第一部分：病毒转染和纤维植入

材料和试剂

玻璃毛细管（World Precision Instrument，目录号：1B150F-4）
硅胶导管（Dominique DUTSCHER，Bernolsheim，目录号：351070）
注射器 1 ml（Henke-Sass，Wolf，Tuttlingen，目录号：4010.200V0）
注射器 5 ml（Henke-Sass，Wolf，目录号：4050.000V0）
培养皿 100 × 15 mm（Sigma-Aldrich，目录号：P5856-500EA）
植入式光纤套管（Thorlabs，目录号：CFMLC12L02）
光纤（Thorlabs，目录号：FT200EMT）
跳线（Thorlabs，目录号：M83L01）
陶瓷剖分匹配套管（Thorlabs，目录号：ADAL1）
Parafilm（Heathrow Scientific，目录号：HEA234526A）
手术刀片（Swann-Morton，Sheffield，目录号：BS2982）
螺钉（MicroFastenings，目录号：M0.6x1.5）
针 26 G × ½ “（Terumo Medical，目录号：NN-2613R）
针 23 G × 1 ¼英寸（Henke-Sass，目录号：4710006030）
棉签（The Lab Depot，目录号：394305）
缝合套件和缝合线（Péters Surgical，目录号：87001F）
6 孔培养板（Corning，Falcon ® ，目录号：353046）
显微镜载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：LCSF02）
盖玻片（Knittel Glass，目录号：VD12450Y1A.01）
刷子（Henry Schein France，目录号：878-7 825）
1 L溶剂瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：045900）
Whatman ®纸过滤器（GE Healthcare，目录号：1213125）
年轻成年（3 至 4 个月大）C57BL/6 雄性小鼠（法国查尔斯河）
AAV 载体：
AAV-CAMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP（北卡罗来纳大学 (UNC) 载体核心，载体图见 Addgene 质粒 # Plasmid #26969）
AAV-CAMKIIa-ArchT-GFP（北卡罗来纳大学 (UNC) 载体核心，载体图见 Addgene 质粒 # Plasmid #37807）
AAV-CAMKIIa-GFP（北卡罗来纳大学 (UNC) 载体核心，载体图见 Addgene 质粒 # Plasmid #64545）
异氟醚 1,000 mg/g（诱导 4%，维持 1-2%，Iso-Vet）
聚维酮碘（Betadine）
强力胶（乐泰）
液体固定胶：甲基丙烯酸甲酯（Sigma-Aldrich，目录号：M55909-25 ML）
Super-Bond C&B 牙科水泥（Sun Medical，目录号：P021E/0A）
Metacam：美洛昔康 1.5 毫克/毫升镇痛剂（勃林格殷格翰）
Lurocaine：利多卡因 20 毫克（Vetoquinol，法国）
70％乙醇溶液（UNIVAR，目录号：UN1170）
Lacrigel：眼膏（Europhta，法国）
Sulmidol：磺胺吡啶 100 毫克（MSD，santé animale，法国）
过氧化氢（Sigma-Aldrich，目录号：H1009）
磷酸氢二钠，Na 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：S0876）
磷酸二氢钠，NaH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：S0751）
氯化钠，NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：433209）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：441244）
氢氧化钠溶液 1.0 N，NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：S2770）
FluorSave 试剂（默克，目录号：345789）
戊巴比妥钠（0.1 毫升/10 克小鼠体重，Bioveta）
0.1 M PBS（见配方）
0.2 M PB（见配方）
PFA 4%/0.1 M PB 溶液（见配方）

设备

小剪刀（World Precision Instruments，目录号：504615）
刮骨器（World Precision Instruments，目录号：503759）
钻头（RWD Life Science，目录号：78001）
细尖钳（World Precision Instruments，目录号：501975）
带缝合剪刀的持针器（World Precision Instruments，目录号：500023）
螺丝刀（World Precision Instruments，目录号：501635）
紧凑型功率和能量计控制台（Thorlabs，目录号：PM100D）
异氟醚麻醉系统（Datex Ohmeda ISO Isoflurane Anesthesia Vaporizer Tec 7）
移液器拉拔器（Sutter Instrument，型号：P97）
Picospritzer（派克汉尼汾）
理发器（PHYMEP，型号：Contura Shaver）
加热垫（Tem Sega，型号：THERM250）
小鼠立体定位仪（KOPF INSTRUMENTS，型号：942）
双目放大镜（Leica Microsystems，型号：Leica S6E）
灌注泵（Cole- Parmer，型号：Master Flex ® L/S ® ）
Vibratome（Leica Biosystems，型号：Leica VT 1000S）
显微镜（蔡司，型号：Axio Imager A2）
立体坐标中的小鼠大脑，2001
TTL 脉冲发生器（Imetronic，Pessac，法国）

程序

A.玻璃吸管的制备
使用拉拔器拉动玻璃吸管，然后将尖端折断回 10-20 μm 之间的尖端直径。
用病毒溶液（每只小鼠 2 μl）填充玻璃吸管：将一滴病毒放在封口膜纸上，然后将吸管放在立体定位框架上并将其连接到硅胶导管。在双目控制下，轻轻降低移液管直到它接触到液滴并用5毫升注射器轻轻吸出液滴，注意不要吸入空气，然后取出注射器以停止吸液。
每 1 毫米对玻璃移液管进行刻度，对应于 1 μl 的体积。
将装有病毒的玻璃移液管和 Super Bond 容器储存在 4°C。

病毒注入程序
称重鼠标以监测动物术后的健康状况。将鼠标放在麻醉诱导盒 (4% 异氟醚) 中, 直到呼吸减慢 (5 分钟)。然后将其转移到加热垫上并固定在与麻醉面罩相连的立体定向框架的耳杆中（1% 至 2%）；时刻监测呼吸频率，若节律异常增减，需调整麻醉气体流量。脚趾捏鼠标以确认麻醉。
确认麻醉后，腹腔注射美他康（0.2 ml 1:20 稀释），在头皮表面局部注射0.1 ml Lurocaine，并涂上眼膏。
剃掉老鼠的头，然后用棉签和 Betadine 清洁头皮。使在头皮切口水平上的顶部除去组织的与骨刮刀头骨，并通过用棉签涂敷过氧化氢（30％）干燥的颅骨。
通过确保Bregma 和 Lambda 对齐来确认头部的方向。标记 Bregma，然后将一根金属管（如针）连接到立体定向探针支架上，在颅骨上的双侧注射部位的坐标处做一个标记，目标是：
DCA1：二双边位点，1.8到2.5mm前囱后和1.3和2mm的横向中线的，分别。
dCA2 和 dCA3：前囟后 2.0 毫米和中线外侧 2.5 毫米。
最后，钻使用自制的手电钻或电动钻孔。
将含有病毒的玻璃吸管放在第一个孔正上方的立体定位框架中，使其尖端接触头骨的表面。非常轻柔地将移液器降低至 -1.4 mm（dCA1）和 -2 mm（dCA2/dCA3）。
移液器下降后等待 2 分钟，然后使用连接到导管的注射器（图 1），用手施加正压注射 0.2 μl 病毒并检查玻璃移液器刻度。再次等待 2 分钟。
注意：注射后立即取下注射器；否则，注射继续。

图 1. 病毒感染设置和组织学控制的图像。A.包含病毒的玻璃吸管，由立体定位支架维护，可以在图像的左侧部分可视化。它通过软管连接到注射器。B. Ť运算面板：示意性脑图谱（的艾伦脑图谱）表示病毒感染和植入位置。下图：海马背侧 CA1 亚区锥体细胞层上方的病毒感染（绿色 GFP）和植入（箭头）的照片（10 × ）。比例尺：500 µm 。

非常轻轻地提起移液器并用其他四个坐标重复该过程。
用 Betadine 清洁头骨，然后使用针架缝合 2-3 针的皮肤。应用 Betadine、Sulmidol 愈合霜，然后把老鼠放回它的家笼子里。监测每只小鼠两周，直到纤维植入：检查鼠标活动并检查其重量。

纤维植入
两周后，进行新的手术植入光导纤维该目标DCA1，DCA2 ，或dCA3。
首先植入螺钉以提高纤维的稳定性：
在远离纤维坐标的地方钻三个小孔：一个在左上角，一个在左上角中间，一个在头骨的中间底部。
放置三个螺钉，并通过使用强力胶将它们连接起来，将头骨的不同部分固化在一起。滴几滴固定胶使胶水干燥。
将光纤植入物放置在“陶瓷分裂配合套管”中以固定植入物，并在头骨的第一个孔上方，目标是：
dCA1：前后 -1.8 毫米，横向 ± 1.3 毫米。
dCA2：前后 -1.8 毫米，横向 ± 2.1 毫米。
dCA3：前后 -1.85 毫米，横向 ± 2.45 毫米
然后清理凝固的血液，慢慢地将植入物降低到所需的深度；dCA1 (1.4 毫米)、dCA2 (1.7 毫米) 和 dCA3 (1.9 毫米)，然后应用 Super Bond 水泥并等待 15 分钟，直到水泥凝固。轻轻提起纤维支架，并通过确保两根纤维之间有足够的水泥，在另一个位置重复该过程。
使用持针器用两针缝合皮肤。应用 Betadine、Sulmidol 愈合霜，然后把老鼠放回笼子里。监测每只鼠标 10 到 12 天，直到行为测试：检查鼠标活动及其重量。

注射部位和纤维植入组织学控制
È uthanize吨他用过量戊巴比妥（0.1毫升/ 10 G鼠标的小鼠腹腔注射重量，25号针，1-米升注射器）。
将鼠标放在解剖板上，打开肋骨，露出心脏。将连接到导管的针头插入心脏的左心室并夹住。
剪断右心房并打开蠕动泵以灌注冰冷的 PFA 4%/PB 0.1 M 溶液灌注（100 毫升/鼠标，10 毫升/分钟）。
打开头骨以提取大脑。注意硬脑膜。将大脑浸入 PFA 溶液中，并在 4°C 下储存 24 小时。
沿着大脑做一个小切口以标记右侧并将大脑粘在小脑侧的振动板上
从 -0.34 mm 到 -3.6 mm 前后切开 50 μm 的冠状切片，以从背海马体中收集相应的切片（立体定位坐标中的小鼠大脑，2001）。
使用刷子将切口转移到载玻片上，然后滴入 3-4 滴 Fluorsave 试剂。

第二部分：动物DCA1或DCA2 / dCA3活动的光遗传学操作正常发展立法院与PTSD般的记忆
行为程序在 10 至 12 天恢复后开始。

材料和试剂

光纤跳线：直径，200 μm（Doric Lenses，目录号：MFP_50/125/900-0.22_#.#_FC-FC）
光学旋转接头（多立克透镜，目录号：FRJ_1x2i_FC-2FC_0.22）
年轻的成年（3 至 4 个月大）C57BL/6 雄性小鼠（Charles River，目录号：027）
乙醇 70%
乙酸1％（Sigma-Aldrich，目录号：1005706）
皮质酮（2-羟丙基-β-环糊精复合物；Sigma-Aldrich，目录号：C2505）
NaCl (0.9 %)（见配方）

设备

激光（IkeCool OptoDuet 473/593 nm）
担心装备用于光遗传学调节室（OptoPath平台; IMETRONIC，调理，并测试在2个不同的装置）：
第一个室，圆形（直径 20 厘米），不透明 PVC 地板，亮度为 100 勒克斯，每次试验前用 1% 醋酸清洗，用于预曝光，让小鼠适应并熟悉室后来用于音调再暴露测试（图s 2A- 2 B 左）。
第二个房间用于恐惧调节：它是方形的（24 × 24 厘米），有透明的墙壁，亮度为 100 勒克斯（房间内和实验室的光的总和），仪器的门保持开放以访问实验室中不同的视觉空间线索（不同颜色的几何形状），并在每次试验前用 70% 乙醇清洁。腔室的地板由19不锈钢棒（3mm直径），隔开1cm到连接到电击发生器（图小号2A- 2乙右）。该腔室配备了光遗传学：TTL 脉冲发生器，一种激活激光的装置。

软件

恐惧调理笼相关软件：POLY Fear(IMETRONIC)

程序

诱导正常与 PTSD 样恐惧记忆
上下文条件反射任务（图 2A）是一种经典的恐惧条件反射，它在这里使用一个离散的条件刺激（CS），它从不与无条件刺激（US）配对。众所周知，这种 CS-US 取消配对程序会促进对前景上下文的调节，但不会促进对不相关（非预测性）显着 CS 的调节。虽然在接受后调节 (ip) 盐水注射的小鼠（注射了 Veh 的小鼠）中观察到了正常的恐惧记忆，其特征是对调节环境有强烈的恐惧反应，但对无关的语气没有反应，但类似 PTSD 的记忆是在接受后调节皮质酮注射的小鼠（注射 CORT 的小鼠）中观察到：对音调的异常恐惧反应，模仿病理性情绪性记忆过度，与对调节背景的恐惧反应减少有关，揭示了背景性遗忘症（Kaouane等al ., 2012)。使用该模型，我们测试机，在海马抑制是否这不应损害上下文记忆，促进创伤后应激障碍等式车辆（VEH）存储器-injected小鼠形成，而海马活化，有望促进上下文记忆，可以防止PTSD状CORT 注射小鼠的记忆形成（Al Abed等，2020）。

获取恐惧条件反射和光遗传学操作的程序
在恐惧条件反射前 2 天，每天处理每只小鼠 10 分钟（图 2A 第 0 天）。处理的目的是使鼠标习惯于将鼠标连接到调节室中的光纤跳线所需的约束。将鼠标放在一块织物上，轻轻地让它们习惯于通过将手放在动物上、按压植入物、连接跳线等来维持约束。
恐惧调理前一天，将每只老鼠放入带有不透明 PVC 地板的圆形腔室（直径 20 厘米）中 4 分钟，亮度为 100 勒克斯。每次试验前用 1% 乙酸清洁盒子（图 2A 第 1 天，图 2B 左）。这种预曝光使小鼠能够适应并熟悉后来用于音调再曝光测试的腔室。因为小鼠预先暴露在这个房间里，并且在不同的环境中适应（见下文），它在协议的其余部分被称为安全熟悉的房间。
恐惧条件反射的获取（第 1 天）是在不同的环境中进行的，称为条件反射：一个方形的条件反射室（24 × 24 厘米；图 2B 右），亮度为 100 勒克斯，可以访问不同的视觉- 实验室中的空间线索。房间的地板由 19 根不锈钢棒（直径 3 毫米）组成，间隔 1 厘米，并连接到震动发生器。
在放置每只动物之前, 用 70% 乙醇清洁调节室; 气味是上下文线索的一部分。
将每只动物连接到光纤跳线，然后在调节室中放置 4 分钟，在此期间它会收到两个音调 CS（65 dB、1 kHz、15秒）和两个电击美国（平方信号 0.4 mA、50 Hz） , 1 s ) 根据伪随机分布，在我们的实验室中经常使用，并且已知可以促进前景中上下文线索的处理（Desmedt等人，1998 年；Calandreau等人，2006 年和2010 年；Kaouane等人，2012 年） ; Ducourneau等人，2020 年）。具体来说，在放入腔室100秒后，动物会受到电击；然后，在 20秒的间隔后，发出一声提示音；最后，在 30秒延迟后，呈现相同的音调和相同的震动，间隔 30秒。20秒后，将动物放回自己的笼子里。在这个音调-电击解除配对过程中，由于音调永远不会跟随电击传递，动物识别条件环境（构成条件发生的环境的一组静态背景上下文线索），而不是语气，作为冲击的正确预测。
光遗传学操作（从激光双边进行的每植入光纤约 6 mW）在恐惧条件反射期间或 5 分钟前，在注射 Veh 或 CORT 的小鼠中进行，具体取决于组：
Veh 注射小鼠的背海马体抑制：
注射病毒载体 AAV-CamKIIa-ArchT-GFP 或对照载体 AAV-CamKII2a-GFP 的小鼠，因此分别在背海马体中表达 ArchT 通道和 GFP，并在 dCA1 或 dCA2 或 dCA3 中长期植入光纤：为了暂时抑制 dCA1（或 dCA2 或 dCA3）神经元活动，在 4 分钟的条件获取过程中激活激光（连续光传递，526 nm）。
对照实验：小鼠注射病毒载体 AAV-CamKIIa-ArchT-GFP 或对照载体 AAV-CamKII2a-GFP，从而分别表达 ArchT 通道和 GFP。到临时性的抑制神经元DCA1活性，激活相同的持续时间作为调节，在激光即，4分钟，（连续光递送，526纳米），和调理之前执行5分钟。这一步是在家庭笼子里进行的，在一个相邻的房间里，在调理之前，所有组的老鼠都被放置在那里。
先前的观察表明光刺激本身不会影响观察到的冷冻行为。事实上，我们实验室之前完成的光遗传学实验清楚地表明，对照 GFP 小鼠（Laser ON）的冷冻行为不受 dCA1 神经元的光刺激的影响（Sellami等，2017）。因此，本程序中的对照小鼠在背海马体中表达 ArchT 通道和 GFP，并在 dCA1 中长期植入光纤，但在激光关闭的情况下接受恐惧条件反射程序。
CORT 注射小鼠的背海马体激活：
注射病毒载体 AAV-CamKIIa-ChR2-EYFP 或对照载体 AAV-CamKII2a-EYFP 的小鼠，因此分别在背海马体中表达 ChR2 通道和 EYFP，并在 dCA1 中长期植入光纤：以暂时激活dCA1 神经元活动，在 4 分钟的条件采集期间激活激光（光，473 nm，以 5 Hz 的频率传送：5 ms激光打开，195 ms激光关闭）。
注射病毒载体 AAV-CamKIIa-ChR2-EYFP 或对照载体 AAV-CamKII2a-EYFP 的小鼠，因此分别在背海马体中表达 ChR2 通道和 EYFP，并在 dCA1 中长期植入光纤：以暂时激活dCA1神经元活动，激活激光（光，在 473 nm，以5 Hz 的频率传递：5 ms激光打开，195 ms激光关闭）在 4 分钟内开始调节前 5分钟。
注射病毒载体 AAV-CamKIIa-ChR2-EYFP 或对照载体 AAV-CamKII2a-EYFP 的小鼠，因此分别在背海马体中表达 ChR2 通道和 EYFP，并在 dCA1 中长期植入光纤激光关闭时的调节程序。

皮质酮与 NaCl 的后调节全身注射
皮质酮（2-羟丙基β环糊精复合物; 2.5毫克/公斤的0.1毫升/10克体重的体积）或载体（0.9％的NaCl）中的溶液腹膜内给药升采集恐惧条件之后立即Y（IP）。皮质酮与环糊精的复合物允许将这种类固醇溶解在水溶液中。注射后，将动物放回它们的笼子里。皮质酮的剂量是根据先前的结果选择的，这些结果表明该剂量 (i) 在血浆中应激诱导的浓度范围内（Pugh等人，1997 年；Cordero 和Sandi，1998 年）和（ii）有效当使用相对较高的足震强度（平方信号，0.4 mA；Kaouane等人，2012 年）与恐惧条件相结合时，可在小鼠中诱导 PTSD 样记忆。

第 2 天：记忆测试
获得恐惧条件反射后 24 小时，小鼠接受两次记忆保持测试（图 2A，第 2 天）。在这两次记忆测试期间，由实验组的盲人观察者连续记录动物的离线逐秒冻结评分。动物的冻结行为被定义为除了与呼吸相关的运动之外没有所有运动，并被用作条件恐惧反应的指标。

图 2. 分别通过在压力期间抑制 dCA1 和在创伤条件下激活 dCA1 来诱导或预防 PTSD 样记忆形成。A.小号cheme表示光遗传学方法，习惯化，以及处理（第0天），情景恐惧条件（第1天）和存储器测试（第2天）：再次接触在熟悉的（中性）腔室单独的色调（灰色圆形室），然后在 2小时后进入调理环境。与正常记忆（在注射 Veh 的小鼠中）相比，PTSD 样记忆形成（在注射 CORT 的小鼠中）与海马体功能减退有关。因此，我们使用光遗传学操作研究了海马活动在 PTSD 样记忆形成中的因果关系。乙。P的的hotographs 2个使用腔室：熟悉的安全室（圆形，左图）和调节的情况下（正方形，右图）。Ç 。与正常的情境恐惧记忆相比，车辆注射小鼠（激光关闭，n = 15 ），（激光关闭，n = 13）CORT 注射小鼠中的PTSD 样记忆通过特定于音调的恐惧反应来证明（音调测试期间冻结的重复测量（RM）：F 2,24 = 35.908；P <0.0001;音比VS 。0; P <0.0001）与恐惧降低到上下文相关联。当 NaCl 被 HBC 代替作为载体时，观察到组之间的相似差异 [数据未显示]。条件反射期间的 dCA1 抑制在注射 Veh 的小鼠中产生类似 PTSD 的记忆（n = 13；RM x激光条件：F 4,76 = 20.184 ；P < 0.0001）。尽管所有组在熟悉的房间中都显示出相对较高的预音冻结水平，但这些水平低于调节室中表达的水平（左与右：所有F > 6.29，所有P < 0.028）。d 。与对照（激光关闭；n = 11）注射 CORT（PTSD 样）的小鼠相比，注射 CORT 的小鼠在调节期间接受 dCA1 激活（n = 11）显示标准化（上下文）恐惧记忆（RM x激光条件：˚F 2,40 = 15.684; P <0.0001数据显示为平均值±SEM ***。P <0.005 ###：块。×条件交互作用（P选自Al阿贝德改编<0.005）。等人。（2020 ）.

小鼠首先在安全熟悉的室（提交色调重新暴露试验即，轮腔）。在放置每只动物之前, 用 1% 醋酸清洁测试室。音调测试持续 6 分钟，音调呈现为 2 分钟。量化行为反应的三个连续部分：一个之前（前 2 分钟），一个在语气呈现期间（接下来 2 分钟），一个之后（最后 2 分钟）。对语气的条件反应由语气呈现期间的冻结百分比与语气呈现前后表达的冻结水平相比（对三个冻结块的重复测量）表示。这种条件恐惧的强度和特异性通过一个比率来证明，该比率考虑了相对于基线冻结水平（即，前和后音期间平均值）的语气的冻结增加百分比。与音调呈现期间表达的冻结水平相比，对离散音调 CS的强烈且特定的条件恐惧意味着在未预期电击时（即，音调呈现前 2 分钟和音调呈现后 2 分钟）的冻结水平较低（高比率）价值）。音调比率计算如下：[音调呈现期间的冻结百分比-（音调前冻结百分比+音调后期冻结百分比）/2]/[音调呈现期间冻结百分比+ （音调呈现期间冻结百分比+ %后调期冻结）/2]。
两小时后，小鼠接受上下文再暴露测试：它们被放置在调节室中 6 分钟。在放置每只动物之前, 用 70% 乙醇清洁调节室。冻结到上下文计算为在测试的连续三个 2 分钟时段期间冻结总时间的百分比。虽然第一个块是证明适应条件环境的动物与不适应或更少条件的动物之间的差异的关键块，但提出以下两个块是为了评估在没有休克的情况下恐惧反应的逐渐消失。
正常的情境恐惧记忆通过对条件情境的高度条件恐惧（电击的正确预测因子）以及对非预测语气的条件恐惧的缺失来证明。相比之下，适应不良的 PTSD 样恐惧记忆由相反的结果模式证明，表明错误选择了语气而不是上下文作为震惊的预测指标：对语气的异常恐惧反应与减少的条件恐惧相关联上下文（Kaouane等人。，2012）。
在保留测试之后，对小鼠实施安乐死以验证注射和纤维植入部位（参见第 I 部分程序 D）。
从保留测试所获得的结果在图呈现小号2C和2 d （图适于选自Al阿比德等人，2020）。

第三部分：通过在原始创伤情境中重新激活创伤记忆来重新情境化，从而治愈类似 PTSD 的记忆

材料和试剂

光纤跳线：直径，200 μm（Doric Lenses，目录号：MFP_50/125/900-0.22_#.#_FC-FC）
光学旋转接头（多立克透镜，目录号：FRJ_1x2i_FC-2FC_0.22）
年轻的成年（3 至 4 个月大）C57BL/6 雄性小鼠（Charles River，目录号：027）
乙醇 70%
乙酸1％（Sigma-Aldrich，目录号：1005706）
皮质酮（2-羟丙基-β-环糊精复合物；Sigma-Aldrich，目录号：C2505）
NaCl (0.9%)（见配方）

设备

激光（IkeCool OptoDuet 473/593 nm）
担心装备用于光遗传学调节室（OptoPath平台; IMETRONIC，调理，并测试在2个不同的装置）：
第一个室，圆形（直径 20 厘米），不透明 PVC 地板，亮度为 100 勒克斯，每次试验前用 1% 醋酸清洗，用于预曝光，让小鼠适应并熟悉室后来用于音调再曝光测试。
第二个房间用于恐惧调节：它是方形的（24 × 24 厘米），亮度为 100 勒克斯，可以访问实验室中不同的视觉空间线索（不同颜色的几何形状）并用清洁剂清洁每次试验前加入 70% 乙醇。房间的地板由 19 根不锈钢棒（直径 3 毫米）组成，间隔 1 厘米，并连接到震动发生器。该腔室配备了光遗传学：TTL 脉冲发生器，一种激活激光的装置。
恐惧调节室也用于第 3 天创伤记忆的重新情境化。在此过程中，腔室中会出现语气。

软件

恐惧调理笼相关软件：POLY Fear(IMETRONIC)

程序

PTSD 样记忆的重新情境化促进了其正常化。
创伤的脱离语境存储器，与创伤的意识回忆的系统避免相关联，将有助于在安全的情况下（在创伤的侵入再经历即，倒叙）表征PTSD（范德科尔克等人，2001; Bremner等人，2003 年；Brewin 和 Holmes，2003 年）。因此，PTSD 的治疗意味着从脱离情境的侵入性创伤记忆转变为正常的、情境化的恐惧记忆。因此，我们推断，再次接触最情绪载货创伤线索（即，在我们的研究中音）在外伤情况下，不仅可以激活创伤记忆，也促进创伤的重新语境，从而治愈创伤后应激障碍样记忆。
参见第 II 部分，程序 A、1-3 和皮质酮或 NaCl 的后调节注射（第 1 天）
参见第二部分，程序 A，记忆测试（第 2 天），1-3。
恐惧条件反射后两天和经典记忆测试后一天（第 3 天），将（注射 Veh 和 CORT 的）动物重新暴露在条件反射环境中的音调提示中，并记录连续三个阶段的行为反应：一个之前（前 2 分钟）、期间（下 2 分钟）和之后（最后 2 分钟）音调呈现。因此，前 2 分钟（前音）允许我们单独评估条件性恐惧的程度，而在接下来的 2 分钟内评估条件性对语气的反应，两者都通过语气期间冻结的百分比演示和上述色调比。
设计了三种控制条件：
Veh-和CORT注射的小鼠再-暴露在音单独（在熟悉的情况下）
Veh-和CORT注射的小鼠被重新-暴露于单独的调节范围内
Veh-和CORT注射的小鼠中重新-暴露既给音调和上下文，但在2小时间隔开
在第 4 天，通过使用第 2 天使用的经典记忆测试，评估由这些不同的再暴露条件对创伤相关刺激产生的恐惧记忆的质量。
从每个重新曝光条件的动物是第一重-暴露到在熟悉的上下文中的音调的提示。
从每个重新曝光条件动物然后重新-暴露于所述调节上下文2小时后。
虽然对语气的异常恐惧反应加上对上下文的低条件恐惧会证实类似 PTSD 的记忆，但对语调没有条件恐惧加上对上下文的高度条件恐惧将证明创伤记忆的正常化。图 3，改编自 Al Abed等人，2020 年）。

图 3.通过创伤重新情境化从类似 PTSD 的记忆切换到正常的恐惧记忆。顶部面板，行为程序的方案说明：恐惧条件反射（第 1 天）、记忆测试（第 2 天）、通过完全重新暴露于创伤相关线索（即，条件反射环境中的语气与部分重新暴露于单独的语气、单独的上下文或间隔 2 小时的语气和上下文；第 3 天），记忆测试（第 4 天）。一个。创伤重新情境化的疗效，从第 3 天的 PTSD 样记忆转变为第 4 天的正常情境记忆：在注射 CORT 的小鼠中完全重新暴露于与创伤相关的线索，消除了对音调的异常恐惧反应并使其正常化的条件性恐惧到上下文（VEH VS 。CORT ：纳秒）。乙。在第 3 天部分地重新暴露于与创伤相关的线索（即，音调和上下文间隔 2 小时）不会改变注射 CORT 的小鼠的 PTSD 样记忆特征，它们仍然显示出对音调的异常恐惧反应具有低条件恐惧的在乐音试验第4天（最小意义的上下文：重复测量× VEH / CORT：˚F 2,36 = 4.755; P = 0.0147;在上下文测试：VEH / CORT ：˚F 1,18 = 4.570；P = 0.0465）。在部分重新暴露于单独的音调或单独的上下文后获得了类似的结果（数据未显示，参见 Al Abed等人，2020 年）。注射 CORT 的小鼠区分使用的两种环境，这证明了它们在调节环境中比在熟悉的房间中的冷冻水平更高（前 2 分钟，2a与2b；F 1,17 = 7.166；P = 0.0159）。蓝色和灰色条分别代表条件反射环境和熟悉/安全室；Pre-T：预调；后T：后音。数据表示为平均值±SEM。* P < 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.005。#: 块 x 条件交互 ( P < 0.05); ## P < 0.01；### P < 0.005。改编自 Al Abed等人。，2020 年。

dCA1 神经元在创伤记忆的重新情境化过程中的光遗传学抑制抑制了其正常化。
参见第一部分：病毒转染和纤维植入。
仅在注射 CORT 的小鼠中重复第三部分、程序 A、1-3。
当将注射 CORT 的动物放入调节室进行重新背景化程序时，将每只动物连接到光纤跳线以进行光遗传学操作（从激光双边进行的每植入光纤约 6 毫瓦）。
在背海马体中表达 ArchT 通道和 GFP 并在 dCA1 中长期植入光纤的小鼠中，在 6 分钟的重新背景化过程中，通过激活激光（连续光传递，526 nm）暂时抑制 dCA1 神经元活动。
在背海马体中表达 ArchT 通道和 GFP 并在 dCA1 中长期植入光纤的对照小鼠中，在重新背景化过程中保持激光关闭（图 4，改编自 Al Abed等人，2020 年）。

图 4. 创伤再情境化依赖于海马体，并且长期存在。顶面板，行为过程的方案说明：恐惧条件（第1天），存储器测试（第2天），创伤重新语境（REC）由完整的重新暴露于创伤相关的线索（即，在调节色调背景；短期：第 4 天，长期：第 30 天）在再暴露期间暴露于 dCA1 抑制的对照注射 CORT 和注射 CORT 的小鼠，记忆测试（第 4 天）。A.在第 3 天完全重新暴露于创伤相关线索期间的 dCA1 抑制阻断了这种重新暴露的疗效：与它们的对照（PTSD 样）重新暴露于激光关闭（ReC；n = 6）相比，激光开启（n = 7）的PTSD 样重新暴露动物仍然对音调表现出异常的恐惧反应（重复测量x激光条件：F 2,24 = 6.452 ；P = 0.0057）以及对环境的低条件恐惧背景（激光条件：F 1,12 = 6.922；P = 0.0219）在第 4 天和第 30 天（右图）。B.部分重新暴露于创伤相关线索（语气和上下文间隔 2 小时）后剩余的 PTSD 样记忆长期持续存在（语气测试中的最小显着性：重复测量x Veh/CORT：F 2,34 = 7.935；P = 0.0015；在上下文测试中：Veh/CORT ：F 1,17 = 4.607；P = 0.0466，重复测量x Veh/CORT：F 2,34 = 4.266；P = 0.0022）。在部分重新暴露于单独的音调或单独的上下文后获得了类似的结果（此处未显示数据，参见 Al Abed等人，2020 年）。统计显着性通过重复测量（三个 2 分钟块）2 侧方差分析与事后检验在适当时进行评估。* P < 0.05；** P < 0.01；*** P < 0.005。#: 块 x 条件交互 ( P < 0.05); ## P < 0.01；### P < 0.005。Pre-T：预调；后T：后音。数据表示为平均值± SEM。

PTSD 样和正常化的恐惧记忆是持久的
复制第三部分，程序 A 和 B。
Ť o评估的PTSD状存储器和归一化恐惧记忆从不同再曝光条件，以外伤相关的刺激而产生的持久性，提交动物使用（再暴露于单独的音调经典存储器的测试中，然后向仅调节上下文）恐惧调节后 30 天。通过完全重新暴露于创伤相关线索（即，第 3 天调节环境中的语气），创伤重新情境化对 PTSD 样记忆的疗效被证明是持久的（图 4A，右图）。类似地，在经受低效的部分再暴露（即，仅语气、仅语境或语气和语境间隔 2 小时）后，在第 4 天仍显示出类似 PTSD 的恐惧记忆的动物，或再语境会话期间DCA1细胞的光遗传学抑制，仍然显示PTSD状第30天存储器（图小号4A和4 B，右图）。

数据分析

使用方差分析 (ANOVA) 进行统计分析，然后在适当时使用Fisher PLSD事后检验。使用StatView软件进行分析。统计显着性被认为是P < 0.05。所有实验至少成功复制一次。
所有数据均可在原始论文的正文或补充信息中获得（Al Abed等，2020）。支持本研究结果的源数据可根据合理要求从通讯作者处获得。支持本研究结果的源数据可从以下地址获得：https : //doi.org/10.6084/m9.figshare.12644849。

食谱

0.1 M PBS
Na 2 HPO 4 11.36 克
NaH 2 PO 4 2.4 克
氯化钠 0.9 克
加入 ddH 2 O 制成 1 L 溶液并保存在 4°C
0.2M PB
Na 2 HPO 4 22.72 克
NaH 2 PO 4 4.8 克
加入 ddH 2 O 制成 1 L 溶液并保存在 4°C
PFA 4%/0.1 M PB 溶液
要储存溶液，您需要准备 8% PFA 溶液：
将 80 克 PFA 粉末与 600 毫升 dH 2 O 混合并加热至约 70°C，直至粉末溶解（至少 120 分钟）
加入几滴NaOH溶液使溶液透明
使用 Whatman ®纸过滤器过滤溶液
调整体积至1升与卫生署2 O和它在4℃下保存（对于一个最大15 d）
当需要使用 PFA 4%/0.1 M PB 溶液时，用 0.2 M PB 稀释溶液
氯化钠 (0.9%)
氯化钠 0.9 克
加入 ddH 2 O 制成 1 L 溶液并保存在 4°C

致谢

我们感谢 Neurocentre Magendie 动物设施的所有人员对小鼠的护理。我们感谢 Cyril Herry (Neurocentre Magendie) 在我们实验室开发光遗传学工具。这项工作得到了国家科学研究中心、国家医学研究所、法国研究基金会、阿基坦地区委员会、法国大学高等科学研究所的支持波尔多和 Agence Nationale pour la Recherche Grant PTSDmemo (ANR-14-CE13-0026-01)，以及 EquipEx Grant OptoPath (ANR-10-EQX-008-1)。
该协议用于获取发表在 Nature Communications 上的数据（Al Abed等人，2020 年）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有实验程序均按照欧洲实验动物护理和使用指令（2010-63-EU）和波尔多大学动物实验委员会发布的动物护理指南（CCEA50，协议编号A33-O63-099；授权编号 01377）。

参考

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