材料和试剂

Fisherbrand 显微镜盖玻璃，12 mm （Fisher Scientific，目录号：12-545-80 ）
Fisherbrand显微镜盖玻片22 × 60-1 （Fisher Scientific，目录号：205450J ）
24 -孔细胞培养板组织培养处理（Costar公司，目录号：3526 ）
疏水笔
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：22-037-246 ）
腔体载玻片（Tek Chamber Slide w/ Cover glass Slide无菌；Thermo Fisher，目录号：178599）
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（Sigma - Aldrich，目录号：P6407 ）
正常驴血清（NDS）（Jackson Immuno ，目录号：017-000-121 ）
Thermo Scientific Nalgene 笔记本电脑冷却器 (-20°C）（Fisher Scientific，目录号：5115-0012 ）
Triton X-100 （Fisher Scientific，目录号：BP151-100 ）
兔抗LRRK2磷酸-S1292 [MJFR-19-79] （Abcam，目录号：Ab203181 ）
小鼠抗 LRRK2/Dardin Clone N241A/34 （UC Davis [ Antibodies Inc. ] ，目录号：75-253 ）
Anti-Mouse Minus （Sigma - Aldrich ，目录号：DUO92004-100RXN ）
Anti-Rabbit Plus （Sigma - Aldrich ，目录号：DUO92002-100RXN ）
检测试剂橙色（Sigma - Aldrich ，目录号：DUO92007-100RXN ）
Duolink 洗涤缓冲液 A 和洗涤缓冲液 B （Sigma - Aldrich ，目录号：DUO82049-4L ）
16％多聚甲醛（10米升）（Fisher Scientific公司，目录号：50-980-487 ）
聚乙烯醇（PVA）（Sigma - Aldrich，目录号：P8136 ）
甘油（Sigma - Aldrich，目录号：G9012 ）
叠氮化钠，结晶（Fisher Scientific，目录号：S277-100 ）
苏丹黑 B （Sigma - Aldrich，目录号：199664 ）
Histoclear（由 National Diagnostics 制造）（Fisher Scientific，目录号：HS200 ）
绵羊抗酪氨酸羟化酶（Millipore，目录号：Ab1542）
NDS （见食谱）
1× PBS （见食谱）
洗涤缓冲液 A 和洗涤缓冲液 B （见配方）
细胞封闭液（见配方）
大鼠脑组织封闭液（见配方）
人脑组织封闭液（见配方）
Gelvatol 封固剂（见配方）

设备

移液器（范围从 1 µl到 1,000 µl ）
37°C , 5% CO 2细胞培养箱
轨道小号haker在室温（用于固定，透化，和洗涤）
轨道小号haker在4℃下（对于初级抗体孵育过夜）
带防滑橡胶垫的Incu-shaker TM Mini（Benchmark Scientific，目录号：H1001-M）
注意：您可以在 37 °C 下使用任何其他腐殖化培养箱。
奥林巴斯BX61共聚焦万分之一应付（或ny的共焦显微镜）

软件

该分析使用了 Olympus Fluoview 1000 软件；但是，也可以使用任何其他适用于图像分析的软件。
尼康元素，ImageJ
GraphPad棱镜

程序

第一部分：固定细胞中的PLA LRRK2

细胞Ç ulture和小号eeding
种子100000 HEK293细胞以1米升补充有10％FBS的DMEM培养基到涂有聚12mm的盖玻片d在24孔板赖氨酸。将板置于 37°C + 5% CO 2细胞培养箱中过夜。
注意：在固定时，细胞应在 70-80% 左右汇合以获得最佳结果。该测定也可以在腔室载玻片中进行（Tek Chamber Slide w/ Cover glass slide无菌，Thermo Fisher，目录号：178599）。卷需要以相应地调整为TH EY比盖玻片较小（E .G 。，100微升每孔溶液和25微升的每个反应PLA溶液）。

细胞固定，通透，并且主要抗体孵育
24 小时后，取出培养基并将细胞固定在 4% 多聚甲醛中，在室温下轻轻搅拌 20 分钟。
注：ü瑟325微升溶液每孔。
洗固定的细胞3 × 1 10分钟× PBS（约1米升/孔）。
用细胞封闭液（0.02% Triton X-100 + 10% NDS 在 1 × PBS 中制备）渗透细胞，在室温下温和搅拌孵育 1 小时。
注：ü瑟325微升溶液每孔。
洗的固定和透化的细胞3 × 1 10分钟× PBS（约1米升/孔）。
在 1 × PBS中的 10% NDS 中稀释一抗，并在 4°C 温和搅拌下孵育过夜。
注意：每孔使用325 µl溶液。
1:1,000 兔抗 LRRK2 磷酸 S1292 。
1:1,000 鼠标nti-LRRK2/Dardin Clone N241A/34 。

解放军
注意：在使用前让 PLA 洗涤缓冲液 A 和 B 达到室温，因为冷洗涤缓冲液会导致扩散非特异性背景信号。每个盖玻片代表一个反应，每个反应使用45 µl溶液。由于样品不能变干，因此需要足够的溶液来完全覆盖盖玻片。如果需要，调整音量。以下计算仅针对一种反应。
洗涤细胞3 × 10在1分钟× PBS轻轻搅拌（大约1米升/孔）。
第 1 步：探针
注意：制备探针溶液并在加入细胞前在室温下静置 20分钟。
拌9微升PLA MINUS探针（1：5稀释），9微升PLA PLUS探头（1：5稀释），和27微升抗体稀释，并添加45微升搜索解决方案的直接在盖玻片的前n 。
在盖玻片中加入 1 滴 PLA Bloc king Solution。
在 37°C 加湿培养箱中孵育 1 小时。
洗2 × 5分钟，在洗涤缓冲液A（大约为1米升温和搅拌/孔）。
第 2 步：结扎
注意：在冰上解冻 5 × Ligation Buffer ；将 40 × Ligase留在 -20°C 的冷冻块中，仅在将其添加到 1 × Ligation Solution时移除。
彻底涡旋 5 × Ligatio n Buffer t 。
使1 ×通过混合9微升5连接溶液× （：5稀释）和34.9连接缓冲液μ升Milli-Q水中。
在洗涤缓冲液 A 中进行第二次洗涤后，将 1.1 µl Ligase（1:40 稀释）添加到 1 × Ligation Solution。在盖玻片上直接加入 45 µl 连接溶液。
在 37°C 加湿培养箱中孵育 45 分钟。
在洗涤缓冲液 A（约 1 ml/孔）中轻轻搅拌洗涤 2 × 2 分钟。
第 3 步：放大
注意：在冰上解冻 5 × Amplification Buffer ；将 80 ×聚合酶留在 -20°C 的冷冻块中，仅在将其添加到 1 ×扩增溶液时移除。从这一点开始，必须保护板免受光照。
彻底涡旋 5 ×扩增缓冲液。
使1 ×通过混合9微升扩增溶液的5 × （：5稀释）和35.4微升Milli-Q水扩增橙缓冲区。
在洗涤缓冲液 A 中进行第二次洗涤后，将 0.6 µl 聚合酶（1:80 稀释）添加到 1 ×扩增溶液中。在盖玻片上直接加入 45 µl 扩增溶液。
在 37°C 加湿培养箱中孵育 100 分钟。
洗2 × 10分钟，洗涤缓冲液B（大约为1米升温和搅拌/孔）。

成像准备
在室温下轻轻搅拌在 DAPI 中孵育细胞（在 1 × PBS 中以1:5,000 稀释）1 分钟。
在 1 × PBS 中洗涤 3 × 10 分钟。
安装使用15微升GELVATOL安装中介在正电荷防脱显微镜载玻片盖玻片微米每盖玻片。
注意：有关如何制作 Gelvatol 封固剂，请参阅“食谱”。
一旦封固盖玻片，在幻灯片卷，冷藏的地方，并让GELVATOL安装中介庵干燥24-48小时。
完成检测后几天内的图像。
注：PLA 荧光信号随时间衰减。

成像和分析（图 2A- 2 E）
1.使用 Olympus BX61 共聚焦显微镜或任何可用的共聚焦和/或荧光显微镜获取 60倍或 100倍放大倍率的图像。
为确保检测到的信号高于背景荧光，请在阴性对照（即LRRK2 敲除细胞系、用 LRRK2 激酶抑制剂处理的细胞、LRRK2 敲除细胞或初级删除）上设置成像参数（激光功率、曝光和针孔）。对于定量比较，保持所有组的所有成像参数不变。
每个盖玻片拍摄多张图像。
通过在单个场中每个细胞的感兴趣区域进行荧光测量来分析图像。
Ñ OTE ：根据所述信号图案，无论是荧光强度，每单元的点的数目，或细胞核可能是适当的定量。
对于每个独立的生物实验，每个实验组有两个技术重复。这有助于控制测定的可靠性和可变性。使用至少三到四个独立的生物学重复。

图2 。CRISPR/Cas9 基因组编辑的 HEK293 细胞中的 PLA LRRK2 检测验证。（一）。PLA LRRK2测定表示通过测量autophosphor的磷酸化激酶活化ylation站点，S1292（红色），和LRRK2底物磷酸化Rab10（绿色）。在野生型 HEK293 细胞（顶行）中，pS1292:LRRK2 和 pTh73-Rab10 信号非常少，表明基线激酶活性较低。在 HEK G2019S/G2019S细胞（中间行）中，PL pS1292:LRRK2 和 pThr73-Rab10 都存在强信号。在 LRRK2 敲除细胞（底行）中，PL pS1292:LRRK2 和 pThr73-Rab10 的信号都非常少。比例尺 5 µM。（乙）。PL pS1292的定量：在野生型LRRK2信号，G2019S ，和LRRK2的敲除细胞。结果反映了三个单独的实验。使用事后 Bonferroni 校正的 ANOVA 统计测试。（三）。在野生型pTh73-Rab10信号的定量，G2019S ，和LRRK2的敲除细胞。结果反映了三个单独的实验。使用事后 Bonferroni 校正进行 ANOVA 的统计测试。（四）。LRRK2 激酶抑制剂 GNE-7915 的剂量反应曲线由 PL pS1292:LRRK2（实心圆圈）和 pThr73-Rab10（空心圆圈）评估。HEK G2019S / G2019S细胞在培养的不同浓度的GNE-7915的存在下进行24 ħ 。结果来自三个实验。符号代表平均值± SEM 。IC 50个值来计算与所述的GraphPad PRISM小号oftware。(E)通过 PL pS1292:LRRK2（实心圆圈）和 pThr73-Rab10（空心圆圈）信号评估的 LRRK2 激酶抑制剂 MLi-2 的剂量反应曲线。HEK G2019S / G2019S细胞在培养中各种浓度的MLI-2的存在下24 ħ 。结果来自三个实验。符号代表平均值± SEM。Ç 50个值来计算与所述的GraphPad PRISM小号oftware。

第二部分：大鼠脑组织切片中的 LRRK2 PLA
注意：步骤A 1- A7在自由浮动、PFA 固定的大脑切片（35 µm 厚）中完成。避免过度固定很重要。每个成年雄性Lewis大鼠灌注用250米升，接着150的PBS米升4％PFA的。大脑被提取并在4℃下在4％PFA浸没另外24小时并且然后被存储在30％蔗糖。˚F REE浮动部分的35微米厚的岬使用切片机收集和储存在-20℃的冷冻保护剂，直到使用。切片在 12 孔板中与每孔1 ml溶液一起孵育；2-3脑切片的每个动物使用。

神经元标记物的一抗孵育和二抗孵育
在 1 × PBS 中洗涤切片 6 × 10 分钟。
在室温下轻轻搅拌，在大鼠脑组织（10% NDS + 1% Triton X-100 在 1 × PBS 中）的封闭溶液中透化脑切片1 小时。
在室温下用1 × PBS 轻轻搅拌洗涤脑切片 3 × 10 分钟。
在 1 × PBS 中由 10% NDS组成的神经元标记一抗溶液中孵育大脑切片，4°C 下轻轻搅拌 48 小时。
注意：如果评估多巴胺能神经元，请以 1:2,000 的比例使用羊抗酪氨酸羟化酶。
在神经元标记一抗后，在室温下用1 × PBS 3 × 10 分钟轻轻搅拌洗涤切片。
在室温下以 1:500 在二级抗体中孵育 1 小时，轻轻搅拌。
注意：从现在开始，切片必须避光。
在 1 × PBS 中以 3 × 10 分钟清洗脑切片。

PLA一抗孵育
将脑切片在PLA 一抗溶液中孵育24 小时，该溶液由 10% NDS 和 1 × PBS 组成，在 4°C 下轻轻搅拌过夜。
1:500 兔抗 LRRK2 磷酸 S1292 。
1:500 小鼠抗 LRRK2/Dardin 克隆 N241A/34 。
后PLA第一抗体温育后，洗涤胸罩在第3 × 10分钟，1 × PBS中。
洗涤后，将每个大脑切片安装在S uperfrost Plus 显微镜载玻片上并晾干 15-20 分钟；然后，用疏水笔在切片周围圈出区域（视频 1）。

视频 1. 如何在大鼠组织切片中执行 PLA LRRK2 的关键步骤。这段简短的视频提供了有关如何处理 PLA LRRK2 大鼠组织切片的视觉指南。第 1 部分展示了如何使用疏水性“PAP”笔在组织切片周围绘制疏水性屏障。第2部分演示如何删除解决方案小号从组织切片而不损坏。第 3 部分显示 PLA 溶液应直接添加到该部分的顶部，以避免变干。

解放军
注意：在使用前让 PLA 洗涤缓冲液 A 和 B 达到室温，因为冷洗涤缓冲液会导致扩散非特异性背景信号。用疏水笔圈出的每个大脑部分是一个反应，每个反应使用40 µl溶液，因为这个体积足以完全覆盖每个部分。不要让切片变干。如果此音量不足以覆盖该部分，请适当增加音量。以下计算仅针对一种反应。

第 1 步：探针
注意：制作探针溶液并在添加到大脑部分之前在室温下静置 20分钟。
混合8微升PLA MINUS探针（1：5稀释），8微升PLA PLUS探头（1：5稀释），并且将24μl抗体稀释液，并直接在每个脑部分的顶部添加40微升探针溶液。
将 1 滴 PLA Blocking Solution 添加到大脑部分。
在 37°C 加湿培养箱中孵育 1 小时。
在洗涤缓冲液 A 中洗涤 2 × 5 分钟（大约 50 µl /部分）。
第 2 步：结扎
注意：在冰上解冻 5 × Ligation Buffer ；将 40 × Ligase留在 -20°C 的冷冻块中，仅在将其添加到 1 × Ligation Solution时将其移除。
彻底涡旋 5 × Ligation Buffer。
使1 ×通过混合8μ连接溶液升的5 × （：5稀释）和31微升Milli-Q水连接缓冲液。
在洗涤缓冲液 A 中进行第二次洗涤后，将 1 µl Ligase（1:40 稀释）添加到 1 × Ligation Solution。在每个大脑部分的顶部直接添加 40 µl 的结扎溶液（视频 1）。
在 37°C 加湿培养箱中孵育 45 分钟。
在洗涤缓冲液 A 中洗涤 2 × 2 分钟（至少 50 µl/切片）。
第 3 步：放大
注意：在冰上解冻 5 × Amplification Buffer ；将 80 ×聚合酶留在 -20°C 的冷冻块中，仅在将其添加到 1 ×扩增溶液时移除。
彻底涡旋 5 ×扩增缓冲液。
使1 ×通过混合8微升扩增溶液的5 × （：5稀释）和31.5微升Milli-Q水扩增橙缓冲区。
在洗涤缓冲液 A 中进行第二次洗涤后，将 0.5 µl 聚合酶（1:80 稀释）添加到 1 ×扩增溶液中。在每个大脑切片的顶部直接添加 40 µl 扩增溶液。
在 37°C 加湿培养箱中孵育 100 分钟。
在洗涤缓冲液 B 中洗涤 2 × 10 分钟（至少 50 µl/切片）。
在 1 × PBS 中洗涤 1 × 10 分钟（至少 50 µl /部分）。

成像准备
将 15 µl gelvatol 封固剂添加到每个脑部，并用Fisherbrand 显微镜盖玻片、12 mm或任何适合样品的盖玻片盖住。
注意：使用您的样本量所需的 gelvatol 封固剂量。
盖玻片安装好后，放入幻灯片中，冷藏，让 gelvatol 安装介质干燥 24-48 小时。
完成检测后几天内的图像。
注意：PL 荧光气味信号会随着时间的推移而减弱。

成像和分析（图 3A-D）
1.使用 Olympus BX61 共聚焦显微镜或任何可用的共聚焦和/或荧光显微镜以 60倍或 100倍放大率拍摄图像。
为确保检测到的信号高于背景荧光，请在阴性对照（即LRRK2 KO 动物、用 LRRK2 激酶抑制剂治疗的动物或初级删除）上设置成像参数（激光功率、曝光和针孔）。对于定量比较，保持所有组的所有成像参数不变。
每个大脑部分拍摄多张图像。
2.通过在单个视野中每个细胞的感兴趣区域进行荧光测量来分析图像（根据信号模式，荧光强度或每个细胞或细胞核的点数可能适合定量）。

第三部分：人脑组织切片中的 PLA LRRK2
注意：我们从匹兹堡大学的脑库接收组织。这些切片是嵌入在显微镜载玻片上的石蜡。

脱蜡和苏丹黑
将含有人体组织切片的载玻片放入塑料载玻片架或科普林罐中。
按照以下步骤对人脑组织进行脱蜡。
将组织在 60°C 下孵育 30 分钟。
注：我f用一个玻璃罐子科普林，你必须逐步采用这样的玻璃瓶做了之前热罐子ñ Ø牛逼粉碎。
在 Histoclear 中孵育组织 3 × 4 分钟。
在 100% 乙醇中孵育组织 2 × 4 分钟。
在 95% 乙醇中孵育组织 2 × 4 分钟。
在 70% 乙醇中孵育组织 2 × 4 分钟。
在 Milli-Q 水中孵育组织 5 分钟。
为了淬灭人体组织切片中的自发荧光，在室温下在苏丹黑中孵育组织 5 分钟。
在 Milli-Q 水中清洗幻灯片 3 分钟。
用疏水笔在载玻片上的组织切片周围圈出区域。

神经元标记物的一抗孵育和二抗孵育
对人脑组织 (10% NDS + 0.3% Triton X-100 在 1 × PBS) 中的脑组织切片进行渗透和阻断1 小时。
在室温下在 1 × PBS 中清洗脑切片3 × 10 分钟。
孵育大脑切片中的神经元标记物的第一抗体溶液，在10个％NDS由在1 ×在4℃下PBS 48小时。
注意：如果评估多巴胺能神经元，请以 1:2,000的比例使用羊抗酪氨酸羟化酶。
后神经元标记的第一抗体，洗涤切片在1 × PBS中进行3 ×在室温下温和搅拌10分钟。
在室温下以 1:500 在二抗中孵育 1 小时，轻轻搅拌。
注意：从现在开始，切片必须避光。
在 1 × PBS 中清洗脑切片3 × 10 分钟。

PLA一抗孵育
在PLA 一抗溶液中孵育大脑切片，该溶液由 1 × PBS中的 10% NDS 组成，4°C 下 48 小时。
1:500 兔抗 LRRK2 磷酸 S1292 。
1:500 小鼠抗 LRRK2/Dardin 克隆 N241A/34 。

解放军
注意：在使用前让 PLA 洗涤缓冲液 A 和 B 达到室温，因为冷洗涤缓冲液会导致扩散非特异性背景信号。用疏水笔圈出的每个大脑切片是一个反应，每个反应使用60 µl溶液。由于这个体积足以完全覆盖每个部分。如果此音量不足以覆盖该部分，请适当增加音量。样品不得变干。以下计算仅针对一种反应。

PLA 一抗孵育后，在 1 × PBS 中洗涤脑切片3 × 10 分钟。
第 1 步：探针
注意：制作探针溶液并在添加到大脑切片之前在室温下静置 20分钟。
混合12微升PLA MINUS探针（1：5稀释），12微升PLA PLUS探头（1：5稀释），和36微升抗体稀释，并添加60微升探针搜索解决方案的Ñ直接在每个脑部分的顶部上。
在大脑切片中加入 1 滴 PLA Blocking Solution 。
在 37°C 加湿培养箱中孵育 1 小时。
在洗涤缓冲液 A 中洗涤 2 × 5 分钟（约 100 µl /切片）。
第 2 步：结扎
注意：在冰上解冻 5 × Ligation Buffer ；将 40 × Ligase留在 -20°C 的冷冻块中，仅在将其添加到 1 × Ligation Solution时移除。
彻底涡旋 5 × Ligati on Buffer 。
使1 ×通过混合12微升连接溶液的5 × （：5稀释）和46.5微升连接缓冲液Milli-Q水。
后所述在洗涤缓冲液第二次洗涤，加入1.5微升连接酶（1:40稀释）至1 ×连接溶液。在每个大脑部分的顶部直接添加 60 µl的结扎溶液。
在 37°C 加湿培养箱中孵育 45 分钟。
在洗涤缓冲液 A 中洗涤 2 × 2 分钟（大约 100 µl/切片）。
第 3 步：放大
注意：在冰上解冻 5 × Amplification Buffer ；将 80 ×聚合酶留在 -20°C 的冷冻块中，仅在将其添加到 1 ×扩增溶液时移除。
彻底涡旋 5 ×扩增缓冲液。
使1 ×通过混合12微升扩增溶液的5 × （：5稀释）和47.3微升的扩增橙缓冲Milli-Q水。
在洗涤缓冲液 A 中进行第二次洗涤后，将 0.8 µl聚合酶（1:80 稀释）添加到 1 ×扩增溶液中。在每个大脑切片的顶部直接添加 60 µl 扩增溶液。
在 37°C 加湿培养箱中孵育 100 分钟。
在洗涤缓冲液 B 中洗涤 2 × 10 分钟（约 100 µl/切片）
在 1 × PBS 中洗涤 1 × 10 分钟（大约 100 µl/切片）。

成像准备
30微升GELVATOL安装媒体的添加到中间各brai的Ñ部的周围滑动并盖的与所述边缘d FISHERBRAND显微镜盖玻片22 × 60或任何coversl IP适合尺寸的样品。
注意：使用您的样本量所需的 gelvatol 封固剂量。
盖玻片安装好后，放入幻灯片中，冷藏，让 gelvatol 安装介质干燥24-48 小时。
完成检测后几天内的图像。
注意：PL 荧光信号会随着时间的推移而减弱。

成像和分析（图 3E- 3 F）
1.使用 Olympus BX61 共聚焦显微镜或任何可用的共聚焦显微镜以 60倍或 100倍放大倍率拍摄图像。
为确保检测到的信号高于背景荧光，请在阴性对照（即初级删除）上设置成像参数（激光功率、曝光和针孔）。对于定量比较，保持所有组的所有成像参数不变。
每个大脑部分拍摄多张图像。
2.通过在单个字段取荧光测量中的每个单独的小区中的感兴趣区域分析图像（根据信号图案，无论是荧光强度，每单元的点的数目，或核可以适用于定量）。

图 3. 两种 PD 大鼠模型和人类 iPD 脑组织中黑质纹状体神经元中的 PLA LRRK2 检测。（一）。PL pS1292：来自媒介物和鱼藤酮处理的大鼠的黑质中的LRRK2（红色）信号。在用鱼藤酮 (2.8 mg/kg, ip) 治疗的大鼠中，与载体（顶部）相比，信号（底部）有所增加。T酪氨酸羟化酶( TH ;蓝色) 是多巴胺能神经元的标志物。比例尺：10 µm 。（乙）。pS1292:LRRK2 PL 信号在来自媒介物和鱼藤酮处理的大鼠的黑质纹状体多巴胺能神经元中的量化。符号代表个体动物。通过未配对的双尾t检验进行统计分析。（三）。PL pS1292：来自接受单侧注射 AAV2-hSNCA 的大鼠黑质中的 LRRK2 信号（红色）。在过表达α-突触核蛋白的半球中，与注射的对照半球（顶部）相比，信号增加（底部）。TH（蓝色）是多巴胺能神经元的标志物。比例尺：10 µm 。（四）。来自对照和 AAV2-hSNCA 注射半球的黑质纹状体多巴胺能神经元中 pS1292:LRRK2 PL 信号的量化。符号代表来自每个半球的平均值。通过配对双尾t检验进行统计分析。(E) 。的PL pS1292：LRRK2信号（红）示出了黑质中的部分从一个健康的年龄匹配的对照人脑（顶部）和在来自个体的脑特发性帕金森氏病（IPD）（底部）。在对照大脑中，与 iPD 大脑相比，幸存的多巴胺能神经元中几乎没有 PL pS1292:LRRK2 信号。TH（蓝色）是多巴胺能神经元的标志物。比例尺：5 µm 。(F) 8 个对照大脑和 7 个 iPD 大脑中 PL pS1292:LRRK2 信号的量化。统计分析通过配对双尾牛逼-测试。

数据分析

统计分析
统计分析描述改编自我们的出版物（Di Maio等人，2018 年）。这里呈现的每个结果都来自至少三个独立的体外研究实验。对于体内鱼藤酮大鼠研究，每组分析了六个独立的生物学重复。对于体内AAV-hSNCA 大鼠研究，每组分析了独立的生物学重复。七IPD脑样品和八个年龄匹配的对照脑样品进行分析在ħ UMAN组织污渍。为了简单比较两个实验条件，使用了双尾未配对t检验。如果方差不相等，则使用 Welch 校正。当 AAV 载体被注射到大鼠大脑的一个半球，另一个半球用作对照时，使用双尾配对 t 检验。对于多个实验条件的比较，使用单向或双向方差分析，如果显着，则对多个成对比较进行整体事后校正（使用 Bonferroni 检验）。P 值小于 0.05 被认为是显着的。

注释和结论
正如所证明的，PLA LRRK2 是一种高度特异性和灵敏的检测方法，可用于定量 LRRK2 激酶活性。在这里，我们详细描述了如何在多种不同类型的标本中进行检测。我们使用 PLA 方法来放大 LRRK2（自磷酸化位点 pS1292）上的翻译后修饰。我们希望PLA LRRK2 成为一种广泛使用的方法来评估各种标本中的激酶活性，以帮助揭示 LRRK2 在健康和疾病中的作用。此外，利用 PLA研究蛋白质的翻译后修饰的想法可能对定义其他蛋白质的作用非常有益。

食谱

NDS : 按照制造商的说明制作
1 × PBS
洗涤缓冲液 A 和洗涤缓冲液 B：按照制造商的说明配制
细胞封闭液
10% NDS + 0.02% Triton X-100 1 × PBS
大鼠脑组织封闭液
10% NDS + 1% Trition X-100 1 × PBS
人脑组织封闭液
10% NDS + 0.3% Triton X-100 1 × PBS
Gelvatol 封固剂（配方由匹兹堡大学生物成像中心提供）
将 21 克 PVA 添加到 42 毫升甘油中
加入 52 毫升 Milli-Q 水
加入几粒叠氮化钠晶体
添加 106 ml Tris（0 .2 M ，pH = 8.5）
小火搅拌几小时或直到试剂溶解
以 5 , 000 × g离心15 分钟使混合物澄清
分装并储存在 4 °C
注意：此协议是一个近似值。你将不得不增加PVA在小号TEP d ，直至溶液清澈比糖蜜略少粘性。冷藏的烧杯GELVATOL安装介质在4℃过夜℃下，经过小号TEP Ë和前小号TEP ˚F ，并检查它在第二天，以确保粘度现在是糖蜜。如果是，请继续小号TEP ˚F 。如果是太粘，加少许甘油多带来的粘度降低，然后去上小号TEP ˚F 。如果没有足够的粘性，增加更多的P用热和制冷的VA几个小时之前，以要检查粘度小号TEP ˚F 。

致谢

这项工作得到了 NIH（NS100744、R21ES027470和NS095387）（JTG）的研究资助。匹兹堡大学美国帕金森病协会高级研究中心和迈克尔 J.福克斯基金会 PD 路径也提供了支持。我们要感谢 Christopher R. Bodle 博士拍摄视频。该协议和数字改编自我们的出版物LRRK2 特发性帕金森病中的激活（Di Maio等人，2018 年）。

竞争我nterests

作者声明他们没有竞争利益。

伦理

所有动物程序均按照美国国立卫生研究院的指南进行，并得到匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。

参考

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