材料和试剂

10厘米15cm培养皿（Thermo Scientific的TM ，Nunc公司TM EasYDish，目录号小号：150464，150468 ）
50毫升和15ml离心管中（Thermo Scientific的TM ，Thermo Scientific的TM的Nunc TM ，目录号小号：339650，339652）
1.5毫升和2ml Eppendorf管（无RNA酶）（CORNING，爱思进，目录号小号：MCT-150-C，MCT-200-C）
10毫升和25ml血清移液管（Thermo Scientific的TM ，Nunc公司TM ，目录号小号：170357N，170356N）
10 ml注射器（Sigma-Aldrich，目录号：Z248029）
移液针（BioComp，属于Gradient Master in Equipment）
25 cm细胞刮刀（JET BIOFIL，目录号：CSC011025）
聚丙烯离心管（Beckman coulter，目录号：331372）
真空过滤系统（Corning，目录号：430758）
细胞系：HEK293T
无核酸酶水（Sigma-Aldrich，目录号：W4502）
TRIzol TM试剂（Thermo Fisher，目录号：15596018）
氯仿（Sinoreagent，目录号：10006818）
异丙醇（Sinoreagent，目录号：80109218）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）（meilunbio，目录号：MA0212）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Hyclone，目录号：SH30256.01）
核糖核酸酶抑制剂（Promega，目录号：N2518）
RQ1无RNA酶˚F REE DNA酶（Promega公司，目录号：M6101）
RNase R（Lucigen，目录号：RNR07250）
cOmplete TM EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail（Roche，目录号：11873580001）
放线菌酮（CHX）（Sigma，目录号：C7698）
23.二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
Triton TM X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
带有 RiboErase（HMR）的KAPA Stranded RNA-Seq试剂盒（KAPA，目录号：KK8483）
RNA清洁和浓缩器试剂盒（ZYMO RESEARCH，目录号：R1019）
10× Polysome 缓冲液（见配方）
裂解缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
70% 蔗糖溶液（见配方）
50% 蔗糖分级溶液（见配方）
10% 蔗糖分级溶液（见配方）

设备

超速离心机（带转子 SW41）（Beckman，型号：Optima XPN-100-IVD，目录号：A99846）
光谱仪（Thermo Fisher ，NanoDrop，目录号：ND-1000）
密度梯度分级分离系统（完整的系统包括管刺穿系统;注射器泵; UA-6检测器，带254级280nm的过滤器，R1馏分收集器，密度梯度流动池，电缆，和管道）（BRANDEL，目录号：BR-188）
Gradient Master （BioComp ，目录号：Biocomp 108）

软件

峰图（密度梯度分级系统的数据捕获软件，www.brandel.com）
TopHat 2/ TopHat-Fusion ( https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml , https://ccb.jhu.edu/software/tophat/fusion_index.shtml )
CIRCexplorer2 ( https://circexplorer2.readthedocs.io/en/latest/ )

程序

蔗糖梯度的制备（图 1）
制备在不含核酸酶的水500毫升10×缓冲多聚核糖体和500ml的70％（W / V）在1×缓冲多核糖体的蔗糖溶液（见ř ecipes）。使用真空过滤系统过滤解决方案。
制备10％（W / V）和50％（W / V）蔗糖溶液70％（W / V）蔗糖溶液（见ř ecipes）。
添加10％和50％蔗糖溶液，在该顺序，到在室温下在Beckman聚丙烯离心管中。
注：加半管先用 10% 蔗糖溶液，然后用针将50% 蔗糖溶液加到管底部的10% 溶液下。
加载在梯度主离心管以使一个10-50％（W / V）蔗糖梯度。蔗糖梯度可以立即使用或储存长期在-80℃（不超过2周）（小号EE注1）。

图1 。蔗糖梯度制备方案

样品制备
注意：使用前冷却所有溶液和缓冲液。如果可能，将样品一直放在冰上。
种子中的细胞10厘米15cm培养皿ES前一天实验（小号EE注2和表1 ）。

表 1. 该协议的推荐时间表

在培养基中加入 100 μg/ml 放线菌酮，在 37 °C下孵育细胞10分钟。
丢弃培养基并用含有 100 µg/ml 放线菌酮的 10 ml 冰冷 PBS 清洗细胞两次。
向细胞中加入 10 ml 冰冷的 PBS，并用细胞刮刀收获细胞。
将细胞悬液转移到 15 ml 离心管中，并在4°C 下以 1,000 × g离心3 分钟。
去除上清液，将 250 μl 裂解缓冲液加入 15 ml 离心管中。
通过轻轻移液裂解细胞并将裂解物转移到 1.5 ml Eppendorf 管中。
将细胞裂解液在冰上放置 10分钟，然后在4°C 下以14,000 × g离心裂解液10 分钟以去除细胞碎片。
将上清液转移到新的 1.5 ml Eppendorf 管中。
稀1μl的样品用999微升水，并测量了使用近似RNA浓度一纳米d ROP光电分光计（小号EE注3）。
将样品放在冰上立即使用或立即将m冷冻在液氮中并储存在 -80 °C直至使用（不超过一个月）。

多聚体分析
除去的溶液的体积相同的的从顶部装载样品的10-50％蔗糖梯度，然后加载到样品的蔗糖梯度。最佳装载体积为200-500微升（小号EE注3）。保留 10% 的裂解物作为输入。
在 Beckman 超速离心机中使用 SW41 转子在4°C 下以 35,000 × g离心2.5小时。
在样品离心时设置密度梯度分馏系统。填充追溶液注射器[ 70％（W / V）与溴酚蓝蔗糖] ，冲洗管路，并校准紫外分光光度计按照设备指令小号。
轻轻地从转子除去管，并把它们成的密度梯度分馏系统。可替换地，让他们在4 ℃下直至使用（Ñ ø超过4小时）。
将样品加载到UA-6 检测器下并刺破管子底部，连接注射泵和检测器系统（见图 2）。

图 2. 密度梯度分级系统设置方案

为 2 ml Eppendorf 管编号并将它们放置在 R1 馏分收集器上。
注意：甲回合750微升样品的将在每个管收集。
将注射泵设置为 1.5 毫升/分钟的流速并打开远程模型。按时间设置馏分收集器。
使用峰值图表软件打开密度梯度分馏系统。记录与峰值图表（数据小号EE图3），并收集用级分收集器的部分。
将样品储存在 -80 °C直至使用（不超过一个月）。

图 3. Polysome 分析示例。代表 RNA 片段丰度的 OD254 (A254) 的吸光度由 UA-6 检测器测量。用密度梯度分级系统将蔗糖梯度分级为17个级分。A254 的值由峰图记录并如图所示绘制。

RNA-seq文库制备
根据制造商的说明加入750μl的TRIzol试剂到每个管中，并提取的RNA（Û本身氯仿，异丙醇，和70％的乙醇从样品和洗脱单独的RNA在约30μl的水）或存储在-80℃。
在自由的，monosome，光多核糖体或用等体积的，分别重多核糖体级分池RNA样品（例如，一个š如图3所示，级分1中称为“游离分数， ”分数6-7被称作“ monosome分数， ”级分8-10用等体积合并的小号和称为“光多核糖体级分，”和分数11-16合并用等体积的和称为“重馏分多核糖体” ）。
使用 Nano D rop测量每种 RNA 混合物的 RNA 浓度。
在 37°C 下用 DNase I（无 RNase）处理 RNA 15 分钟。
2 微克 RNA x 微升
DNase I 1μl
10×DNase I 缓冲液 5 μl
水 44-x μl
清理使用的RNA的根据生产商的说明书ZYMO RNA清洁和浓缩试剂盒小号。
治疗所述DNA酶I处理过的用RNaseř的RNA在37℃下30分钟（小号EE注4）。
1 微克 RNA x 微升
RNase R 1 微升
10×RNase R 缓冲液 5 μl
水 44-x μl
清理使用的RNA的根据生产商的说明书ZYMO RNA清洁和浓缩试剂盒（ê luted在20μl水中的RNA）。
根据制造商的说明，使用带有 RiboErase的KAPA 链式 RNA-seq 试剂盒构建 RNA-seq 库。
序列使用的库一个与150bp的配对末端方法一个每个样品亿阅读深度。
注：我们建议Illumina的HiSeq ® 3000 / HiSeq 4000测序系统的RNA-seq的。

鉴定可翻译的circRNA
对原始测序读数进行质量控制并修剪适配器序列。丢掉低-品质的读取。从读取中修剪适配器序列并将m映射到基因组。
使用 TopHat2 将读数与参考基因组对齐，并使用 TopHat-Fusion 映射未映射的读数。
使用CIRCexplorer2 管道注释和组装 circRNA 转录本（参见 GitHub 中的详细信息：https ://circexplorer2.readthedocs.io/en/latest/ ）（Zhang ，XO等，2016）。

笔记

如果没有 Gradient Master 进行梯度形成，我们建议使用另一种方法通过冻结和解冻来形成梯度。为了使一个10-50％（W / V）蔗糖梯度，制备50％（W / V），40％（W / V），30％（W / V），20％（W / V），和10 % (w/v) 蔗糖溶液s 。放2毫升的50％的蔗糖到一个贝克曼离心机管和冻结干冰-乙醇，然后把40％的溶液（2ml）中和也冻结，并重复与其他解决方案。所述管可以是冷冻和储存d在-80℃下。使用前一天，将解冻的冷藏库的管道（4℃）过夜，一个第二它们是准备使用。
牛逼Ø保持与活动翻译的细胞，它是更好的收获米约为70-80％汇合。例如，对于 HEK293T，细胞可以在实验前一天接种在 10 cm（2.2 × 10 6 个细胞）或 15 cm（5.0 × 10 6 个细胞）培养皿中，并在大约 7.0 × 10 6 个细胞/10 cm培养皿中收获或16.0 × 10 6 个细胞/15cm 培养皿。由于不同类型的细胞具有不同的细胞融合多样的翻译活动，我们建议测试收获条件小号实验之前和负载量。
上样样品的最佳 RNA 量为 80-100 μg（灵敏度为 0.5）。万一š其中所述RNA量低于80微克，灵敏度的UV检测器可以被设置为0.2。我们建议您使用200-600微升装载样品的获得理想的和可重复的结果小号。
RNase R 可以消化大多数线性 RNA ；然而，一些具有高度结构化 3' 末端的 RNA 对 RNase R 处理具有抗性。在这种情况下，与K的额外多聚腺苷酸化步骤和替换经修饰的核糖核酸酶ř治疗+与Li +在所述反应缓冲液可用于耗尽线性的RNA（请参阅萧和Wilusz，2019）。另外，不同批次的RNase R活性不同；因此，我们建议您在实验前检查酶的量和反应时间(Zhang , Y. et al ., 2016) 。

食谱

10×polysome 缓冲液
1 M氯化钾
50 mM MgCl 2 ·6H 2 O
0.1 M HEPES (pH 7.4)
无核酸酶水
洗涤缓冲液
1×PBS
100 微克/毫升 CHX
裂解缓冲液
1×polysome 缓冲液
100 单位/毫升核糖核酸酶抑制剂
25 单位/ml DNase I
1× 蛋白酶抑制剂混合物（不含 EDTA）
2 毫米 DTT
0.5%脱氧胆酸钠
0.5% 海卫 X-100
100 微克/毫升 CHX
70% (w/v) 蔗糖溶液
70%(w/v) 蔗糖
1×polysome 缓冲液
用过滤系统过滤
50% (w/v) 蔗糖分级溶液
71.4%(v/v) 70% 蔗糖溶液
1×polysome 缓冲液
100 单位/毫升核糖核酸酶抑制剂
1× 蛋白酶抑制剂混合物（不含 EDTA）
100 微克/毫升 CHX
10% (w/v) 蔗糖分级溶液
1.43% (v/v) 70% 蔗糖溶液
1×polysome 缓冲液
100 单位/毫升核糖核酸酶抑制剂
1× 蛋白酶抑制剂混合物（不含 EDTA）
100 微克/毫升 CHX

致谢
我们要感谢王实验室的所有成员。这项工作得到了中国国家重点研发计划（MOST grant# 2018YFA0107602 to ZW）、国家自然科学基金（NSFC grant #31730110, #91940303, and #32030064 to ZW, #31870814 to YY）的支持, 中国科学院战略重点研究计划（ZW 和YY 授予#XDB38040100）和上海市科委（STCSM 授予#19QA1410500 到YY）。本协议是在杨等人中开发和应用的。(2017)。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的经济利益。

参考

Ashwal-Fluss, R., Meyer, M., Pamudurti, NR, Ivanov, A., Bartok, O., Hanan, M., Evantal, N., Memczak, S., Rajewsky, N. 和 Kadener, S. (2014)。circRNA 生物发生与 pre-mRNA 剪接竞争。摩尔细胞56（1）：55-66。
陈，LL（2020）。环状 RNA 的扩展调控机制和细胞功能。Nat Rev Mol Cell Biol 21(8): 475-490。
Kristensen, LS, Andersen, MS, Stagsted, LVW, Ebbesen, KK, Hansen, TB 和 Kjems, J. (2019)。环状 RNA 的生物发生、生物学和表征。Nat Rev Genet 20(11): 675-691。
Legnini, I., Di Timoteo, G., Rossi, F., Morlando, M., Briganti, F., Sthandier, O., Fatica, A., Santini, T., Andronache, A., Wade, M. ，等人。(2017)。Circ-ZNF609 是一种环状 RNA，可以翻译并在肌生成中发挥作用。 Mol Cell 66(1): 22-37 e29。
Memczak, S., Jens, M., Elefsinioti, A., Torti, F., Krueger, J., Rybak, A., Maier, L., Mackowiak, SD, Gregersen, LH, Munschauer, M.,等. (2013)。环状 RNA 是一大类具有调节效力的动物 RNA。自然495（7441）：333-338。
Pamudurti, N. R., Bartok, O., Jens, M., Ashwal-Fluss, R., Stottmeister, C., Ruhe, L., Hanan, M., Wyler, E., Perez-Hernandez, D. , Ramberger, E.,等。(2017)。CircRNA 的翻译。Mol Cell 66 (1): 9-21 e27。
Rybak-Wolf, A., Stottmeister, C., Glazar, P., Jens, M., Pino, N., Giusti, S., Hanan, M., Behm, M., Bartok, O., Ashwal-Fluss , R.,等。(2015)。哺乳动物大脑中的环状 RNA 高度丰富、保守且动态表达。 Mol Cell 58 (5): 870-885。
Salzman, J.、Chen, R. E.、Olsen, M. N.、Wang, P. L. 和 Brown, P. O. (2013)。环状 RNA 表达的细胞类型特异性特征。PLoS 基因9 ：e1003777。
Salzman, J.、Gawad, C.、Wang, P. L.、Lacayo, N. 和 Brown, P. O.（2012 年）。环状 RNA 是来自不同细胞类型中数百个人类基因的主要转录亚型。PLoS一7 ：e30733。
Sanger, H. L.、Klotz, G.、Riesner, D.、Gross, H. J. 和 Kleinschmidt, A. K. (1976)。类病毒是单链共价闭合环状 RNA 分子，以高度碱基配对的棒状结构存在。Proc Natl Acad Sci USA 73 (11): 3852-3856。
Weigelt, C. M.、Sehgal, R.、Tain, L. S.、Cheng, J.、Esser, J.、Pahl, A.、Dieterich, C.、Gronke, S. 和 Partridge, L. ( 2020）。调节果蝇寿命的胰岛素敏感性环状 RNA 。Mol Cell 79 (2): 268-279 e265。
Xiao, M. S. 和 Wilusz, J. E. (2019)。一种使用 RNase R 纯化环状 RNA 的改进方法，可有效去除含有 G-四链体或结构化 3' 末端的线性 RNA。核酸研究47 (16): 8755-8769。
Yang, Y., Fan, X., Mao, M., Song, X., Wu, P., Zhang, Y., Jin, Y., Yang, Y., Chen, LL, Wang, Y., et阿尔。(2017)。由 N 6 -甲基腺苷驱动的环状 RNA 的广泛翻译。细胞研究 27 (5): 626-641。
Yang, Y., Gao, X., Zhang, M., Yan, S., Sun, C., Xiao, F., Huang, N., Yang, X., Zhao, K., Zhou, H.,等。(2018)。FBXW7 环状 RNA 在抑制胶质瘤肿瘤发生中的新作用。J Natl Cancer Inst 110 (3): 304-315。
Zhang, M., Zhao, K., Xu, X., Yang, Y., Yan, S., Wei, P., Liu, H., Xu, J., Xiao, F., Zhou, H.,等。(2018)。由环状 LINC-PINT 编码的肽抑制胶质母细胞瘤中的致癌转录延长。国家通讯社9 (1): 4475。
Zhang, X. O.、Dong, R.、Zhang, Y.、Zhang, J. L.、Luo, Z.、Zhang, J.、Chen, L. L. 和 Yang, L. (2016)。环状 RNA 的多样化替代反向剪接和选择性剪接景观。基因组研究26 (9)：1277-1287。
Zhang, X. O.、Wang, H. B.、Zhang, Y.、Lu, X.、Chen, L. L. 和 Yang, L. (2014)。互补序列介导的外显子环化。细胞159 (1): 134-147。
Zhang, Y.、Yang, L. 和 Chen, L. L.（2016 年）。环状RNA的表征。方法 Mol Biol 1402 ：215-227。
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