材料和试剂

塑料制品和玻璃
培养皿，90 × 20 毫米
培养皿，90 × 15 毫米
24孔多孔板
无菌塑料猎鹰管，50 毫升
滤纸，70 毫米
Parafilm 胶带（Parafilm Pechiney PM996；125' LX 4"；www.parafilm.com）
无菌注射器过滤器 0.22 μm
无菌注射器，30 毫升
不锈钢筛
微铲
用于生根的植物培养盆（6.5 × 6.5 cm）
植物土盆（23 × 23 × 19厘米）

生物材料
1.粳稻成熟干燥种子。台中65
当前转化方法的目标栽培品种。
2.含有目的基因的二元载体
在下面的协议中，二元载体pSMAH638OX / Ubilp（13.8 KB）构建体是派生d由Gateway重组克隆技术（Invitrogen公司TM ，赛默飞世尔科技公司），携带萤火虫萤光素酶（LUC ）报告基因，所述潮霉素磷酸（hpt ) 选择基因标记、壮观霉素 (Sp)、attR1 位点、氯霉素抗性基因 (CmR)、 ccdB 基因和attR2 位点。我们使用d ZmUbi1 启动子进行 LUC 表达（Hakata等人，2010 年；Elakhdar等人，2019 年）
3.根癌农杆菌菌株 EHA101 或 EH10 5 (Hood et al ., 1993 )。

试剂和化学品
乙醇 CH 3 CH 2 OH（Sigma-Aldrich，目录号：N0640），70%（vl/v）在蒸馏水中，在室温下储存（RT ）
次氯酸钠的10％NAC升O（Sigma-Aldrich公司，目录号：105614），保存于室温
氯化钠，NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：7647-14-5），储存于室温
氢氧化钠，NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：1310-73-2），储存在室温下
Tween ® 20 EMD，（CALBIOCHEM，目录号：655205），在 RT 商店存储
蔗糖 C 12 H 22 O 11 （Wako，目录号：196-00015），储存在 RT
D-葡萄糖 C 6 H 12 O 6 （Sigma-Aldrich，目录号：07-0680-5），储存在 RT
D-山梨糖醇 C 16 H 14 O 6 （Sigma-Aldrich，目录号：28-4770-5），储存在 RT
酪蛋白氨基酸（Sigma-Alorich，目录号：65072-00-6），在室温干燥条件下储存
L-脯氨酸（PEPTIOE，目录号：2718），储存在 RT
CHU（N6）基础盐混合物（Sigma-Aldrich，目录号：C1416-10L），储存在2-8 °C
Murashige & Skoog 基础培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M552450L），储存于 2-8 °C
CHU N6-Vitamin solution X1000（Phyto，目录号：PHT：C149），储存在2-6 °C
LB Broth，Miller（Luria-Bertani；BD Difco，目录号：244620），在 RT 商店
Bacto Peptone（BD Difco，目录号：211677），储存在 RT
细菌琼脂（Bacto Agar；BD Difco，目录号：214010），储存在 RT
2,4-二氯苯氧乙酸（Wako，目录号：040-18532），储存于室温
1-萘乙酸NAA C 10 H 7 CH 2 COOH（Wako，目录号：86-87-3），储存于室温
激动素 C 10 H 9 N 5 O（Wako，目录号：110-00331），储存在 2-10 °C
Gelrite（0.4％）（Wako，目录号：067-04035），储存在RT
羧苄青霉素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：C1389-5G），储存于2-8 °C
潮霉素 B（Wako，目录号：085-06153），储存在 -20 °C
乙酰丁香酮（Sigma-Aldrich，目录号：D134406-5G），储存在-20 °C
美罗培南（Dainippon Sumitomo Pharma，大阪，日本），- 20 °C 保存
二甲基亚砜DMSO（CH 3 ）2 SO（Wako，目录号：046-21981），室温储存
KOD-FX（TOYOBO，目录号：KFX-101），储存在 -20 °C
消毒液（见配方）
方案一
方案B
抗生素（见食谱）
羧苄青霉素（500 毫克/毫升）
潮霉素（50 毫克/毫升）
卡那霉素（50 毫克/毫升）
乙酰丁香酮 (100 毫克/毫升)
乙酰丁香酮 (10 毫克/毫升)
美罗培南 (12.5 毫克/毫升)
2,4-滴 (0.2 毫克/毫升)
NAA (0.2 毫克/毫升)
激动素 (1 毫克/毫升)
培养基（见配方；表1 ）
LB 出售的培养基
LB液体培养基
YEP培养基
笔记：
所有含有农杆菌的液体和设备都必须经过适当消毒。
可能影响转化效率的基本元素是试剂和化学品。因此，我们强烈建议遵循该方法，尤其是在开始新协议时。的使用和储存条件下的C hemicals是不同的; 因此，请务必遵循的建议，第各家公司，尤其要注意对在物质危害信息。

设备

- 86 °C超低温冰箱（SANYO，目录号：MDF-U538）
-30 °C超低温冰箱（SANYO，目录号：MDF-792AT）
MicroPluser TM (Bio-Rad, Hercules)
分光光度计（Thermo Scientific TM ，型号：NanoDrop 2000）
农杆菌培养箱/摇床 28 °C
植物生长室（SANYO）
种子杀菌摇床
层流罩（SANYO）
高压釜
pH计
Spinbar ®磁力搅拌棒（Sigma-Aldrich，目录号：Z127116）
聚碳酸酯真空干燥器（SANSYO，目录号：SPD-WVGT240）
热循环仪（Bio-Rad，型号：Tetrad 2 热循环仪（4 × 96 孔）
锁定系统温室
水稻育苗土（JA王Kumiai的土壤。AGR日本有限公司。）

程序

农杆菌培养和转化
用二元载体 pSMAH638OX/Ubilp (13.8 Kb) 构建体转化感受态农杆菌细胞（EHA101 或 EHA105）（图 3）。

图3.乙inary矢量pSMAH638OX / Ubilp（13.8 KB）构建携带荷兰国际集团的潮霉素磷酸转移酶基因（HPT），萤火虫荧光素酶报告基因（LUC），大观霉素（SP），一个attR1位点，氯霉素抗性基因（CMR），则ccdB基因attR2位，并在ZmUbi1启动子。

在冰上解冻 50 μl农杆菌感受态细胞（EHA101 或 EH105）（图 4A）。
在 1.5 ml 试管中，将 2 µl 质粒 DNA（100 微微克/µl）与感受态细胞混合。
将细胞混合物在冰上孵育 10分钟。
使用执行变换的MicroPluser TM （Bio-Rad公司）电穿孔法用“AGR”模式（图4B）。
10 分钟后，将细胞混合物移至比色皿管，然后将比色皿移至腔室载玻片。
按下 Pluse 按钮，直到发出提示音，表示已发出脉冲。
立即向细胞中加入 250 µl YEP 培养基。
将细胞转移到含有 3.75 ml YEP 培养基的 25 ml 管中（图 4C）。
翘曲管与箔和孵育2 h中的黑暗中28℃。
离心该混合物在1 ，500 - 3 ，000 ×克在5分钟RT 。
丢弃大约 3.5 ml 的上清液。
轻轻混合剩余的细胞。
用50 mg/L 潮霉素和 50 mg/L 卡那霉素修正的 LB 琼脂平板上 20-100 µl 细胞。
确保该细胞被完全干燥，然后包裹在培养皿用封口膜，并培育28℃下进行2-3天。
选择四个单菌落并通过 PCR 验证转化（图 4D）。
条纹出的阳性菌落农杆菌窝藏的兴趣以1基因菌株EHA101 ×在单个LB 4网格图案琼脂含有50mg / L潮霉素和50mg / L卡那霉素（图4E）。
在 28°C 下孵育培养物 2-3 天。

图 4.农杆菌介导的转化过程。( A )农杆菌感受态细胞。( B ) MicroPluser TM (Bio-Rad)。( C ) YEP 培养基。( DF )通过 PCR 验证的阳性转化农杆菌。( G )台中65成熟胚。( H )在 N6D 培养基上培养 23 天后的愈伤组织诱导。（一）愈伤组织感染。( J )在无菌滤纸上干燥愈伤组织。( K ) C在 2N6AS 固体培养基上培养的愈伤组织。

准备成熟胚胎
1.种子表面消毒离子
去壳健康成熟的种子，然后用剃刀手工切割。保存胚胎种子HAL VES和丢弃的胚乳种子HAL VES （图4G）。
在 50 毫升管（最多 150 个种子）中在 70% 乙醇中浸泡和搅拌一次10 秒后，对胚发生种子部分的表面进行消毒。
冲洗胚胎种子HAL VES在蒸馏水中30秒。
摇晃剧烈管（45转），用于漂白15-20分钟小号olution A，然后用蒸馏水冲洗3-5次。
洗种子与零件小号下olution乙剧烈SHAK ING 15-20分钟，接着在蒸馏水中五个漂洗至30每个时间s。
放置灭菌胚胎种子半部在无菌滤纸上在陪替氏培养皿（小号EE注3）。
2.愈伤组织诱导（3-4 周）
P artially š ubmerge 8-12消毒胚胎种子半部每个培养皿N6D愈伤组织诱导培养基中。
密封用外科胶带菜，然后包裹每五个菜用铝箔，并培育在28℃下在所述暗3-4周（小号EE注4）。
3.制备愈伤组织，土壤杆菌悬浮液，和感染（48至72小时）
一种。混合一小部分的四个菌落农杆菌在含有1个40毫升2N6D-AS液体介质中的微抹刀，重悬应变EH101 6μl的乙酰丁香酮（100毫克/毫升储液），并轻轻混合（农杆菌菌落必须被ANALY捷思通过PCR使用特异性引物š验证与细菌的gDNA的构建体）的整合（图4 ˚F ）。
湾从 N6D 培养基中丢弃棕色愈伤组织和种子胚芽鞘（在第4周开始时）。收集活性胚性愈伤组织（微黄色-白色的，相对干燥，1-3毫米直径（西村等人，200。6 ）和球状（比睿和Komari，2008）到一个50毫升的管中，在这个阶段。，将愈伤组织可以使用ð直接用于农杆菌感染（图4H）。
C。倾中制备的细菌悬浮液小号TEP B3一个在到50-ml管中。
d. 将愈伤组织浸泡在农杆菌悬浮液中，轻轻混合 90 秒（图 4I）。
e. 倒出细菌悬浮液至灭菌污点少钢筛（12目）和豪在500米LD升无菌烧杯中。
F。在放置在90 mm × 20 mm培养皿中的灭菌滤纸上吸干筛子，以去除多余的农杆菌悬浮液（图 4J）。
G。将无菌滤纸放在固体 2N6D-AS 介质上。通过滴入 0.5 ml 2N6D-AS 液体培养基使滤纸饱和，然后在滤纸上共同培养适量的愈伤组织（20-25 个愈伤组织）（图 4K）。
H。密封板用石蜡膜带和包装用铝箔，并培育在25 ℃下在黑暗中3天（小号EE注5）。
4.洗涤愈伤组织并选择转化细胞（3-4 周）
将感染的愈伤组织收集在 50 ml 无菌管中，并用无菌水冲洗 3-5 次以去除农杆菌（直至水清澈）。ģ ently š无须鳕管和倒出水。
用含有 40 μl 羧苄青霉素 500 mg/ml 原液的 40 ml 无菌水冲洗愈伤组织，以杀死农杆菌细胞。
倒入水悬浮液，将愈伤组织放在培养皿上的无菌滤纸上。ð RY愈伤组织以及（小号EE注6）。
将愈伤组织转移到 N6D-HC 选择培养基上；15 到 20 个愈伤组织可以放在一个盘子上。
密封用外科胶带的板，孵育在28愈伤组织℃下在黑暗中[根据该岐方法; 33°C（亮10小时）/30°C（暗14小时）；Saika 和 Toki ( 2010) ] 。
定期检查培养物是否受到污染。在污染的情况下，立即将未受污染的愈伤组织转移到新鲜培养基中。
传代培养淡黄-白色的愈伤组织到新鲜N2D-HC介质后10〜12天S，密封高原é s的医用胶带，并孵育在28 ℃下在所述暗。ř esistant愈伤组织（微黄色-白色）可以后20-25天（可以观察到图5A）。

图 5.愈伤组织选择和再生。( A ) N6D-HC 选择培养基上的耐潮霉素愈伤组织。一个rrow小号表明resistan牛逼后，从感染25天愈伤组织。( B )增殖的愈伤组织，带有绿点。( C )在相同的新鲜培养基上继代培养绿色盆栽。( D )生根。（E ）在 MS HF 培养基上再生的小植株。( F )移植到生长室土壤中的转基因植物。( GE )转基因植物转移到锁定系统温室直至收获。比例尺：5厘米（E ）、30厘米（F ）、30厘米（G）、30厘米（H）。

5 、水稻转基因植株的再生（3-4周）
一种。将抗性愈伤组织转移到含有合适抗生素的 REIII 再生培养基中。使用消毒镊子，将单个愈伤组织传代到 24 孔板的每个孔中。用手术胶带密封板，并在 30 °C下连续照明（图 5B）孵育。在相同条件下每10 天将转基因愈伤组织重新转移到新鲜的REIII 培养基中。转化后的枝条在3-4 周后开始分化（图 5C）。
湾将 3-4 厘米的芽转移到含有 HF 培养基和适当抗生素的植物盆中，在 28 °C下在 10 小时光照下（图 5D）。几天后，从罐的顶部取出手术胶带，然后祛瘀Ë锅凹圆R（图5E）（小号EE注7）。
C。移植转化体稻类植物到6.5厘米锅小号containin克水稻育苗土壤，以每盆植株一个，在28在生长室℃下（图5 ˚F ）。
d. 当TR ansformants 15厘米高，移植米到23 -厘米含有稻田土壤的盆中，每盆植株一个，在温室中在28 ℃下未直到收获（图5G- 5 H）。
e. 行为PCR用DNA FR ö M中的转化的水稻植物，以证实T-DNA整合到水稻植物小号（图6）。

图6.琼脂糖凝胶轮廓为验证荷兰国际集团T-DNA插入物的整合到植物基因组中。509bp LUC基因扩增子大小。M ，标记；+ ,构建 DNA ; - ，台中65 gDNA。

笔记

乙雅图琼脂溶解小号以及用高压灭菌。冷却至 50-45°C 后加入潮霉素，因为热培养基会降解抗生素。为A.癌农杆菌菌株EHA105 ，添加0.2毫升50mg / ml的潮霉素每200毫升LB培养基。对于菌株 EHA 101 ，每 200 毫升 LB 培养基添加 0.2 毫升 50毫克/毫升潮霉素和 0.2 毫升 500 毫克/毫升羧苄青霉素。
美罗培南（25毫克/升）在选择培养基中完全suppresse š的过度生长的土壤杆菌，这导致高的转化效率（小川和MII，2007）。
收获一年后的种子 -而不是在收获后立即采取种子-更可取的愈伤组织诱导。健康成熟的种子作为转化和高频愈伤组织形成的起始材料至关重要。从 40-50 粒种子（足以进行一次转化）中去除外稃和外稃（外涂层）。从种子中去除含淀粉的胚乳以减少污染。
C allus 选择是高效转化的关键点。我们经常检查文化和移除任何污染的种子立即零件与一消毒勺。在这种情况下，未污染的种子部分是传递红色至新板中。
选择四个单一的农杆菌菌落。执行PCR用标记-特异性引物小号报导基因，以确认其掺入到植物基因组。细菌悬浮液的密度应该是OD 600 = 0.2 （小泽，2012）或降低（西村等人，200。6 ），和OD 600 = 0.05 - 0.1是建议编辑。这个过程对于防止土壤杆菌过度生长很重要，这会导致愈伤组织受损。大约 150 个愈伤组织可以放在一个板上（Hiei 和 Komari，2008 年）。用封口膜密封板以防止蒸发。
共培养后清洗愈伤组织。抗性愈伤组织在表面含有小的结节状胚。一个关键的步骤是通过洗涤从愈伤组织中去除农杆菌，而不会对结节状胚胎细胞造成太大的物理损伤，因为这会阻止转基因的再生。P rior共培养，这是非常重要的，以确保选择的抗生素被删除适当所以这不会影响愈伤组织的生长。将愈伤组织放在滤纸上，让多余的水蒸发。
淬火：该转基因植株的硬化是一个关键的一步之前，他们移植的土壤。硬化可以从低到高光强度条件以及从高到低湿度缓慢进行。琼脂培养基可以通过用水冲洗轻轻地从根部去除。

食谱

消毒液
方案一
将 50 ml 10% 次氯酸钠加入50 ml dH 2 O
存储在 RT
方案B
加入50mL次氯酸钠，将50ml卫生署2 ö ，和50μl的Tween ® 20
存储在 RT

抗生素
羧苄青霉素（500 毫克/毫升）
将 5 g 羧苄青霉素粉末完全溶解在 10 ml dH 2 O 中。
通过 0.22 μm 注射器过滤器对溶液进行消毒。
以 1 ml 等分试样在 -20°C 下储存。
潮霉素（50 毫克/毫升）
将 500 毫克潮霉素 B 溶解在10 毫升 dH 2 O 中。
通过 0.22 - μm 注射器过滤器对溶液进行消毒。
以 1.5 毫升的份量在 -20°C 下储存。
卡那霉素（50 毫克/毫升）
将 500 mg 卡那霉素溶解至 10 ml。
通过 0.22 - μm 注射器过滤器对溶液进行消毒。
以 1.5 毫升的份量在 -20°C 下储存。
乙酰丁香酮 (100 毫克/毫升)
将 1 g 乙酰丁香酮溶解到 1 ml DMSO 中。
用 10 ml dH 2 O稀释。
通过 0.22 - μm 注射器过滤器对溶液进行消毒。
以 1.5-2 ml 等分试样在 -20°C 下储存。
乙酰丁香酮 (10 毫克/毫升)
将 100 mg 乙酰丁香酮溶解到 1 ml DMSO 中。
用 10 ml dH 2 O稀释。
通过 0.22 - μm 注射器过滤器对溶液进行消毒。
以 1.5-2 ml 等分试样在 -20°C 下储存。
美罗培南 (12.5 毫克/毫升)
将 12.5 g 美罗培南溶解在10 ml dH 2 O 中。
通过 0.22 - μm 注射器过滤器对溶液进行消毒。
分装 2 毫升，并在 -20°C 下储存。
2,4-滴 (0.2 毫克/毫升)
将 20 mg 2,4-D 粉末溶解在 0.5 ml DMSO 中。
调整到 100 ml dH 2 O。
储存在-20°C。
NAA (0.2 毫克/毫升)
将 20 mg NAA 完全溶解在1 ml 0.1 N 氢氧化钠溶液中。
将音量调整到 100 ml dH 2 O。
储存在-20°C。
激动素 (1 毫克/毫升)
将 10 mg 激动素溶解在0.2 ml 1 M 氢氧化钠中。
用 dH 2 O将体积调节至 10 ml 。
储存在-20 °C 。

准备培养基（Tanle 1）
培养营养成分：所有培养MEDI一个准备新鲜在1 ，000毫升卫生署2 ö ，在120高压灭菌℃下20分钟和冷却至50 - 40℃ ; 最后，它是无菌ALY distribut编到大约12 （90毫米× 20毫米）在层流罩培养皿中。倾倒的含有抗生素的培养基板可以在 4°C 下储存长达 1 个月。

表 1. 愈伤组织诱导和再生培养基成分列表

LB溶胶我d培养基（200ml）中
磅肉汤 5 克
细菌琼脂 1.5 克
高压釜（120℃为20分钟）
LB液体培养基（200毫升）
磅肉汤 5 克
高压釜（120℃为20分钟）
YEP 培养基（200 毫升）
酵母提取物 2 克
Bacto 蛋白胨 2 克
氯化钠 1 克
高压釜（120℃为20分钟）

致谢

这个工作是由格兰特在急救来自日本学术振兴科学研究（KAKENHI）（：19P19394授权号）的部分资助。我们感谢教授卡尔文O. Qualset，美国加州大学戴维斯分校，阅读手稿并提供意见和建议。该协议源自之前的出版物（Satoh-Cruz et al ., 2010 ; Fukuda et al ., 2011 and 2013; Elakhdar et al ., 2019 ）。

利益争夺

该作者宣称，他们没有利益冲突小号。

参考

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