材料和试剂

1.寡核苷酸（序列和供应商列于表1）
2. T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202L）
3. BSA I-HF ® （新英格兰生物实验室，目录号：R3535L）
注：此公顷š被替换用新的版本（BSA I-HF V2 ® ，目录号：R3733L）。
4.内部制备的Pfu-S DNA 聚合酶(Wang et al. , 2004; Kondo et al. , 2020)
5.内部制备的 T7 RNA 聚合酶（Abramochkin 和 Shrader ，1995；Kondo等，2020）
6. ExcelBand 100 - bp的DNA梯（š mobio Ť童占梅，目录号：DM2100）
7. 0.5 mol/ L -EDTA 溶液（pH 8.0）（Nacalai T esque ，目录号：14347-21）
8.甲酰胺（Nacalai T esque ，目录号：16229-95）
9.甘油（Nacalai Tesque ，目录号：17018-25）
10. 40(w/v)%-丙烯酰胺/双混合溶液（37.5:1）（Nacalai Tesque ，目录号：06121-95）
11.三羟甲基氨基甲烷（Tris）（Nacalai Tesque ，目录号：35406-75）
12.聚乙二醇6000（PEG 6000）（FUJIFILM Wako Pure Chemicals，目录号：169-22945）
13. 1,4 -二硫苏糖醇（DTT）（ナTesque公司，目录号：14128-62）
14.六水氯化镁（MgCl 2 ）（Nacalai Tesque ，目录号：20908-65）
15.氯化钾（K Cl）（Nacalai Tesque ，目录号：28514-75
16.氯化钠（NaCl）（Nacalai Tesque ，目录号：31320-05）
17.聚乙二醇单对异辛基苯基醚（Triton X-100）（Nacalai Tesque ，目录号：12967-45）
18.二甲基亚砜（DMSO）（Nacalai Tesque ，目录号：13407-03）
19.七水硫酸镁（Nacalai Tesque ，目录号：06296-25）
20.亚精胺三盐酸盐（Nacalai Tesque ，目录号：32110-54）
21. 100 mM dNTP Set (NIPPON GENE CO., LTD. , Custom order)
22. CTP, GTP, UTP ( JENA BIOSCIENCE , Custom order)
23. ATP（FUJIFILM Wako Pure Chemicals，目录号：019-09672）
24.苯酚：氯仿：异戊醇25：24：1混合，pH 6.7（Nacalai Tesque ，目录号：25967-74）
25.氯仿（Nacalai Tesque ，目录号：08402-55）
26. 2-丙醇（Nacalai Tesque ，目录号：29113-95）
27.乙醇（EtOH）（Nacalai Tesque ，目录号：14713-95）
28. 2 ×连接溶液 [100 mM Tris-HCl pH 7.5、12 mM MgCl 2 、1 mM ATP、16% PEG 6000、20 mM DTT 和 4,000 U/ml T4 DNA 连接酶]
29. 1 × PCR 溶液 [10 mM Tris-HCl pH 8.4, 100 mM K Cl, 0.1% (v/v) Triton X-100, 2% (v/v) DMSO, 2 mM MgSO 4 , 0.2 mM 每个 dNTP , 0.375 μM 每个引物和 2 nM Pfu-S DNA 聚合酶]
30. 1 × RNA聚合酶溶液[40毫摩尔的Tris-HCl pH 8.0中，1mM的亚精胺，0.01％（V / V）的Triton X-100，10mM的DTT，25毫摩尔MgCl 2 ，5mM的各NTP，和1μMT7 RNA聚合酶]
31. DNA 上样缓冲液 [ 80 mM Tris-醋酸盐 pH 8.0，2 mM EDTA，20% (v/v) 甘油]

表1 。寡核苷酸序列和供应商。NNK 密码子通过三核苷酸亚磷酰胺合成制备（20% Tyr、10% Ser、15% Gly、10% Trp 和 3% 的所有剩余氨基酸，Cys 除外）。缩写：SPC18，垫片18；Pu，嘌呤霉素；HEX，六氯荧光素。

设备

T100热循环仪（Bio-Rad，目录号：1861096J1 ）
Gel Doc EZ（Bio-Rad，目录号：1708270 ）
Mini-PROTEAN 系统（Bio-Rad，目录号：1658000FC ）
冷却板电泳装置（BIO CRAFT，目录号：BE130G ）

程序

单体文库A片段 DNA 的制备
制备以下溶液（35 μl），95°C加热2分钟，室温放置5分钟：
FN3F0.F83（2 μM 终浓度）、FN3F1-2.F29(P)（2 μM 终浓度）、FN3 FF1coR8.F73（1 μM 终浓度）、FN3FF1coR10.F79（1 μM 终浓度）、Fn3an1.R20（ 3NH2)（4 μM 终浓度）和 Fn3an2-1.R20(3NH2)（4 μM 终浓度）在10 mM Tris-HCl pH 7.5 中。
将 2 ×连接溶液 (35 μl) 添加到 (1) 中描述的溶液中，并在 25°C 下孵育 1 小时（连接反应分析见图 3A ）。
将混合物加入 1× PCR溶液（15毫升）和分配77微升所得的溶液加入每个孔中的2 96 -Well PCR板。在以下条件下使用 T7SD8M2.F44 和 FN3BsaI.R40 扩增 DNA ：在 94°C 下进行 1 分钟的初始激活步骤，然后在 94°C 下进行 7 个循环热变性 20 秒，在 55°C 下进行引物退火 20 s，以及在72°C 下引物延伸45 秒（参见图 3B 以优化热循环次数）。
添加 3 M NaCl (1.5 ml )。
将 3 ml 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) 与所得溶液混合，并在室温下以 16,000 × g离心 5分钟。
将 6 ml 氯仿与水层混合，在室温下以 16,000 × g离心 5分钟。
将 16 ml 2-丙醇与水层混合，并在室温下以 16,000 × g离心 15分钟。
取出后的上清液，在室温下加入1ml 70％乙醇，离心5分钟，在16000×克。
取出后的上清液，干燥沉淀，并在0.5ml的10mM Tris-乙酸pH值溶解7.8。
使用ExcelBand 100 - bp DNA Ladder通过 12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳确定 DNA 浓度。

单体文库 B 片段 DNA 的制备
制备以下溶液（35 μl），95°C加热2分钟，室温放置5分钟：
FN3FF2co.F72(p)（2 μM 终浓度）、FN3F3coR10.F70(p)（1 μM 终浓度）、FN3F3coR12.F76(p)（1 μM 终浓度）和 Fn3an3.R20(3NH2)（4 μM 终浓度）浓度）在10 mM Tris-HCl pH 7.5 中。
将 2 ×连接溶液 (35 μl) 添加到 (1) 中描述的溶液中，并在 25°C 下孵育 1 小时（连接反应分析见图 3A ）。
该混合物添加到1 × PCR溶液（15毫升）和分配77微升所得的溶液加入每个孔中的2 96 -Well PCR板。在以下条件下使用 FN3BsaI.F33 和 FN3Pri2.R44 扩增 DNA ：在 94°C 下进行 1 分钟的初始激活步骤，然后在 94°C 下进行 7 个循环热变性 20 秒，在 55°C 下进行引物退火 20 s，以及在72°C 下引物延伸45 秒（参见图 3B 以优化热循环次数）。
添加 3 M NaCl (1.5 ml )。
将 3 ml 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) 与所得溶液混合，并在室温下以 16,000 × g离心 5分钟。
将 6 ml 氯仿与水层混合，在室温下以 16,000 × g离心 5分钟。
将 16 ml 2-丙醇与水层混合，并在室温下以 16,000 × g离心 15分钟。
取出后的上清液，在室温下加入1ml 70％乙醇，离心5分钟，在16000×克。
取出后的上清液，干燥沉淀，并在0.5ml的10mM Tris-乙酸pH值溶解7.8。
使用ExcelBand 100 - bp DNA Ladder通过12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳确定 DNA 浓度。

用Bsa I消化 A 片段和 B 片段 DNA
孵育反应混合物（1 × CutSmart ®缓冲液，2μMA-片段或B片段，200个单位/ ml BSA I-HF ® ;在一个总的400微升），在37℃下进行4 d。
添加 3 M NaCl (40 µl )。
将 100 µl 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) 与所得溶液混合，并在室温下以 16,000 × g离心 5分钟。
将 200 µl 氯仿与水层混合，并在室温下以 16,000 × g离心 5分钟。
将 400 µl 2-丙醇与水层混合，并在室温下以 16,000 × g离心 15分钟。
取出后的上清液，在室温下添加100微升70％乙醇，离心5分钟，在16000×克。
取出后的上清液，干燥沉淀，并在10微升溶解的10mM Tris-乙酸pH值7.8。
将 10 µl 所得溶液与 10 µl DNA 上样缓冲液混合。
受试者的溶液至12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳（10厘米× 7.3厘米× 0.75毫米，300V，20分钟）。
从凝胶上切下条带后，使用 0.3 M NaCl 溶液 (1.2 ml) 洗脱 DNA。
将 1.2 ml 2-丙醇与溶液混合，并在室温下以 16,000 × g离心 15 分钟。
取出后的上清液，以16,000×在室温下添加100微升70％乙醇，离心5分钟克。
取出后的上清液，干燥沉淀，并在100微升溶解的10mM Tris-乙酸pH值7.8。
使用ExcelBand 100 bp DNA Ladder通过12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳确定 DNA 浓度。

连接消化后的 A 片段和 B 片段 DNA
中号IX含有2μM与2各自A-片段和B片段的DNA（100微升）溶液×连接溶液（100微升）。
将所得混合物在 25°C 下孵育 1 小时（参见图 3C 以分析结扎反应）。

DNA片段的PCR扩增
添加混合物至1 × PCR溶液（60毫升）和分配77微升所得的溶液加入每个孔中的8 96 -Well PCR板。
在以下条件下使用 T7SD8M2.F44 和 G5S-4Gan21-3.R42 扩增 DNA 片段：在 94°C 下进行 1 分钟的初始激活步骤，然后在 94°C 下进行四次热变性 20 秒，引物退火在55°C 20 秒，72°C 引物延伸 45 秒（参见图 3D 以优化热循环次数）。
添加 3 M NaCl (6 ml )。
将 8 ml 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) 与所得溶液混合，并在室温下以 16,000 × g离心 5分钟。
将 16 ml 氯仿与水层混合，并在室温下以 16,000 × g离心 5分钟。
将 66 ml 2-丙醇与水层混合，并在室温下以 16,000 × g离心 15分钟。
取出后的上清液，在室温下加入1ml 70％乙醇，离心5分钟，在16000×克。
取出后的上清液，干燥沉淀，并在6毫升的10mM Tris-乙酸pH值溶解7.8。
使用ExcelBand 100 - bp DNA Ladder通过 12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳确定 DNA 浓度。

制备的基因库
孵育一混合物的1 × RNA聚合酶溶液和50nM扩增的DNA; 总共 11 毫升）在 37°C 下放置 6 小时。
添加 0.55 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 和 1.2 ml 3 M NaCl。
将 2 ml 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) 与所得溶液混合，并在室温下以 16,000 × g离心 5分钟。
将 4 ml 氯仿与水层混合，并在室温下以 16,000 × g离心 5分钟。
将 9 ml 2-丙醇与水层混合，并在室温下以 16,000 × g离心 15分钟。
取出后的上清液，在室温下加入1ml 70％乙醇，离心5分钟，在16000×克。
取出后的上清液，干燥沉淀，并在0.5ml超纯水溶解。
将 20 µl 所得溶液与 150 µl 甲酰胺混合。
受试者的溶液至6M尿素5％聚丙烯酰胺凝胶电泳（13.8厘米× 12厘米× 2毫米，40 W，40分钟）。
从凝胶上切下条带后，使用 0.3 M NaCl 50% 甲酰胺溶液（18 ml）洗脱 DNA。
将 4 ml 苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) 与所得溶液混合，并在室温下以 16,000 × g离心 5分钟。
将 8 ml 氯仿与水层混合，在室温下以 16,000 × g离心 5分钟。
将 18 ml 2-丙醇与水层混合，并在室温下以 16,000 × g离心 15分钟
取出后的上清液，在室温下加入1ml 70％乙醇，离心5分钟，在16000×克。
取出后的上清液，干燥沉淀，并在20μl超纯水溶解。
通过测量260 nm 处的OD确定 mRNA 浓度。储存在- 80°C。

mRNA/HEX-PuL 复合物的制备
在第一轮选择之前，将溶液（25 mM HEPES-K pH 7.8、200 mM 醋酸钾、4 - 8 μM RNA 和 4 μM HEX-PuL；总共 80 μl）在 95°C 下用于2 分钟，然后冷却至 25°C。使用生成的复合体进行第一轮选择。

在每一过程中的反应的图3. PAGE分析。一个。期间连接寡核苷酸P rocedures A和B.乙。在热循环的数目的优化P rocedures A和10进行反应B.微升溶液。Ç 。所述的结扎BSA中和I处理的A-B-DNA片段P rocedure D. d 。在热循环的数目的优化P rocedure E.将反应物在10执行微升溶液。

数据分析

对DNA文库中的44个克隆进行克隆，并通过Sanger测序分析序列。在主链序列中观察到14 个单碱基缺失和 19 个单碱基插入，这可能是用于构建 DNA 模板的寡核苷酸的副产物。结果，在 44 个克隆中的 19 个中保持了阅读框。随机序列中的密码子数量总结在表2 中。观察到的频率与理论频率显示出良好的一致性。
表2 。的密码子的分析在44个克隆的BC和FG环的序列

笔记

ssDNA、dsDNA 和 m RNA 文库的理论多样性计算如下：
＃在A-片段P rocedure答：1个μMoligonucle otides（75微升尺度）; 75 pmol, 4.5 × 10 13分子
＃B-片段在P rocedure B：1点μM的寡核苷酸（75微升尺度）; 75 pmol, 4.5 × 10 13分子
＃在A-片段P rocedure答：7个循环（15毫升刻度）后为43nm的dsDNA产物; 0.64 nmol, 3.9 × 10 14分子, 0.6 × 10 13多样性64 个拷贝
＃在B-片段P rocedure B：38 nM的双链DNA 7个周期（15毫升刻度）后产物; 0.57 nmol, 3.4 × 10 14分子，0.5 × 10 13多样性，64个拷贝（第一次循环仅合成互补DNA ）
＃双链DNA产物在P roced URE d：1μM的dsDNA（200微升尺度）; 200 pmol, 1.2 × 10 14分子
＃在双链DNA产物P rocedure E：4个周期（60毫升刻度），2.0纳摩尔后33 nM的双链DNA产物，1.2 × 10 15个分子，7.5 × 10 13与16份多样性
＃的mRNA产物在P rocedure ˚F ：50nM的DNA模板（11毫升规模）; 0.55纳摩尔，3.3 × 10 14分子，分集被限制P rocedure E.

致谢

这项工作是由格兰特在急救的科学研究（A）支持（一般）授权号15H02006到HM]，格兰特在急救科学研究的创新领域[授权号20H04704到GH] ，和格兰特，在- 来自日本学术振兴会的早期职业科学家援助 [授予编号 18K14332 到 TF]；以及村上浩博士的捐赠。该协议源自我们之前的研究论文（Kondo等人，2020 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Abramochkin, G. 和 Shrader, TE (1995)。亮氨酰/苯丙氨酰-tRNA-蛋白转移酶。底物识别、域结构和二级结构的过表达和表征。J Biol Chem 270(35): 20621-20628。
Arbabi Ghahroudi, M.、Desmyter, A.、Wyns, L.、Hamers, R. 和 Muyldermans, S. (1997)。从骆驼重链抗体中选择和鉴定单域抗体片段。FEBS Lett 414(3): 521-526。
Beste, G.、Schmidt, FS、Stibora, T. 和 Skerra, A. (1999)。具有指定配体特异性的小抗体样蛋白，源自脂质运载蛋白折叠。Proc Natl Acad Sci USA 96(5): 1898-1903。
Binz, HK、Stumpp, MT、Forrer, P.、Amstutz, P. 和 Plückthun, A. (2003)。设计重复蛋白：来自共有锚蛋白重复蛋白组合文库的表达良好、可溶性和稳定的蛋白质。J Mol Biol 332(2): 489-503。
Goldman, ER, Anderson, GP, Liu, JL, Delehanty, JB, Sherwood, LJ, Osborn, LE, Cummins, LB 和 Hayhurst, A. (2006)。从半合成美洲驼文库中轻松生成热稳定的抗病毒和抗毒素单域抗体。肛门化学78（24）：8245-8255。
Grabulovski, D.、Kaspar, M. 和 Neri, D. (2007)。一种具有肿瘤血管靶向特性的新型非免疫原性 Fyn SH3 衍生结合蛋白。J Biol Chem 282(5): 3196-3204。
Ishizawa, T.、Kawakami, T.、Reid, PC 和 Murakami, H.（2013 年）。TRAP展示：一种用于产生功能性多肽的高速选择方法。J Am Chem Soc 135(14): 5433-5440。
川上，T.，石泽，T.，藤野，T.，里德，PC，须贺，H和村上，H.（2013）。在体外通过遗传密码的重编程创建的多个库的选择，以发现大环肽拮抗活性VEGFR2活细胞中。ACS化学生物。8（6）：1205至1214年。
小出，A.，贝利，CW，黄，X。和小出，S。（1998）。纤连蛋白III型结构域作为用于新结合proteins1的支架。分子生物学杂志284（4）：1141-1151。
小出，A.，Wojcik，J.，吉尔布雷思，RN，霍伊，RJ和小出，S。（2012）。教老脚手架新花样：使用Fn3支架的替代面单抗体构建。分子生物学杂志415（2）：393-405。
Kondo, T., Iwatani, Y., Matsuoka, K., Fujino, T., Umemoto, S., Yokomaku, Y., Ishizaki, K., Kito, S., Sezaki, T., Hayashi, G. 和村上，H.（2020 年）。捕获和中和 SARS-CoV-2 的抗体样蛋白。科学 Adv 6(42)。
Monegal, A., Ami, D., Martinelli, C., Huang, H., Aliprandi, M., Capasso, P., Francavilla, C., Ossolengo, G. 和 de Marco, A. (2009)。从原始文库中分离的单域美洲驼重组抗体的免疫学应用。Protein Eng Des Sel 22(4): 273-280。
Nemoto的，N.，宫本佐藤，E.，Husimi，Y。和柳川，H。（1997）。体外病毒：在mRNA轴承嘌呤霉素的结合的3 '末端结束其编码的蛋白质的核糖体上的C末端的体外。FEBS大号ETT 414（2）：405-408。
Nord, K.、Gunneriusson, E.、Ringdahl, J.、Stahl, S.、Uhlen, M. 和 Nygren, PA (1997)。结合蛋白选自 α 螺旋细菌受体结构域的组合文库。Nat Biotechnol 15(8): 772-777。
Olson, CA, Liao, HI, Sun, R. 和 Roberts, RW (2008)。mRNA 显示选择高亲和力、修饰特异性磷酸化 IkappaBalpha 结合纤连蛋白。ACS 化学生物学3(8): 480-485。
奥尔森，加利福尼亚州和罗伯茨，RW (2007)。基于人纤连蛋白 III 型结构域的多样化蛋白质文库的设计、表达和稳定性。蛋白质科学16（3）：476-484。
Roberts, RW 和 Szostak, JW (1997)。用于体外选择肽和蛋白质的 RNA-肽融合。Proc Natl Acad Sci USA 94(23): 12297-12302。
Schumacher, D., Helma, J., Schneider, AFL, Leonhardt, H. 和 Hackenberger, CPR (2018)。纳米抗体：化学功能化策略和细胞内应用。Angew Chem Int Ed 57(9): 2314-2333。
Simeon, R. 和 Chen, ZL (2018)。体外工程化的非抗体蛋白质疗法。蛋白质细胞9(1)：3-14。
Virnekäs, B., Ge, L., Plückthun, A., Schneider, KC, Wellnhofer, G. 和 Moroney, SE (1994)。三核苷酸亚磷酰胺：合成用于随机诱变的混合寡核苷酸的理想试剂。核酸研究22(25)：5600-5607。
Wang, Y.、Prosen, DE、Mei, L.、Sullivan, JC、Finney, M. 和 Vander Horn, PB (2004)。一种设计 DNA 聚合酶以增强合成能力和改善体外性能的新策略。核酸研究32(3)：1197-1207。
Wojcik, J., Hantschel, O., Grebien, F., Kaupe, I., Bennett, KL, Barkinge, J., Jones, RB, Koide, A., Superti-Furga, G. 和 Koide, S. ( 2010）。Abl SH2 结构域的有效且高度特异性的 FN3 单体抑制剂。Nat Struct Mol Biol 17(4): 519-527。
Yan, J.、Li, G.、Hu, Y.、Ou, W. 和 Wan, Y.（2014 年）。构建用于诊断应用的具有由三核苷酸盒随机化的 CDR3 区域的合成噬菌体展示纳米抗体文库。J Transl Med 12：343。
Zemlin, M., Klinger, M., Link, J., Zemlin, C., Bauer, K., Engler, JA, Schroeder, HW 和 Kirkham, PM (2003)。表达的相同长度的鼠和人 CDR-H3 间隔表现出不同的库，它们的氨基酸组成和预测的结构范围不同。J Mol Biol 334（4）：733-749。
版权所有 © 20 2 1作者；独家被许可人 Bio-protocol LLC。1