材料和试剂

20 - ml 玻璃闪烁瓶（Electron Microscopy Sciences，目录号：72632）
50 - ml Falcon 管（Thermo Fisher Scientific，Corning，目录号：14-432-22）
的0.5M Ë thylenediaminetetraacetic一个CID（EDTA）溶液（pH 8.0）（赛默飞世尔科技，费舍尔BioReagents公司TM ，目录号：BP2482-500）
1 M Tris-HCl溶液（pH 8.0）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AAJ22638AP）
16% 多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：RT15710）（在 4°C 下储存）
1 -乙基- 3 - （3 -二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）（在-20℃下存储与一个氮气密封）
200标准乙醇（赛默飞世尔科技，费舍尔BioReagents公司TM ，目录号：64-17-5）（以存储一个易燃柜）
去离子甲酰胺（Millipore Sigma，目录号：S4117）（在4°C下储存）
Denhardt 的解决方案 (50×）（Millipore Sigma，目录号：D2532）（储存在-20 °C）
硫酸葡聚糖钠盐（Millipore Sigma，目录号：67578）（在4 °C下储存）
Histoclear II（VWR，Electron Microscopy Sciences，目录号：101412-878）
NaCl（Millipore Sigma，目录号：NIST975A）
石蜡颗粒（Electron Microscopy Sciences，Paraplast X-tra，目录号：19214）
盐水 - 柠檬酸钠（SSC）缓冲液（20 × ）（Thermo Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP1325）
磷酸钠（Millipore Sigma，目录号：324283）
tRNA（Millipore Sigma，目录号：R1753）（储存在-20°C）
乙醇梯度溶液（见配方）
PHEM 缓冲液(2 × ) （见配方）
固定缓冲液（见配方）
酶溶液（见配方）
甘氨酸溶液（见配方）
TE 缓冲液（见配方）
TE-蛋白酶溶液（见配方）
硫酸葡聚糖溶液（50%）（见配方）
高丰度的 sRNA （见食谱）
杂交盐（见配方）
杂交缓冲液（见配方）
TBS 缓冲液（pH 7.5）（见配方）
tRNA 溶液（100 毫克/毫升）（见食谱）
缓冲液 C （见配方）
EDC 缓冲液（见配方）
EDC 解决方案（见配方）

设备

DH40iL培养皿incubat离子系统（华纳仪器，型号：640388）
解剖显微镜（蔡司 M2BIO 解剖显微镜）
平底ed容器s （耐热玻璃储存，6 杯-1.5 升）
Fluigent Aria 灌注（Fluigent，部件编号：CB_SY_AR_1）
镊子（电子显微镜科学，目录号：72997-20）
玻璃染色皿（电子显微镜科学，目录号：71426-DL）
格雷斯生物实验室HybriSlip杂交盖小号（Millipore公司Sigma，目录号：726024）
加热培养箱（Fisher Scientific Isotemp 培养箱）
热b锁1.5 -毫升管（BioExpress，迷你干澡，型号：AS-BSH200-471）
杂交炉（UVP HB-1000 杂交仪，型号：95-0030-01）
Masterflex C/L 蠕动泵 (60 RPM)（Cole-Parmer 仪器，型号：77120-62）
石蜡切片机（Microm，型号：MRK0403643）
Parafilm（Thermo Fisher Scientific，Bemis TM ，目录号：PM998）
保鲜膜（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand TM Clear Plastic Wrap，目录号：12-640）
快速-释放磁性室25 -毫米低-剖面圆形盖玻片（华纳仪器，型号：641943）
剃刀刀片（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand TM Razor Blades，目录号：22-305654）
玻片加热器（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand TM Slide Drying Bench，目录号：11-474-470）
不锈钢-玻璃钢机架（电子显微镜科学，目录号：71426-R）
Superfrost 载玻片（Thermo Fisher Scientific，Fisherbrand TM Tissue Path Superfrost TM Plus Gold Slides，目录号：15-188-48）
组织包埋和处理盒（电子显微镜科学，目录号：70070）
真空钟罩（Jelo Tech，型号：F42400-2221，带 Nisshin 真空计，型号：B53595）
真空泵（韦尔奇，型号：K48ZZMEM31）
ValveLink8.2 灌注系统（AutoMate Scientific，加州伯克利）
水彩画笔 (#0)
宽光谱带 600 ± 100 nm Gold Fiducials coverglass (600-100AuF; Hestzig LLC, Leesburg, VA)
单-分子定位显微镜：蔡司Elyra PS.1超分辨率显微镜（Carl Zeiss，Lberkochen，德国）或安道尔蜻蜓（牛津仪器，阿宾登，英国）。

软件

ImageJ ThunderSTORM ( https://zitmen.github.io/thunderstorm/ ) ( Ovesny et al. , 2014)。
毕加索（https://github.com/jungmannlab/picasso）（Schnitzbauer等人，2017）。

程序

样品制备
解剖的使用具有钳子和刀片在解剖显微镜的样品。对于细胞培养可以省略此步骤。
制备的固定缓冲器立即之前到dissecti上。放置在在固定缓冲液的足够量的切割样品在20 -毫升玻璃闪烁瓶中在室温。固定剂需要的体积小号是样品的至少15倍的体积。
对于植物样品，真空-渗透的样品（不含所述瓶盖）在真空钟罩15分钟，0.1毫帕。重复此步骤，至少3次，直到所述样品完全沉到固定缓冲液的底部。
存储在4℃过夜固定的样品°的固定缓冲液C。样品可以贮存于4℃下在固定缓冲液为至多一个嵌入前一周。
通过孵育洗掉固定缓冲液的样品在PBS（1 × ）缓冲液3次对每20分钟。
脱水的样品通过在孵育的乙醇系列的25％，50％，75％和100％为30分钟的每个。
将样品在 75% 乙醇/25% histoclear、50% 乙醇/50% histoclear和25% 乙醇/75% histoclear 溶液中孵育1 小时。
洗样品3次，在100％histoclear为每1个小时。
将 5 ml 新鲜的 histoclear 添加到样品中，然后添加 paraplast 以填充罐子。在 58°C 下孵育过夜。
第二天，添加新鲜的 paraplast 以填充罐子。重复此步骤，每一个小时未直到融化的蜡填满了瓶子里。
每 3 小时用刚融化的蜡清洗样品。重复此步骤 3 次。
将石蜡包埋的样品以正确的方向转移到处理盒中进行切片。
在室温下冷却样品。将嵌入的样品储存在 4°C。样品可以保存长达 6 个月。
部分的样品用石蜡切片。在S uggested部厚度是6 - 10微米。
使用画笔将 1-2 部分小心地转移到金色基准标记的玻璃盖板的中心。
将盖玻片在 37°C 下放置 2 天，使样品完全干燥。

探头设计
VARNISH（原位杂交RNA 的审查和分析）探针在我们的 sRNA-PAINT 探针设计网站上自动设计，该网站位于 Donald Danforth 植物科学中心服务器：https : //wasabi.ddpsc.org/~apps/varnish/。
在“粘贴您的小 RNA 序列”字段中输入 sRNA 目标序列。输入的期望的盐的浓度和杂交温度（或使用的默认设置）。
从对接链下拉菜单中输入或选择对接链。
输入或选择链接器序列。
结果中的探头设计将通过电子邮件的链接订货发送给您。

原位杂交和洗涤
Deparaffinize的样品两次孵育在100％histoclear对于每次10分钟。
再水化的浸渍样品的在幻灯片的乙醇系列的100％，95％，80％，70％，50％，30％，10％（体积/体积），和水对于每1分钟。
将载玻片在 250 ml 蛋白酶溶液中在 37 °C 下孵育20 分钟。
中和的250毫升0.2％的甘氨酸溶液样品，在室温下20分钟。
洗的载玻片两次P中BS（1 × ）缓冲液对各2分钟。
脱水的浸渍样品的在水滑梯和乙醇系列的10％，30％，50％，70％，80％，95％，和100％对每1分钟。
浸入的在100％乙醇玻片一个附加1分钟。
将样品在 4°C 的新鲜 100% 乙醇中储存至少 4 小时。载玻片可在 4°C 下保存 1 周。
将 1 µl 250 µM 探针添加到 9 µl 水和 10 µl 甲酰胺中。在 90 °C 下加热变性3 分钟，然后立即在冰上冷却。
添加80μl的杂交缓冲液中，以在该溶液中混合小号TEP Ç 9.轻轻混合通过而不引起气泡吸移。
将 100 µl 探针混合物涂在样品载玻片上并盖上杂交膜。备选地，简单地放置在已经覆盖用石蜡膜的层的湿纸巾滑动（样品面朝下），例如使样品侧接触石蜡膜（图1 ）。在此步骤中避免气泡。

图1 。组件的所述的sRNA-PAINT杂交室

将载玻片放在潮湿的室内，并用塑料薄膜密封。一个简单的保湿室中可以通过进行在平底放置封口膜的片材上的湿纸巾的顶版的容器。
在 53 °C 下杂交过夜（或至少 16 小时）。
预热0.2 × SSC缓冲液，以同样的杂交温度在小号TEP Ç 13。
杂交后，洗涤样品两次用0.2 × SSC为每1个小时。
在室温下在 TBS (1 × ) 缓冲液中清洗样品5 分钟。
以固定杂交的探针，孵育载玻片在新鲜制备的EDC缓冲液洗涤两次，在室温下为每10分钟。
在室温下将幻灯片浸入 EDC 溶液中 1 小时 15 分钟。
在 0.2% 甘氨酸溶液中中和幻灯片 30 分钟。
洗载玻片两次在TBS（1 × ）缓冲液对各10分钟。
存储的小号在大环内酯类4 ℃下在TBS（1 × ）缓冲液，直到成像。

sRNA-PAINT成像
将一张载玻片固定在成像灌注室上，样品侧朝上（图2 ）。

图2 。组件的所述的sRNA-PAINT成像系统。A. Ş ystem的缓冲存储器和灌注。B. 多个管将灌注单元连接到成像室。C. 图像采集过程中缓冲液交换的成像室设置。

开始灌注系统和调节灌注速率，使得至少2毫升成像器溶液中20通过样品灌注-分钟成像采集时间。
在配备与 TIRFM 兼容的 63 ×或 100 ×物镜的全内部荧光显微镜 (TIRFM) 显微镜上对样品进行成像。使用100-200毫秒相机的曝光时间，并收集大约10,000 -对于每个成像股20000帧。保存在中能与生物格式打开的格式的图像。
将灌注输入切换到缓冲区 C 并洗掉成像器链。
图像中的采样下相同的条件š在小号TEP d 3来收集缓冲器控制图像。
将灌注输入切换到非特定成像器链。
图像相同的条件下的样品小号作为步骤D3以收集非特异性成像器链的控制图像。

数据分析

超分辨率成像结构（图3使用）的ImageJ的插件雷暴：开放的ImageJ 插件雷暴运行分析。调整的条件，点击“预览”，以确保作出这样的不被选择的背景检测到所有的特定点（通常是默认设置适用于大多数图像）。单击“确定” 。”这将生成一个图像文件和 .txt 文件，其中包含所有点的位置。保存图像文件和 .txt 文件。

图3 。的sRNA在24 nt的phasiRNA的-PAINT成像一个1.5 -毫米玉米花药。A. sRNA-PAINT 专门检测目标信号。Alexa Fluor 647 与成像链偶联。的sRNA-PAINT图像是在获取一个1024 × 1024像素尺寸和使用处理的雷暴ImageJ的插件。最终图像一个重新显示在一个1024 × 1024像素尺寸使用等于亮度和对比度。所有图像的比例尺 = 10 µm。B. sRNA-PAINT 实现了小 RNA 的纳米分辨率。核一用DAPI（蓝色）染色重。小RNA本地化一个示出重新作为红色/白色点。

孔定量吨通货膨胀使用的毕加索软件：一个用于详细的用户手册的毕加索软件是由所述（Schnitzbauer等人，2017）。简而言之，打开 Picasso: Localize 并选择合适的“Min. 净梯度”，让所有的检测点。运行“Localize (Identify & fit)” 。” 这将生成一个.hdf5 文件，该文件将在 Picasso: Render 中用于单元数计算。“闵。净梯度”设置Ş区分信号与背景和需求是所有的图片一致的门槛。对于 sRNA 拷贝数计算，需要从每个 sRNA 的拷贝数中减去非特异性背景结合位点（缓冲液控制、非特异性成像链，理想情况下是非特异性 VARNIH 探针）（图4 ）。在该手稿中使用的例子中，我们选择了一个80 -纳米像素大小作为所述感兴趣的区域，以在匹配性母细胞的细胞的尺寸。该平均背景检测为17.10±7.14 COP IES为的缓冲控制（图3 A，最后面板）和15.59±5.52对的非特异性成像器链（图3 A，中间面板）。在最后的计算，17.10从拷贝数中减去对于各细胞层。

图4 。孔定量牛逼使用斯尔纳-PAINT的通货膨胀的毕加索软件。A.使用Picasso 进行现场定位：Localize 功能。B.渲染和孔定量吨单位计算的数目的通货膨胀使用毕加索：渲染。黄色圆圈表示的选择的孔定量吨通货膨胀领域的孔定量如何一例吨通货膨胀步骤进行花粉母细胞。

笔记

蛋白酶处理：所述蛋白酶浓度可以根据被调节上的信号强度。通常情况下，一个20 -分钟的温育是在足以将提供浓度（130微克/毫升）。甲升onger孵育时间和一个增加的蛋白酶浓度可以如果观察低信号强度相结合。
探针浓度：通常，对于大多数 sRNA 检测，10 µM 就足够了。还可以使用 1 µM、10 µM 和 100 µM执行探针浓度系列，以确定最适合 sRNA 目标的浓度。
杂交温度：一般来说，50 - 60°C 适合大多数设计有80°C 以上 TM 的VARNISH 探针。i deal 杂交温度可以通过每个 VARNIH 探针的解链温度 (T m )来确定。
EDC 处理：EDC 处理用于将 VARNISH 探针的 5' 端连接到样品上。EDC治疗已经显示出减少VARNISH探针洗涤-断多路复用交换-PAINT期间。
成像链浓度：成像链浓度应通过实验确定。开始与周围为0.5nM浓度较低，并逐渐增加成像器链，直至良好的闪烁速率（15 -每帧30分子）达到用于每个成像帧。
成像链的选择：为每个样品选择的成像链不应非特异性干扰样品。为了测试成像器链（非- ）特异性，杂交和图像之前添加2nM的每个成像器链的样品下，将用于在相同的条件在后面的图像采集步骤。在随后的实验中只应使用不干扰样品的成像链。
灌注系统：在灌注系统的是我们已经测试是使用空气压力的Fluigent咏叹调灌注单元，所述ValveLink8.2 p erfusion小号ystem使用重力流，并且使用注射器压力的注射器泵系统。该Fluigent系统最适合多路复用斯尔纳-PAINT，但它是昂贵的。注射泵系统方便和成本有效的，并且是开始单元1-2成像器链的理想。

食谱

乙醇梯度溶液
要生成 10%、30%、50%、70%、80%、95% 和 100% 乙醇系列，请混合 50 ml、150 ml、250 ml、350 ml、400 ml 、475 ml 和 500 ml 乙醇并用纳米纯水定容至 500 ml。
PHEM 缓冲液(2 × )
将18.14 g PIPES、6.5 g HEPES、3.8 g EGTA 和 0.99 g MgSO 4 添加到 400 ml 水中，并使其最终体积为 500 ml。最终浓度的各成分为：60mM的PIPES，5mM的HEPES，10mM的EGTA，2mM的硫酸镁4 ，pH为8。
高压釜中，存储了在4℃下溶液。
固定缓冲液
甲DD10毫升16％多聚甲醛和20ml的2- × PHEM缓冲到一个50 -毫升管。
加水至 50 毫升。此步骤应在通风橱中进行。使用前立即准备。
酶液
D将 0.5 g 蛋白酶溶解在 10 ml 水中。
在 37 °C 下预消化溶液4 小时。在F伊纳勒库存浓度为50毫克/毫升。
在 -20°C 下储存 650 - µl 等分试样。
甘氨酸溶液
将5 ml 10% (w/v) 甘氨酸溶液加入 245 ml PBS 缓冲液 (1 × )。在F的甘氨酸溶液伊纳勒浓度为0.2％（W / V）。
过滤消毒并保存了在4℃下溶液。
TE缓冲液
将100 ml 100 mM Tris-HCl 和 100 ml 10 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) 添加到 800 ml 水中。在室温下储存。
TE-蛋白酶溶液
将650 µl 酶溶液添加到 250 ml TE 缓冲液中。加热至 37°C。使用前立即准备。
硫酸葡聚糖溶液 (50%)
将5 克硫酸葡聚糖加入 7 毫升水中。
使用 80°C 加热溶解硫酸葡聚糖。
带来最多至10ml水。
分装至 2.5 ml 并储存在 -20°C。
高丰度sRNA
高度丰富的sRNA与一个特定定位模式可以用来作为阳性对照。例如，在我们之前的实验中，miR2275 已被用作玉米花药中 sRNA-PAINT的阳性对照，因为它在减数分裂期间的高丰度和在减数分裂花药的绒毡层细胞层中的特异性积累。
杂交盐
将1.75 g NaCl 和 164 mg 单磷酸钠加入 1 ml Tris-HCl (pH 8.0) 和 1 ml 0.5 M EDTA。
加水至 10 毫升。
在 -20°C 下储存 1.25 - ml 等分试样。
杂交缓冲液
将1.25 ml 杂交盐、5 ml 去离子甲酰胺、2.5 ml 50% 硫酸葡聚糖、250 μl 50 × Denhardt 溶液和 125 μl tRNA 溶液添加到 875 μl 水中。
过滤灭菌并在 -20°C 下储存 1 - ml 等分试样。
TBS 缓冲液（pH 7.5）
将100 ml 500 mM Tris-HCl 和 30 ml 5 M NaCl 添加到水中。
最多 1 L。
TBS 在 4°C 下可稳定保存 3 个月。
tRNA 溶液（100 毫克/毫升）
将1 g tRNA 添加到 1 ml 水中。混合并储存在 -20°C。
缓冲液 C
添加100 ml 5 M NaCl 到 900 ml PBS 缓冲液 (1 × )。
EDC缓冲器
甲DD400μl的1 -甲基咪唑，112.5微升12M的HCl，和2.4毫升5 M氯化钠至30毫升水中。
带来了至40ml水。
使用前立即准备。
EDC解决方案
将0.31 g EDC 添加到 40 ml EDC 缓冲液中。

致谢

该项目由美国国家科学基金会植物基因组研究计划资助（奖励1649424，1611853 ，和1754097 ）。我们感谢在了迈尔斯和卡普兰实验室的成员的支持，和Joanna Friesner为编辑协助。我们感谢弗吉尼亚·沃尔伯特（斯坦福大学），并在她的实验室的供应玉米材料和花药小RNA有益的讨论成员。我们感谢拉尔夫·容曼教授为他的DNA-PAINT，Q漆的支持，以及分析使用毕加索。显微镜设备与共享仪器补助金（S10 OD016361）和访问获得由美国国立卫生研究院NIGMS（P20 GM103446），美国国家科学基金会（IIA-1301765）的支持，和特拉华州。最初的研究论文是开发编斯尔纳-PAINT发表在核酸研究：doi.org/10.1093/nar/gkaa623。

利益争夺

没有竞争的利益。

参考

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