材料和试剂

1. 0.22μ米孔径，PVDF无菌注射器亲水膜滤器（Merck公司，的Millex ® 33毫米PVDF 0.22μ中号无菌RUO，目录号：SLGVR33RS）
2. 15 ml Sterile Falcon n 管（Tarsons，Sterile Centrifuge Tube Conical Bottom，目录号：546021）
3. 50 ml Sterile Falcon 管（Tarsons，Sterile Centrifuge Tube Conical Bottom，目录号：546041）
4. 1.5 ml 微量离心管（Tarsons，聚丙烯 Spinwin Micro Centrifuge Tube 1.5 ml，目录号：500010）
5. 1.5 ml 微量离心管架（Scientific Research & Instruments，1.5 ml Microcentrifuge Tubes Places 24（6 × 4 Array），目录号：P20201）
6.移液器吸头（Tarsons，Micro Tips，目录号：521000、521010、521020）
7. 90 mM 一次性培养皿（Tarsons，培养皿辐射无菌 90 mm，目录号：460095）
8.硼硅酸盐玻璃边缘培养管（Borosil，18 × 150 mm带边缘培养管，目录号：9800U06）
9.沙门氏菌肠炎血清型。P125109
10.乙醇纯度≥99.5％（Himedia，目录号：MB106）
11.琼脂（Himedia，Agar Agar，I型，目录号：GRM666）
12.硫酸链霉素（Himedia，目录号：CMS220）
13.酪蛋白氨基酸（Himedia，酪蛋白酶水解物，目录号：CR014）
14.葡萄糖（Himedia，D-（+）-无水葡萄糖，目录号：MB037）
15.氯化钙2 · 2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：C3306）
16. MgSO 4 · 7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M2773）
17.胆盐（Himedia，目录号：RM009）
18. Na 2 HPO 4 · 7H 2 O（Himedia，目录号：GRM1417）
19. KH 2 PO 4 （Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.（SRL），目录号：52403）
20. NaCl（Fisher Scientific，目录号：27605）
21. NH 4 Cl（Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.（SRL），目录号：96452）
22. KCl（Fisher Scientific，目录号：19255）
23.无菌 1 M MgSO 4溶液（见配方）
24.无菌1 M CaCl 2溶液（参见配方）
25.无菌 20% 葡萄糖（见配方）
26.无菌 20% 酪蛋白氨基酸（见食谱）
27.无菌 5 × M9 盐见食谱）
28.无菌 M9 基本培养基（见配方）
29.含有 0.03% 葡萄糖的无菌 M9 基本培养基（见配方）
30.含有 20 µM MgSO 4 的无菌 M9 基本培养基（参见配方）
31. 50 mg/ml 硫酸链霉素溶液（见配方）
32.无菌 1 ×磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 缓冲液（见配方）
33. 30% 胆盐（见食谱）
34.的Luria BERTANI（LB）培养基（HIMEDIA，的Luria肉汤BERTANI，米勒，Ç atalog号：M1245）（见配方）
35. LB a gar（见食谱）

设备

Hand Tally Counter（Humboldt，目录号：H-9700）
移液器EP-2.5，EP-20，EP-200，EP-1000仪（Eppendorf，研究® 2100系列小号英格尔Ç hannel一个djustable v olume p ipettes，米Odel等：0.1-2.5微升，2-20微升，20-200 µl, 100-1 , 000 µl)
-20℃ - [R efrigerator（CelFrost，目录号码：BFS-150）和4℃ - [R efrigerator（LG，目录号码：GL-T402LPZU）
250 ml的b orosilicate克小姑娘Ç onical ˚F拉斯克与小号船员Ç APS（Borosil，圆锥形螺旋盖烧瓶容量250毫升，目录号：5021021）
500毫升和250ml b orosilicate克小姑娘ř eagent瓶（Borosil，目录号：1501024，1501021）
500毫升b orosilicate克小姑娘b埃克（Borosil，目录号码：BRL_1000D24）
耐高压加热的b埃克（Tarsons，Ç atalog号：422040）
500毫升和100ml米easuring Ç ylinder（Tarsons，目录号小号：345060，345040）
搅拌电炉
Autoclave (Osworld Scientific Equipments Pvt. Ltd, Osworld, Autoclave Vertical Top Opening Steam Sterilizer, OAT G – 125)
燃烧器
生物安全Ç abinet（Nuaire，II类生物安全柜推拉窗，米Odel等：NU-425-600S）
培养箱b acterial Ç ulture在s表吨emperature仪（Eppendorf，新不伦瑞克TM伊诺® 42r的培养箱，和冷藏振荡器，目录号：M1335-0016）
离心机仪（Eppendorf，米Odel等：5424 R）
分光光度计（Agilent Cary 60 紫外-可见光 (UV-Vis) 分光光度计）
接种吨urntable（ISOLABLaborgeräteGmbH的，目录号：6286850）
金属棒细胞扩散器（Fisher Scientific，目录号：08-769-2B）
接种环（HIMEDIA，米Odel等：LA023）

软件

GraphPad Prism v. 7.0
微软® Excel

程序

注：所有细菌的生长和存活测定，应在无菌环境中进行，里面一个II类生物安全柜。在所有实验中使用无菌微吸头、培养基、烧瓶和培养皿。
存储b acterial小号列车（小号。肠炎）
生长的沙门氏菌在营养丰富的LB培养基中的菌株于37℃和150rpm下，直到对数（LOG）-PHASE实现。
将细菌储存在 50% 的甘油中。将300 µl (log) 期培养物添加到700 µl 50% 甘油中。通过反转冷冻冷却管轻轻混合。
条纹š 。肠炎和之前剂商品及其衍生菌株纳克在LB实验一GAR板含有50微克/毫升链霉素（见配方小号）。您可以使用微针头或无菌接种环进行划线。
将带条纹的 LB 平板置于 37°C 的培养箱中过夜，培养菌株。
注意：到达特定OD可以根据培养箱，温度变化所需要的时间，和用于培养细菌菌株转。因此，有必要在进行胁迫生存分析之前确定菌株的生长曲线模式，特别是如果靶基因在胁迫过程中的作用是生长阶段依赖性的。

b菌菌株的生长曲线分析
挑单一的b从细菌LB acterial琼脂菌落用无菌200μl的微尖板[例如，S.肠炎（WT）和S.肠炎（突变体X）将作为本文中的协议的代表菌株。
在培养试管中的 5 ml 生长培养基（LB 或 M9 基本培养基）中接种细菌菌株（每个菌落一个菌落）。
在 37°C 和 150 rpm 下将菌株培养过夜(12-16) 小时。
在含有 100 ml 1:100 生长培养基的无菌锥形瓶中的隔夜细菌培养物进行亚培养（1 ml 隔夜细菌培养物在 100 ml LB 或 M9 基本培养基中）。
在 0 小时（仅在传代培养时）、1 小时、2 小时和最多 24 小时，在 1.5 毫升微量离心管中收集 1 毫升每种细菌菌株的培养物。
在600 nm 的λ最大紫外分光光度计中，以每小时的间隔（0小时、1 小时和最多 24 小时）测量培养物s的 OD 。
取n OTE的在不同时间点在Excel工作表的OD。
在不同的日子以生物复制重复实验。获取数据并将原始数据保存在 Excel 表格中。
绘制OD 600菌株对的所述使用GraphPad Prism（参见图1的时间（小时）和图2 ）。
取n OTE的时间和培养物生长的条件需要达到特定期望的OD进行随后的实验。

图1 。代表克的rowth曲线分析小号。LB培养基(A)和M9基本培养基(B)中的肠炎菌株。该图代表了细菌菌株的OD（代表S.肠炎WT和突变体菌株小号）在不同的时间点到12小时。

图 2. S 的代表性增长曲线分析。LB培养基(A)和M9基本培养基(B)中的肠炎菌株。该图表示的日志的细菌菌株的CFU /毫升（代表S.跨不同的时间点肠炎WT和突变体菌株）至多12小时。WT 的大约倍增时间在 LB 培养基中为 22.2分钟，在 M9 基本培养基中为20.3分钟。

您可以在指定的时间点（上图）收集 200 µl 培养物，以评估相应OD 和时间点菌株的 CFU 。
连续稀释人升与1中收集的培养物× 10 PBS -1 ，10 -2 ，10 -3 ，10 -4 ，以及10 -5稀ution（100微升培养+900μl的1 × PBS）。
将含有链霉素 (50 µg/ml) 的 LB 琼脂平板放在转盘上。扩散板50微升每种稀释到LB一个用无菌细胞吊具GAR板。大号阿贝尔与有机体名称，时间，和稀释因子每个LB琼脂板的底部。
注：干板完全避免对的盖缩合P ETRI菜。在进行广告电镀之前将板置于室温。
将平板在 37°C 下孵育过夜以获得细菌菌落

葡萄糖饥饿试验
用无菌 200 µl 微吸头从细菌 LB 琼脂平板中挑选一个细菌菌落。
在培养试管中的 5 ml M9 基本培养基（0.4% 葡萄糖）中接种细菌菌株（每个菌落一个菌落）（参见食谱）。
在 37°C 和 150 rpm 下将菌株培养过夜 (12-16) 小时。
从隔夜细菌培养物在两套无菌锥形瓶中进行亚培养，其中含有 100 毫升 M9 基本培养基（0.4% 葡萄糖），比例为1:100（1毫升过夜细菌培养物加入 100 毫升 M9 基本培养基）在 37 °C 和 150 转/分。
间歇性地监测菌株的 OD 600 ，直到达到 0. 4（早期对数阶段）的 OD 600 。
注意：大多数应激反应基因是生长阶段依赖性的。根据您的研究要求，选择您的生长期进行应激反应生存分析。在这个协议中，我们已在早期对数期培养物中进行应激反应分析，这是由表示为OD 600为0.4。
Ç ulture一个组烧瓶的小号与在在100毫升M9基本培养基（0.4％葡萄糖）的菌株一个1：100的比例，在37℃和150rpm下在整个实验。它将作为实验对照来监测病原体的生长速率，这应该是相似的（未生长缺陷）U的nDer正常培养条件。
为实现此目的，将从步骤 4 中获得的一组对数期细菌培养物转移到 50 毫升 Falcon 管中。在室温下以3 , 000 rpm离心10分钟，从培养物中回收所有细菌细胞。取出培养基上清液。
通过将细菌沉淀重悬在 20-30 ml M9 缓冲液中，用 M9 缓冲液（不含酪蛋白氨基酸和葡萄糖的 M9 基本培养基）洗涤细胞两次。在室温下以 3 , 000 rpm离心10分钟。去除 M9 缓冲液上清液。完成此步骤是为了从细菌细胞中去除 M9 基本培养基痕迹。
在1 ml M9 缓冲液中重悬洗涤后的沉淀。将培养物转移到含有 0.4% 葡萄糖的 M9 基本培养基的无菌锥形瓶中。在这一点上，收集了为连续稀释和电镀的LB培养一个噶尔马上。这个时间点将作为 0 小时。
Ť他增长将通过收集被监控的培养小号在1个小时，2小时，3小时，4 ħ在正常的M9基本培养基中生长的。连续稀释它们和板他们在LB一个含有链霉素GAR（50微克/毫升）。在这些时间点的CFU将作为控制相比，在葡萄糖上生长的菌株的CFU -饥饿条件。
要创建缺乏葡萄糖的培养基，请将步骤 4 中获得的第二组对数期培养物转移到 50 毫升 Falcon 管中。在室温下以3 , 000 rpm离心10分钟，从培养物中回收所有细菌细胞。取出培养基上清液。
通过将细菌沉淀重悬在 20-30 ml M9 缓冲液中，用 M9 缓冲液（不含酪蛋白氨基酸和葡萄糖的 M9 基本培养基）洗涤细胞两次。在室温下以3 , 000 rpm离心10分钟。去除 M9 缓冲液上清液。完成此步骤是为了从细菌细胞中去除 M9 基本培养基痕迹。
在1 ml M9 缓冲液中重悬洗涤后的沉淀。将培养物转移到带有含有 0.03% 葡萄糖的 M9 基本培养基的无菌锥形瓶中（参见食谱）。这种介质将作为葡萄糖-对菌株饥饿培养基。收集0 小时时间点的文化。
Ç ulture在葡萄糖菌株-饥饿培养基，在37℃和150rpm下。在暴露 1 小时、2 小时、3 小时和 4 小时后收集培养物，以获得葡萄糖饥饿数据。
注意：如果细菌细胞存活超过 4 小时，您可以收集更长的时间点。分析时间取决于您的菌株在暴露于压力后的存活情况。
连续稀释都在不同的时间点用1中收集的培养物× PBS在10 -1 ，10 -2 ，10 -3 ，10 -4 ，以及10 -5稀释（100微升培养+900μl的1 × PBS）。
将含有链霉素 (50 µg/ml) 的 LB 琼脂平板放在转盘上。扩散板50微升每种稀释到LB一个用无菌细胞吊具GAR板。大号阿贝尔与下列应激治疗生物体名称，时间各LB琼脂板的底部，并稀释因子。
注：干板完全避免对的盖缩合P ETRI菜。铺板前将板置于室温。
在 37°C 下孵育板过夜以恢复幸存的细菌菌落。

镁 (Mg 2+ ) 饥饿试验
用无菌 200 µl 微吸头从细菌 LB 琼脂平板中挑选一个细菌菌落。
在培养试管中接种 5 ml M9 基本培养基（MgSO 4 的最佳工作浓度：200 µM）中的细菌菌株（每个菌落一个菌落）（参见食谱）。
在 37°C 和 150 rpm 下将菌株培养过夜 (12-16) 小时。
从隔夜细菌培养物在两套无菌锥形瓶中进行亚培养，其中含有 100 ml M9 基本培养基（200 µM MgSO 4 ），比例为 1:100（1 ml 隔夜细菌培养物加入 100 ml M9 基本培养基）在 37 °C 和 150 转/分。
间歇性地监测菌株的 OD 600 ，直到达到 0.4（早期对数阶段）的 OD 600 。
培养ø NE组烧瓶的小号用在100毫升M9基本培养基（菌株200 μM硫酸镁）在一个1：100的比例在37℃（1毫升过夜细菌培养物为100毫升培养基的）和150 rpm下在整个实验。它将作为实验对照来监测病原体的生长速率，这应该是相似的（未生长缺陷的）正常培养条件下。
为实现此目的，将从步骤 4 中获得的一组对数期细菌培养物转移到 50 毫升 Falcon 管中。在室温下以3 , 000 rpm离心10分钟，从培养物中回收所有细菌细胞。取出培养基上清液。
通过在 20-30 ml M9 缓冲液中重新悬浮细菌沉淀，用 M9 缓冲液（不含酪蛋白氨基酸、葡萄糖和 MgSO 4 的M9 基本培养基）洗涤细胞两次。在室温下以3 , 000 rpm离心10分钟。去除 M9 缓冲液上清液。完成此步骤是为了从细菌细胞中去除 M9 基本培养基痕迹。
在1 ml M9 缓冲液中重悬洗涤后的沉淀。将培养物转移到含有200 μM MgSO 4 的M9 基本培养基中的无菌锥形瓶中。在这一点上，收集了为连续稀释和电镀的LB培养一个噶尔马上。这个时间点将作为 0 小时。
ģ rowth将通过收集培养来监测小号在1个小时，2小时，3小时，4 ħ在正常的M9基本培养基中生长的。连续稀释它们和板他们在LB一个含有链霉素GAR（50微克/毫升）。在这些时间点的CFU将作为一个控制相比，在Mg的生长菌株的CFU 2+饥饿条件。
要创建 Mg 2+饥饿培养基，将从步骤 4 中获得的第二组对数期培养物转移到 50 ml Falcon 管中。在室温下以3 , 000 rpm离心10分钟，从培养物中回收所有细菌细胞。取出培养基上清液。
通过在 20-30 ml M9 缓冲液中重新悬浮细菌沉淀，用 M9 缓冲液（不含酪蛋白氨基酸、葡萄糖和 MgSO 4 的M9 基本培养基）洗涤细胞两次。在室温下以3 , 000 rpm离心10分钟。去除 M9 缓冲液上清液。完成此步骤是为了从细菌细胞中去除 M9 基本培养基痕迹。
在 1ml M9 缓冲液中重悬洗涤后的沉淀。将培养物转移到含有 20 μM MgSO 4 的M9 基本培养基的无菌锥形瓶中（参见食谱）。该培养基将用作菌株的 Mg 2+饥饿培养基。收集 0 小时时间点的文化。
注意：您在 M9 基本培养基中改变 MgSO 4的浓度（2 至 ≤ 20 µM）以模拟体外缺乏Mg 2+ 的环境。
Ç ulture在镁菌株2+饥饿培养基，在37℃和150rpm下。在暴露于 Mg 2+饥饿1 小时、2 小时、3 小时和 4 小时后收集培养物。
注意：您可以收集更长的时间点。分析时间取决于您的菌株在暴露于压力后的存活情况。
连续稀释收集的培养物在不同时间点用1 × PBS在10 -1 ，10 -2 ，10 -3 ，10 -4 ，以及10 -5稀释（100微升培养+900μl的1 × PBS）。
将含有链霉素 (50 µg/ml) 的 LB 琼脂平板放在转盘上。扩散板50微升每种稀释到LB一个用无菌细胞吊具GAR板。大号阿贝尔与下列应激治疗生物体名称，时间各LB琼脂板的底部，并稀释因子。
注：干板完全避免对的盖缩合P ETRI菜。铺板前将板置于室温。
将平板在 37°C 下孵育过夜以恢复存活的细菌菌落。

胆汁压力测定
注意：对胆汁盐的敏感性可能因细菌菌株和商业来源而异。前用化合物的是表现出杀菌/毒性对抗细菌进行测定（如胆汁盐），ð etermine的化合物的最小抑制浓度（MIC），并使用下面的浓度它用于研究针对参照菌株目标菌株的应激反应。参考Hernández 等人的研究文章。( 2012 ) 和Wiegand 等人。( 2008)计算胆汁盐对肠炎沙门氏菌和其他可培养（需氧）微生物的 MIC 。我们计算了S.胆汁盐的MIC肠炎0.4 OD培养为30％（未显示数据）。因此，我们在实验中采用了 15% 的胆汁盐浓度。
用无菌 200 µl 微吸头从细菌 LB 琼脂平板中挑选一个细菌菌落。
在培养试管中的 5 ml LB 培养基中接种细菌菌株（每个菌落一个菌落）（参见食谱）。
在 37°C 和 150 rpm 下将菌株培养过夜 (12-16) 小时。
在含有 100 ml LB 培养基的无菌锥形瓶中以 1:100 的比例（1 ml 过夜细菌培养物与 100 ml LB 培养基）在 37°C 和 150 rpm 下从过夜细菌培养物中进行亚培养。
间歇性地监测菌株的 OD 600 ，直到达到 0.4（早期对数阶段）的 OD 600 。此时，收集 100 µl 培养物。连续稀释在1培养× PBS在10 -1 ，10 -2 ，10 -3 ，10 -4 ，以及10 -5稀释液（混合的100μl培养+900μl的1 × PBS）。每个稀释的50μl的板到LB一个含有链霉素GAR板（50微克/毫升）。这将作为胆汁应激治疗前培养物的参考 CFU（对照，0 小时时间点）。
在三个单独的 2 ml 微量离心管中为每个菌株收集 1 ml 对数期培养物。从 30% 胆汁盐原液 [1 ml 胆汁盐 (30% ) + 1 ml 细菌培养物] 中添加胆汁盐至最终浓度为 15% 。
在用胆盐处理后，在 37°C 下孵育菌株 1 小时、2 小时、3 小时和 4 小时。
注意：您可以收集更长的时间点。分析时间取决于您的菌株在暴露于压力后的存活情况。
在指定时间点用 1 × PBS 以 10 -1 、10 -2 、10 -3 、10 -4和 10 -5稀释（100 µl 培养物 + 900 µl 1 × PBS）连续稀释培养物。每个稀释的50μl的板到LB一个含有链霉素GAR板（50微克/毫升）。
将含有链霉素 (50 µg/ml) 的 LB 琼脂平板放在转盘上。扩散板50微升每种稀释到LB一个用无菌细胞吊具GAR板。大号阿贝尔与下列应激治疗生物体名称，时间各LB琼脂板的底部，并稀释因子。
将平板在 37°C 下孵育过夜以恢复存活的细菌菌落。

通过 CFU/ml计算估计压力处理后的细菌存活率
压力测定后的第二天，您应该在 LB a gar 平板上以适当的稀释倍数分离每个细菌菌株和对照菌株（存活菌落）的菌落
使用手动计数计数器 (Humboldt) 计算菌落数。也可以使用数字计数器或基于图像的计数器。
在e Excel 表格中输入应力处理前后恢复的菌落数。保存实验的每个技术复制和生物复制的原始数据。
存活细菌数的计算如下所述。
如果“X”是细菌的数量的菌落直径：获得n以下的LB一克在AR板的d ilution因子‘Y’后高原荷兰国际集团上50微升的LB一个GAR板，然后
每 50 µl CFU = X * 10 Y
每 1 µl 的 CFU= X * 10 Y / 50 µl
每毫升 CFU = (X * 10 Y / 50 µl) * 1000 µl
= (20 * X * 10 Y ) CFU/ml
注意：对于一个代表性图像，请参阅图1B（葡萄糖饥饿测定），1C（镁2+饥饿测定），并从一维（胆汁应力测定法）Arunima等。( 2020a) 。

数据分析

每个实验应在不同日期进行三次重复，并使用不同的细菌库存、不同的培养基库存，如果可能，还应使用不同的分析师。
最终数据对应于从三个生物实验中获得的细菌菌株的平均 CFU/ml。
与胁迫处理（如前画出平均CFU / ml的细菌的的对照）和平均的在不同胁迫条件下处理后的CFU / ml的细菌菌株的其他指定的时间点。
我们使用了 GraphPad Prism v. 7.0。用于分析，但您可以使用其他软件。输入CFU / ml的存活的细菌菌株（平均一种生物复制的）转换成的每个组列的一个分组的分析，和Ë NTER在列标题栏的时间点。
生成的图表将是描绘不同细菌菌株与参考菌株（Y 轴）与时间（X轴）相比的CFU/ml 的线图。还可以绘制曲线图酒吧±SD图（存活）对时间（在X轴小时）（S EE图1B，1C中，d的1D Arunima等人。（2020A）。
使用双向方差分析对应力条件进行统计分析。P值 < 0.05、P < 0.01 和P < 0.001 被认为具有统计学意义；P ≥0.05不显著。

笔记

在每个实验中运行阴性对照以检查污染。阴性对照将是仅以与实验中的培养物相同的方式处理的生长培养基（不含细菌的 LB 和 M9 基本培养基）。
在无菌条件下进行实验。

食谱

LB培养基
称取 25 克 LB 培养基（Himedia）。
将其悬浮在1 , 000 ml 双蒸水中。
在搅拌板上搅拌混合。
根据需要分装在试管或烧瓶中。
在 15 lbs 压力 (121°C) 下高压灭菌20 分钟。
冷却后，补充必要的抗生素以培养微生物。
注：用于实验的 LB 培养基配方为 LB-Lennox 培养基。
LB琼脂
准备工作重新LB培养基如上所述。
添加7.5克一个GAR至500ml LB培养基中，š WIRL它轻轻地。
在 15 磅压力 (121°C) 下高压灭菌 20 分钟。
将其冷却至 55°C，并将链霉素(50 µg/ml) 添加到 LB a gar 中。
轻轻旋转以避免气泡。
如果使用一种以上的抗生素，请相应地添加和标记板。
在无菌的 50 ml falcon 管中测量 30-35 ml LB a gar。然后将其倒入每个无菌 90 毫米培养皿中。
注意：对于每组实验，LB 琼脂培养基的体积应保持一致，以最大限度地减少 CFU 和存活测定中生长差异的变异性。实验中使用含有链霉素的 LB，因为肠炎沙门氏菌对链霉素具有天然抗性。
培养基凝固后，倒置培养皿并在 4°C 下储存直至需要。
在使用前 2-3 小时将板从储藏室中取出。
无菌 1 M CaCl 2溶液
将11.1 克 CaCl 2 · 2H 2 O溶解在 100 毫升Milli Q 水中。
在 15 磅压力 (121°C) 下高压灭菌 20 分钟。
分装成小体积，以避免污染主要库存。
将其存放在室温下。
无菌 1 M MgSO 4溶液
将 24.65 g MgSO 4 · 7H 2 O溶解在 100 ml Mill i Q 水中。
在 15 lbs 压力 (121°C) 下高压灭菌20 分钟。
分装成小体积以避免污染主要原料。
在室温下储存。
20%葡萄糖
将 20 克葡萄糖溶解在 100毫升高压灭菌的 Milli Q 水中。
注射器过滤器通过它0.22μ米PVDF膜，d O不可高压灭菌。
分装成小体积以避免污染主要原料。
将其储存在 4°C 。
20% 酪蛋白氨基酸
将 20 克酪蛋白水解物溶解在 100毫升高压灭菌的 Milli Q 水中。
注射器过滤器通过它0.22μ米PVDF膜，d O不可高压灭菌。
分装成小体积以避免污染主要原料。
将其储存在 4°C 。
50mg/ml 链霉素溶液
一种。将 50 mg 硫酸链霉素溶解在 1 ml 高压灭菌的 Milli Q 水中。
湾注射器过滤器通过它0.22μ米PVDF膜，d O不可高压釜中。
C。将其储存在 -20°C 下。
无菌 1 × PBS 缓冲液
将 8 克 NaCl、0.2 克 KCl、1.44 克 Na 2 HPO 4和 0.24 克 KH 2 PO 4溶解在 500 毫升 Milli Q 水中。
用 H Cl将 pH 值调节到 7.4 。
添加 Milli Q水至 1 L的总体积。
在 15 lbs 压力 (121°C) 下高压灭菌20 分钟。
在室温下储存。
也可以配制10 × PBS 缓冲液，稀释至 1 × PBS 缓冲液使用。请遵循冷泉港协议 ( http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec8247 )。
无菌 5 × M9 盐
将 64 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O、15 g KH 2 PO 4 、2.5 g NaCl 和 5 g NH 4 Cl 溶解在 800 ml Milli Q 水中。
调整音量，以1 ，000个毫升的，由阿迪纳克水。
在 15 lbs 压力 (121°C) 下高压灭菌20 分钟。
在室温下储存。
无菌 M9 最小培养基
加入 20 毫升 5 × M9 盐。
加入200 μ 1M硫酸镁的升4 （工作浓度：200μM）。
添加10 μ 1M氯化钙的升2 （工作浓度：100μM）。
添加 2 ml 20% 葡萄糖（工作浓度：0.4%）。
加入500 μ升的20％酪蛋白氨基酸（工作浓度：0.1％）。
加入上述所有成分，并调整体积至 100 ml 高压灭菌双蒸水。使用高压灭菌的量筒来量化所有成分。
将它们分装到高压灭菌的 5 ml 培养试管和 250 ml 锥形瓶中，用于细菌培养和实验。
需要注意的是，使用前要新鲜添加葡萄糖和酪蛋白氨基酸。不含葡萄糖和酪蛋白酸的 M9 基本培养基（M9缓冲液）可以在室温下储存。
含有 0.03% 葡萄糖的无菌 M9 基本培养基
加入 20 毫升 5× M9 盐。
添加200 μ 1升中号硫酸镁4 （工作浓度：200μM）。
添加10 μ 1升中号的CaCl 2 （工作浓度：100μM）。
添加 150 µl 20% 葡萄糖（工作浓度：0.03%）。
加入500 μ升的20％酪蛋白氨基酸（工作浓度：0.1％）。
添加所有上述成分并将体积调整为 100 ml高压灭菌双蒸水。
将它们分装到高压灭菌的 5ml 培养试管和 250ml 锥形瓶中，用于细菌培养和实验。
含有 20 µM MgSO 4 的无菌 M9 基本培养基
加入 20 毫升 5 × M9 盐。
加入20 μ 1升中号硫酸镁4 （工作浓度：20μM）。
添加10 μ 1升中号的CaCl 2 （工作浓度：100μM）。
添加 150 µl 20% 葡萄糖（工作浓度：0.03%）。
加入500 μ升的20％酪蛋白氨基酸（工作浓度：0.1％）。
添加所有上述成分并将体积调整为 100 ml高压灭菌双蒸水。
将它们分装到高压灭菌的 5 ml 培养试管和 250 ml 锥形瓶中，用于细菌培养和实验。
30% 胆盐
将 30 g 胆汁盐混合物溶解到 100 ml高压灭菌的双蒸水中。
注射器通过 0.22 µm PVDF 膜过滤。不要高压灭菌。
在室温下储存。

致谢

所述克lucose饥饿测定被导出并从改性以前的工作（斯佩克特和丘比特，1992 ;奥尼尔等人，1994。;凯尼恩等人，2005）。第m agnesium饥饿测定是通过从工作适于莫雷拉等。( 2013) 。在B ILE应力测定被导出并从改性埃尔南德斯等人。( 2012) 。这些修改后的协议最初是在Arunima等人中实现和描述的。( 2020a) 。

利益争夺

作者声明没有与这项工作相关的财务和非财务竞争利益。

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