材料和试剂

A.到B uild拍摄培养箱
1. Hydropo NIC室内花园成长帐篷（24英寸。× 24在。× 48在。，Yaheetech，米Odel等：YT-2801）
2.摄影单位
一种。d igital相机（松下，型号：DMC-FZ50）
湾 LCD定时器遥控器（JJC，型号：TMD）
C。AAA 电池（2 块，金霸王）
d. 镀锌开槽角钢（4 个，1.5 in . × 14 Gauge × 36 in . ，皇冠螺栓）
e. 镀锌开槽角钢（10 个，1.5 in . × 14 Gauge × 18 in . ，皇冠螺栓）
F。铝制扁钢（0.75 in . × 36 in . × 0.125 in . , Everbilt）
G。黑色涤纶布（20 in . × 20 in . , Dazian）
H。螺栓和Ñ UTS（40对，M5，冠螺栓）
一世。黑色丙烯酸片（2个，在18 。× 18在。× 0.125在。，国家安全镜像）
j. LED灯带（3米，白色，国通）
克。电源板（6 插座，贝尔金）
3.背光屏蔽
一种。黑色丙烯酸片（3片，在12 。× 12在。× 0.118在。，国家安全镜像）
湾荧光圆形吸顶灯（Sunlite，型号：FC12T9/CW）带启动镇流器
C。锌-螺纹杆（4个，以0.25 。× 12在。，Everbilt）
d. 六角螺母镀（24件0.25在。，Everbilt）
4、温湿度控制单元
一种。加热控制模块（Coy Lab，序列号：DC1807）
湾风扇（AC Infinity，型号：LS1225A-X）
C。数字湿度控制器插座（Inkbird，型号：IHC200S）
d. 爬行动物加湿器（2 L，Evergreen）
e. 烧杯（500米升）
注：其他品牌加湿器或控制器的可替代方案，如果IR组合Ç的好
控制室内湿度。

B.对于群荷兰国际集团板制备
1.肠杆菌属。SM1 ，SM3，SM3_18，SM3_24 （对于细菌物种的蜂拥测定）
2. LB肉汤（见食谱）
3. 0.5% LB 琼脂平板（见食谱）

设备

1. Labconco 净化器 II 类生物安全柜（Delta 系列）
2.隼14 -毫升聚苯乙烯圆底管小号英寸（17毫米× 100mm时，Corning）中
3.消毒木连接棒（2.5英寸。）
4.移液器(Drummond, 1 - 100 ml) 用合适的移液器
5.新不伦瑞克 Innova 4300 孵化摇床
6.称重纸（4 in . × 4 in . , Fisher Scientific, c at alog number: 09-898-12B）
7.实验室刮刀（4 件，6.5 英寸，不锈钢，家用科学工具）
8.派勒斯玻璃瓶小号（250毫升，康宁，型号：1395）
9. Pyrex 量筒（500 毫升，康宁，型号：3022）
10.热板磁力搅拌器（Barnstead International，型号：SP46925）
11.隔热手套
12.高压灭菌器（AMSCO Scientific，型号：SV-120）带高压灭菌托盘
13.培养皿ES英寸（100毫米× 15mm时，无菌，聚苯乙烯，Fisher Scientific公司，Ç在考勤数：FB0875712）
14.微管（0.5 - 10微升，ê ppendorf，Ç在考勤编号：3123000020）
15.亚克力刀具（弗莱彻）
16.圆刀（博特）
17.带合适钻头组的手钻/台钻
18.钢锯

软件

ImageJ (ver1.59g) ( https://imagej.nih.gov/ij/ )

程序

部分我：设置拍摄孵化器

A.组装相机支架
1.按照说明书安装雅喜水培帐篷。该手册随产品包装一起提供。先组装骨架，然后用聚酯材料覆盖它。
2.使用M5螺栓和螺母来组装相机帧，如所示图URE 1.连接第一镀锌开槽角，然后将铝条。开槽角钢的侧面有孔，但铝条没有。使用手钻或台钻在铝条的末端钻孔。由于铝棒用于稳定结构，因此它们的位置不必精确。

˚F igure 1 。示意图显示了相机框架的结构。四个的36片-在镀锌槽的角度支架与地面垂直并且是由10片18的连接-在镀锌开槽角使用M5螺栓和螺母。铝条是没有特定位置的要求以稳定整个结构小号。当使用遮光，地面和样品平台之间的距离在18。W¯¯采用LED光照明母鸡，样品平台可以通过几英寸升高摄影。

3.使用的丙烯酸类切割器以切割SID 18的ES在×丙烯酸片材18略，以适应在样品平台。
4.使用一个圆形刀具切割为9英寸的圆的直径从18中的一个的在× 18从中心压克力板“A” ; 保持另一张纸“B”未切割。
5. 将板材“A”固定在样品平台上。钻的上侧适当的孔，使该螺栓经过一路走下来到孔的开槽角度。
6.将相机固定在相机固定器上，镜头朝下。前后调整定影器，使相机与亚克力板上的圆圈对齐。
7.在亚克力板上方 1 英寸的开槽角上，将 LED 灯条贴在样品平台周围。光的位置不能太高，因为我们要避免光从板反射。
8.剪下两块黑布，大约 20 英寸× 20 英寸。将其中一块放在帐篷底部作为黑色摄影背景。对于另一块，在中心切一个孔让相机镜头通过，然后将布挂在相机平台上以遮挡顶部的反射。
9.将相机支架放在帐篷内。
10.负载的电池到所述LCD计时器遥控器和将其连接到通过在帐篷的顶部的孔的相机。使用周围的弹性绳将孔拧紧。

B.制作遮光罩
1.的切圆3.62中，在5.75 ，和9.50的直径ETER出三块丙烯酸片。钻0.25-在孔我n各自的角部的，1.2从两个边缘。根据图2组装遮光罩。将圆形荧光灯泡放置在 I 层和样品平台之间。使用胶带将启动镇流器粘在样品平台下。
暂停点：Ť这里有照明的两种模式：ö NE US上课一个背光，而另一个我们上课一侧的光（图URE 3）。当拍摄接近-的图像š的一个一个板事件，它是优选使用的光屏蔽罩，其自己的光源光片下面。要拍照，请将遮光罩放在样品平台上并将其与相机对齐。使用遮光罩时关闭 LED 灯。在另一方面，在拍照时的一个以上的板，遮光被移除，和未切割的18 × 18在丙烯酸系片材为p股价上圆切割样品平台的顶部上。多达 9 个琼脂平板可以放置在未切割的薄片上进行成像。要拍照，请打开 LED 灯作为侧光源。

图2 。图像示出了一个光臂章d组件，其用于单-板成像。三片12中的× 12一中空丙烯酸系片材一个由连接重新4个在锌片12 -螺纹杆并用六角螺母镀固定。一级片材与地面之间的距离约为 1.5 英寸，只留下足够的空间来放置圆形荧光灯泡以适应。二级和三级的高度s可以调整以优化照明。

˚F igure 3 。使用遮光罩或 LED 灯带拍照。( A)使用遮光罩组件拍照。圆形荧光灯泡放置在层 I 和样品平台之间（如图 2 所示）。II 级和 I 级之间的距离约为 0.8 英寸，而 II 级和 III 级之间的距离为 3.5 英寸。 (B) 使用 LED 灯带拍照。LED 灯固定在水平镀锌槽角上样品平台上方 1 英寸处。如果光线太强，可以插入一条白纸带来漫射和反射光线。相机附近的黑布对于阻挡来自板的反射是必要的。

C 、安装温湿度控制系统
1. P花边帐篷内的热控制模块，在底部侧，š UCH它不会使用遮光当蜂拥照片显示。调整温度设定为所需温度的蜂拥测定。
2.将加湿器置于帐篷外，将电源线连接至湿度控制器插座。将可提取的塑料雾管通过帐篷壁上的孔延伸到样品平台下方的帐篷中。
注：Ç赫克相机预览并确认该管和雾不会在图像中显示出来。
3.将加湿器水箱注满水。塞的湿度调节装置中的电源板，并与调节湿度值一个根据控制器手动公差范围。例如，对于肠杆菌属。SM3 （SE Ë的相应的主文章），设定湿度至40％±5％容差（TOL）。
4.将500 -雾管收集水滴下毫升烧杯中。
5.使用风扇随附的螺栓和螺母将交流风扇固定在面向烧杯的其中一个开槽角腿上。风扇不仅用于吹除加湿器中的雾气以防止照片中出现雾气，而且还用于改善室内温度和湿度的通风和均匀性。
6. 将所有孔拧紧，并密封帐篷的拉链。

部分II ：执行的蜂拥分析
1.从 -80°C 冰箱中取出细菌甘油原液。用一块无菌木材的连接棒划伤细菌-含冰表面上，然后浸棒插入LB肉汤。P花边的甘油原液回在冷冻机和摇动接种LB肉汤过夜（〜16小时）一个振荡器。温度设置为 37°C，振荡频率设置为200 转/分钟(rpm)。下午 5 点左右开始过夜生长，以便第二天早上 9 点左右可以使用。
2.使用一个微量吸移管接种2微升过夜细菌悬浮液上的中心每个琼脂平板上。转移板培养箱日以后Ë滴接种已经通过吸收在琼脂（传播的的圆形降已成为几乎不可见）。

部分III ：时间推移拍照和蜂拥率孔定量牛逼通货膨胀
1.为了使用遮光，对花边一个大群ING板倒置在板保持件。打开荧光灯泡和相机。所述LED灯条应保持关闭。
2.在相机的预览中，您应该看到位于屏幕中央的盘子。否则，将光屏蔽周围与样品对准摄像头。
3.旋转螺杆上的螺母，调整亚克力板的位置。样品平台与 Level I 之间的距离约为 1.5 英寸。一级和二级之间的距离约为 0.8 英寸，而二级和三级之间的距离为3.5 英寸。如果您在培养皿上看到一个圆形光点，请稍微抬起 III 级。如果培养皿太暗，请稍微降低 III 级。如果你不能得到通过调整级别III的良好形象，然后调整二级小幅上涨或下跌（见ñ OTE 3）。
4.将相机焦距设置为 35 - 65 毫米。调节变焦环，使样品OCCUP IES全屏幕，但不会不超过边界。使用“M ，”手动模式中，将重点放在细菌结肠IES 。集合T他光圈F5.6 - F7.1和调节快门速度直到结果荷兰国际集团的曝光值是0或-⅓ ，因为曝光过度的图像将导致在图像细节的损失（图URE 4A）。
5.对于一个多板测定中，除去遮光，点亮LED灯条，并放置在样品平台上的未切割的丙烯酸系片材。将蜂巢板倒置在亚克力板上，这样水就不会在盖子上形成冷凝水。检查相机预览，以确保其所有的板都卵石的范围内N（图URE 4B）。
6、根据说明书设置液晶摄像头定时器控制的帧率和帧数。例如，在肠杆菌属的情况下。SM3，我们将帧数设置为 50，将帧之间的时间间隔设置为15 分钟。按下了“开始”按钮，开始时间推移照片拍摄。
7.拉上帐篷的拉链以形成良好的密封。蜂拥检测可能需要大约 10小时。您可以让相机过夜并在第二天早上收集图像。拍照过程中，请勿摇晃培养箱；否则，光学设置可能会受到干扰。
8.蜂群完成后停止定时器控制器。由c连接下载图像相机来使用USB数据线一台笔记本电脑或通过拉出相机的存储卡，并把它变成一个电脑上下载的图片。
9.检查在您的计算机上拍摄的图像。如果图像的亮度变化，则可以使用“堆栈的去闪烁”插件ImageJ中校准的亮度。如果图像中的样本位置随时间变化，您可以应用“图像稳定器”插件来修复它。

数据一nalysis

代表性的单板和多板蜂拥图像分别如图 4A 和 4B 所示。在所示的板的时间过程图URE 4B被渲染为视频在视频1。

˚F igure 4 。在孵化器中拍摄的蜂群图像。（A）P晚期š接种肠杆菌属。SM1（左）和SM3（右）瓦特ERE孵育6.5 ħ 。此我法师用的是环形荧光灯灯泡截取和遮光组件。SM3与（B）的成群的一个群缺陷型突变SM3，的SM3_18（板小号1，2，4），并相对于SM3一大群缺陷型突变SM3，的SM3_24（板小号3，5，6）。每个比较被执行以一式三份，用SM3上的每个板的右半接种。图像拍摄一后6.5 - ^ h孵化。侧面 LED 灯带用于照明，所有六个板一起成像。

肠杆菌属的延时视频。使用 LED 灯条照明进行的 SM3 蜂群检测。将 SM3 及其突变体（SM3_18 或 SM3_24，每个一式三份）过夜培养物接种在 0.5% LB 琼脂平板上并在光室中孵育。延时图像拍摄 10 小时，然后使用 ImageJ（版本 1.59 g）以每秒 11 帧 (fps) 的速度将图像渲染为 .avi 视频文件。

为了计算群ING区域，打开图像的兴趣ImageJ中。点击“分析”——“设置比例”，校准像素与实际长度的比例。然后用“徒手选择”工具来勾勒菌落边缘，然后按“M”通过图像（以计算所选择的集落的图像的区域图URE 5）。肠杆菌属的蜂拥率。SM1和SM3一个重新在图6中绘制的以下的计算的群区域。

图 5. 使用 ImageJ 计算群区域。(A) ImageJ 用户界面。选择了“手绘选择”工具。(B)肠杆菌属。SM3群荷兰国际集团的殖民地（右）由“写意选择”工具概述。（C）在S中的像素Cale的š我S设定到实际长度的值。（d）通过按下“M ，”种群的面积进行计算。

˚F igure 6 。孔定量牛逼的通货膨胀肠杆菌属。SM1 和 SM3 蜂拥运动。SM1 和 SM3用2 μl 过夜细菌培养物接种在 0.5% LB 琼脂平板上，并在蜂群培养箱中培养（共重复 10 次）。每半小时拍摄一次延时图像，并测量每个图像的群体面积。数据表示为在平均值，用误差条指示的95％置信区间。当不可见时，误差小于符号的大小。

笔记

1.孵化器内的湿度和温度应达到的电源被接通之后并且保持稳定的过夜记录的持续时间在10分钟内的设定值。
2.有时，某些型号小号或规格的产品可能会脱销。如果18 -在开槽的角度不容易获得，例如，人们可以从再切割角度用钢锯。从一块亚克力上切出一个大圆孔需要一定的技巧。为确保安全，使用孔锯或切圆刀时，请务必先将亚克力板牢牢固定在工作台上。另一种选择是去工程车间或木匠店完成这些切割。他们有更先进的工具，如马刀锯或曲线锯来切割圆孔。
3.光罩校准需要练习。每个亚克力板之间存在细微的距离关系，以实现最佳图像质量，具体取决于相机设置。我们希望光通过透明琼脂光泽和反射由所述群荷兰国际集团菌落。找到正确的位置后，拧紧所有螺母，以便锁定该位置以进行后续成像。
4、如果一个群聚株不群聚而只是形成一个密集的斑点，可能是盘子太干了；因此，可用于群体扩展的培养基可能较少。始终使用中，从p2天新鲜板ouring他们; b eyond两天，琼脂平板将显著干燥器变得并且可能无法维持蜂拥蠕动。该d在引擎盖rying时间不宜过长。当实验室湿度低于30%时，干燥10分钟就足够了。另外，当琼脂溶液不太冷时倒入盘子；Ó therwise，琼脂倾倒在所述板可以具有一个粗糙的表面，因为凝固已在瓶，其上显示出在小簇板已经发生。最后，双-检查胰蛋白胨或酵母。有时，对于某些批号，某些化学品不会完全溶解，这可能会改变琼脂表面的质地，导致结果不理想。
5.有时，非群ING菌株也出现“群，”在特殊情况下，甚至快于蜂拥株。在这种情况下，琼脂浓度可能太低或干燥时间太短，因此细胞在游动，而不是在平板上蜂拥而至。不同的蜂群物种对琼脂浓度的耐受性不同。对于 SM 菌株，0.5% 琼脂是区分蜂群和非蜂群的首选浓度，而对于枯草芽孢杆菌3610，0.7% 已被证明是最佳琼脂浓度。为了解决假阳性的问题，可以尝试增加干燥时间或稍微提高琼脂浓度。
6.如果使用不同的帐篷，并且盖子的温度低于底部的温度，则板盖可能会出现冷凝。在这种情况下，尝试翻转盘子，问题应该得到解决。翻转盘子后，相应地调整相机镜头以专注于细菌群。
7. SM菌株是新分离的细菌菌株。请求本身材料转让协议项下的应变，请参阅链接的主要文章（https://doi.org/10.1053/j.gatro.2021.03.017）。

食谱

LB肉汤，溶液
10g / L的吨ryptone
5 g/L y东方提取物
5 克/升氯化钠
注：上述中介嗯配方是专为SM细菌和受根据其他微生物之一的生活必需品变化的作品有。
0.5% LB 琼脂平板（群平板）
10g / L的吨ryptone
5 g/L y东方提取物
5 克/升氯化钠
0.5%一加仑
称取0.5克酵母提取物，将1.0g吨ryptone，0.5克NaCl，和0.5克琼脂。P花边的SE中以100 -毫升的硼硅玻璃瓶。测量100ml去离子水中，并在倒到瓶中。
把适当大小的磁力搅拌棒在向瓶子，松散地盖上盖子，然后将瓶子在热板上磁力搅拌器。打开热量和磁力搅拌器。介质沸腾大约需要 10 – 15 分钟。
一压脚提升媒体开始s到沸腾，T瓮关闭stirr ER和的热量。戴上隔热手套，将瓶子转移到装有一层薄水的可高压灭菌的托盘上。
松开瓶盖和autoclav Ë下15psi下25分钟在121℃。
一旦高压釜公顷小号成品，对花边瓶子介质背面的上磁力搅拌器，具有加热功能关闭，但在上搅拌功能。在这一步中，我们希望介质冷却到 40 - 50°C ；不断搅拌是为了保持温度的均匀性。
达到目标温度后，使用移液器将 LB 琼脂培养基转移到 6 个培养皿中，每个培养皿中 15 毫升。执行个是在层流罩内或附近的火焰操作以最小化污染的来自空气的机会。
注意：15 - 20 ml 培养基非常适合一个培养皿。如果体积太小，在孵化过程中琼脂板会变得太干；我F中的体积过大，图像质量会受到影响，由于透明度差。
当琼脂已固化，除去的盖的蜂拥板和在引擎盖干燥。
注意：板必须在通风橱中进行干燥，以除去多余的水分从琼脂表面。如果琼脂表面有水，细菌可能会游动而不是蜂拥而至。如果室内湿度高于 50%，将板干燥 20 分钟；如果房间湿度低于30%，干燥时间约为10分钟；并且如果湿度是30 - 50％，相应地调整干燥时间约15分钟。不要过度-干板; 否则，该细菌可能不能一窝蜂琼脂上。可替代地，使用预先存储的蜂拥板，其可以被存储倒置在一个4℃冷室中静置2天; 不需要封口膜或塑料袋。使用预先存储的板，干燥时间应被减小由〜5分钟。

致谢

此处介绍的仪器和研究是使用Albert Einstein College of Medicine, INC 的资金建造和进行的，并得到 CCFA（美国克罗恩病和结肠炎基金会；Grant# 362520）（给 SM）的广泛医学研究计划的支持；NIH R01 CA127231；CA 161879；1R01ES030197-01 ；和国防部合作 PI (W81XWH-17-1-0479; PR160167) (SM)。

利益争夺

作者声明他们没有相互冲突的经济利益。

参考

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