软件

Discovery Studio Visualizer 2019 或更高版本
Discovery Studio Visualizer 是由Dassault Systemes BIOVIA开发的免费软件。一个CCESS该软件在：https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download。
琥珀色，版本 16 或更高版本
Amber 是一套用于大规模 MD 研究的生物分子模拟程序。一个CCESS琥珀在：http://ambermd.org/。

程序

DNA三螺旋的初步构建
打开 Discovery Studio Visualizer。
首先，构建具有所需序列的高嘌呤/高嘧啶 B-DNA 双螺旋。构建三螺旋模型的基本策略如图 2 所示。

图 2.三螺旋结构示意图

例如，假设我们要构建如图 3(a) 所示的并行序列。
将显示样式更改为箭头和环并关闭原子显示样式。
选择所需的链（全部为嘌呤或全部为嘧啶），然后选择复制和粘贴。如果需要移位的三重序列，则将第三条链上的残基名称更改为所需的序列。接着，复制并粘贴嘧啶链从双面打印，如图3（b）中，以获得序列图3（c）。
由于所需的三重体涉及移位序列，因此重命名残基名称以获得图 3(d)。
小心地将粘贴的链放入具有所需方向的 DNA 双链体的大沟中，如图 4和视频 1 所示。那么我们的示例序列就变成了图 3(e)。

图 3. 我们程序的示例序列。(a) 代表我们想要构建的三重。(b) 是初始双链体，我们从中获得了 (c) 中所示的链。从前一步骤中获得的移位链显示在 (d) 中。这个移位的链被放置在双链体的大沟中，如（e）所示。质子化第三链中的胞嘧啶最终导致 (a)。

图4 。将第三条链放入 DNA 双链体大沟的快照

视频1. 我们如何建立三螺旋初始模型的简短说明

粗略调整每个残基的位置，以避免残基之间出现任何重叠，如视频 1 所示。例如，当磷酸基团上的氧原子太近时，我们手动稍微移动一个氧原子的位置。
更改第三链碱基的名称以构建所需的序列。将质子化 DC 命名为 DC ，将质子化 DA命名为DA等。（RNA 相同）。稍后我们将说明如何处理质子化情况。
将显示样式改回原子/球和棒。
精确调整第三条链上的每个原子，以避免在后续 MD 运行期间发生高势能碰撞，并构建如图 5和图 6所示的氢键结构。

图5 。最终构为图4中给出的示例URE 3和通过步骤1-14建造。

图 6. DNA 三螺旋的初始氢键约束

选择编辑，选择。将属性更改为元素，然后选择氢。选择所有氢原子后，键入Del删除所有氢原子，因为有些氢原子的名称与 Amber 中的名称不同，会导致错误。
将结构另存为 PDB。
Ë DIT PDB文件，DELET荷兰国际集团所有日在PDB文件的末尾E连接关系。
如果所需序列中有质子化碱基，请将相应的残基名称 DC 更改为 DCP，将 DA 更改为 DAP。如果质子化的 C 位于 5'，则将其重命名为 D5C。如果质子化的 C 位于 3'，则将其重命名为 D3C。如果质子化的 A 位于 5'，则将其重命名为 D5A。如果质子化的 A 位于 3'，则将其重命名为 D3A等。虽然这种命名法似乎有点武断和不一致的，它是由授权的事实，tLeap（包含在琥珀色）只承认THR EE字母最多。那么我们的示例序列将是图 3(a)。配置如图 5 所示。
转到 E 部分。

DNA ·RNA:DNA杂种三螺旋的初步构建
打开Discovery Studio Visualizer 。
构建具有所需序列的高嘌呤/高嘧啶 B-DNA 或 A-DNA 双螺旋。
将显示样式更改为箭头和环并关闭原子显示样式。
重复步骤小号在部分A. 4-7
选择所需的链并将其从 DNA 更改为 RNA。这是通过选择核酸的期望的部分，然后点击“核糖”在th进行Ë选项手册“修改糖”。
重复A 部分中的第8-14步。

RNA ·DNA:DNA杂种三螺旋的初步构建
打开 Discovery Studio Visualizer。
将 MD 后稳定的 DNA 三螺旋（在我们的例子中，在 1 µs MD 模拟结束时[ Zhang et al. , 2020 ] ）加载到所需序列（其中 T 将被 U 交换，如下所述）。这种结构的可能的初始氢键模式在图7中给出。

图7 。RNA·DNA的初始氢键约束：DNA和RNA三螺旋

将终端残基（例如 DG5 ）改回 DG 以避免错误。
如果有质子化碱基，将它们改回普通碱基。
将所需部分从 DNA 更改为 RNA。
重复步骤小号在第10-12 A.
如果所需序列中有质子化碱基，请将相应的残基名称 C 更改为 CP ，将 A 更改为 AP。如果质子化的 C 位于 5'，则将其重命名为 C5P。如果质子化的 C 位于 3'，则将其重命名为 C3P。如果质子化的 A 位于 5'，则将其重命名为 A5P。如果质子化的 A 位于 3'，则将其重命名为 A3P。
转到 E 部分。

RNA三螺旋的初步构建
重复 C 部分的所有步骤。

分子动力学模拟的细节
使用tLeap在琥珀包生成拓扑文件，最初的坐标文件，并完成PDB文件。我们使用BSC1力场（Ivani等人。年，2016年），BSC0（佩雷斯等人2007年）+ OL3（Zgarbová等，2011）力场，和质子化琥珀力场（韦纳等，1986）。
使用周期性边界条件。
晶胞大小应足够大以避免最近核酸之间的自相互作用，其距离必须大于静电和范德华截止值 (9 Å)。在我们的例子中，有大约每三缸840-870个原子，而我们需要创建一个八面体箱尊重这个距离。为此，我们将核酸和框边界之间的最小距离设置为 8 Å，这导致框大小为 ~90,000 Å 3 。在此之后，TIP3P ( Jorgensen et al. , 1983) 水分子被随机添加到盒子中。（图8）

图8.我的llustration一个三缸的八面体箱

我们使用 Na +离子（Joung等人，2008 年）来中和系统。Na +的数量等于三重链中负电荷的数量。
添加氢键约束，如图6 （一些 T 被 U 替换）或图7所示。甲DD中的氢键的约束由网站的指示：https://ambermd.org/tutorials/advanced/tutorial4/index.htm。编辑：${AMBERHOME}/dat/map.DG-AMBER 如果报告了任何错误。在文件中添加一些这样的句子：
残留物C3P
映射 H3 = H3
示例氢键约束输入文件可以写成：
1 DG5 H21 18 DC3 O2 1.9 1.9
1 DG5 H1 18 DC3 N3 1.9 1.9
1 DG5 O6 18 DC3 H41 1.9 1.9
1 DG5 O6 18 DC3 N4 2.9 2.9
1 DG5 N1 18 DC3 N3 2.9 2.9
1 DG5 N2 18 DC3 O2 2.9 2.9
9 DA3 N1 10 DT5 H3 1.9 1.9
9 DA3 H61 10 DT5 O4 1.9 1.9
9 DA3 N6 10 DT5 O4 2.9 2.9
9 DA3 N1 10 DT5 N3 2.9 2.9
27 D3A H1 1 DG5 O6 1.9 1.9
27 D3A N1 1 DG5 O6 2.9 2.9
27 D3A H61 1 DG5 N7 1.9 1.9
27 D3A N6 1 DG5 N7 2.9 2.9
19 DG5 H21 10 DT5 O4 1.9 1.9
19 DG5 N2 10 DT5 O4 2.9 2.9
19 DG5 H1 10 DT5 O4 1.9 1.9
19 DG5 N1 10 DT5 O4 2.9 2.9
19 DG5 O6 9 DA3 H62 1.9 1.9
19 DG5 O6 9 DA3 N6 2.9 2.9
执行 MD 模拟以优化初始结构。设置了静电截止为9.0。将范德华截止设置为 9.0 Å。使用耦合参数为1.0 ps -1 的朗之万动力学来控制温度。使用 SHAKE 算法处理涉及氢原子的键。Šponer和 Filip ( 2006)详细解释了核酸的 MD 模拟。
最小化通过建模获得的初始构象的能量：最初，保持核酸和离子固定；然后，慢慢地（逐步）解除约束，让它们移动。
然后逐步提高从0到300°K的温度超过一个与该核酸和离子限制的1个fs的时间步长为50ps运行。
然后使用 100 ps 以恒定体积运行以逐渐降低核酸和离子的抑制谐波常数。
然后在恒压下运行 1 µs，逐步优化晶胞体积；所述Berendsen压力耦合的方法是使用一个。
MD 模拟的最终结构可用作进一步研究的初始结构。

笔记

如果三链体是稳定的（不稳定的三链体分崩离析），则从 B-DNA 和 A-DNA 初始结构建立的模型将收敛到相同的结构。给定三螺旋的双链部分介于 B-DNA 和 A-DNA 结构之间。
W¯¯母鸡改变质子化DNA残基，以一个质子化RNA残基，检查O2'原子的位置的糖环上。
如果序列是稳定的，那么在无限制的 MD 模拟之后，使用不同氢键约束建立的模型将收敛到类似的结构。最初的氢键约束只是将第三条链连接到双链部分的一种方式。
虽然我们使用 AMBER 版本。20 (Case et al., 2020) 对于我们的 MD 运行，这些也可以使用其他模拟包执行，例如 NAMD ( Nelson et al. , 1996) 。

致谢

资金由美国国立卫生研究院 (NIH) 赠款 R01GM118508 提供。这项工作背后的原始论文是 Zhang等人。(2020)。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

参考

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