成背景光谱（即底物）。

选择快速采集并选择激光速度。对于量子级联激光器，典型范围在 20 - 5 , 000 cm -1 /s 之间。背景光谱将用于normali小号的通货膨胀的测量纳米级locali小号编光谱。关闭窗口。
如果快速激光和共振-增强模式不可用，请跳过步骤 B16并在背景和红外光谱采集窗口中选择阶梯光谱而不是快速。这仍将允许进行化学表征。W¯¯往往微不足道这种敏感性不足以达到单-分子的水平，它仍允许用于满characteris的通货膨胀液-液相-具有典型尺寸范围从几百纳米到微米的分离液滴。
现在，测量纳米级-在蛋白质范围局部IR谱（1 ，800 - 1 ，200厘米- 1 ）（图1 5 ）。在IR光谱的设置，选择的IR光谱分辨率的1 - 4厘米-1 。对于共同平均数，至少选择 64。选择获取。
此外，纳米级分辨化学地图可以被获取（图小号1 5和16 ）。要做到这一点，选择的红外成像选项，选择感兴趣的波数（例如，1 ，655厘米-1的酰胺带我），然后点击扫描在AFM扫描窗口。
注意：获取局部红外光谱和红外图的原理大体相同。当获取IR地图，所述尖端在样品，同时保持固定的激光的波数，因此扫描该样品和表面的吸收在该波数作图。当获取的局部频谱，尖端我小号HEL d在上样品和波数是变化的IR激光的固定位置获得跨越一定范围的值的吸收。这提供了完整的 IR 光谱，然后可用于提供有关二级结构贡献的特定信息（下面进一步讨论）。

图 15. FUS 液滴的代表性红外图和局部红外光谱。IR 吸收图可以在形态映射期间同时测量（连同接触共振图）。局部红外光谱也可以在液滴表面的单个点上获得（由蓝色十字表示）。

图 16. 完整的原始形态和红外图以及典型的原始局部红外光谱示例。蓝色横指示瓦特ħ埃雷局部IR光谱瓦特ERE记录。

我们的建议是在一个液滴内获取多个局部光谱，以便为研究其异质性提供适当的统计意义。重复小号TEP B22每滴内多次。

数据处理与分析
打开一个成像处理软件，如 SPIP，来处理 AFM 地图。
通过选择General>Plane Correction>Plane Correction Set-Up一阶展平 AFM 图。
在全局校正下，选择平均轮廓拟合。
选择度数为 0，然后应用。
重复度数=1。
零级通过重复压平IR和刚度相关的地图荷兰国际集团的样品平坦化过程（不含小号TEP C2）。
为了评估所述相对样品刚度，考虑值的分布为的像素的接触共振频率来计算您样品（图8）中的每个感兴趣区域内的平均和标准偏差。然后，将这些平均值绘制为归一化比率（图 1 7 ）。由于确定的复杂性的绝对软液滴的刚度，液滴的刚度应被视为相对于ZnSe衬底。为了证明测得的机械差异是真实的，应对独立的吸头和样品评估机械差异。可以使用您选择的任何软件。

图 17 。测量样品刚度。一个。绘制的每个测量液滴的平均频移示例。乙。的相对刚度的液滴能够通过表示数据作为平均频率偏移的比例来确定。

接着，红外光谱可以通过被处理的OriginPro软件已归一化平滑光谱和它们的二阶导数（图URE 18 ）。

图18.红外光谱的二阶导数提供了有关信息的二级结构的液滴。一个。的代表性处理IR光谱的蛋白质中的范围的液滴（1 ，800 - 1 ，400厘米-1 ）。乙。进行二阶导数运算以鉴定二级结构。

对于取得的各光谱，减去在一个位置靠近获取的光谱，以在ZnSe基片上液滴以消除缓冲器吸收或尖端污染贡献小号。选择分析>数据操作>参考数据。选择Input1作为您的液滴光谱和参考数据输入作为您的 ZnSe 衬底光谱。选择好的。
然后，对于每个液滴或在其区域中的特定位置，计算由averag平均光谱ING在液滴内的不同位置截取光谱。为了降低光谱中的仪器噪声水平，至少应平均 5 个光谱。选择分析>数学>平均多条曲线>打开对话。
对于方法，选择平均值；对于平均 X ，选择通用 X 范围。
根据需要选择其他输出参数并选择Okay 。
通过应用 Savitzky-Golay 滤波器（二阶，9 分）平滑平均频谱。选择分析>信号处理>平滑>打开对话。
神父Ø米为下拉列表方法，选择Savitzky -格雷。
对于窗点，输入9 。
对于多项式阶数，选择2 。选择好的。
接下来，对频谱进行归一化。选择Analysis>Mathematics>Normalise Curves>Open Dialogue 。
对于Normalize Methods ，选择Normalize to [0,1 ] ，然后选择OK 。
取的第二导数的平滑化归一化的光谱。选择分析>数学>微分。
对于衍生顺序，选择2 。
在平滑下，选中Savitzky-Golay 平滑框。对于多项式阶数，选择2 ；对于窗口点选择9 。
勾选Plot Derivative Curve框并选择Okay 。
注：酰胺I带包含所述二级结构信息，如C = O拉伸是影响d由骨架构象。通过取第二微分的去卷积谱提供了关于结构的贡献（即定量信息，提供关于α-直升机的内容的信息的CES ，β-折叠s和无规卷曲s )。这方面的一个例子如图18所示。

致谢

作者承认达尔文学院的资助，剑桥大学(FSR) 和剑桥大学伊曼纽尔学院 (AMM)。该协议主要源自Qamar等人先前提出的工作。(2018)。

利益争夺

作者没有要声明的竞争利益。

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