材料和试剂

细胞培养试剂
1. T-175 cm 2烧瓶（Greiner，Cellstar ，目录号：660175）
2.来自脐带沃顿氏胶 (hMSCs) 的人类间充质基质细胞，购自美国典型培养物保藏中心 (ATCC) (ref #PCS-500-010)
3. α -改良的 Eagle 培养基（α -MEM）（Life Technologies，目录号：32561-029）
4. TrypLE TM Express （Life Technologies，目录号：12604013）
5.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma - Aldrich，目录号：D8662）
6.胎牛血清（FBS）（Life Technologies，目录号：10500-064）
7.青霉素-链霉素（p en-strep）（Life Technologies，目录号：10378-016）
8. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
9.超低熔点琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A5030）
10.多聚甲醛（PFA），16％（Alpha Aesar，目录号：43368）
11.小鼠抗人 CD146 - Alexa Fluor 647（克隆 P1-H12）（BD Biosciences，目录号：563619）
12.兔抗- COX-2多克隆抗体（Abcam公司，目录号：ab15191）
13.兔抗人VEGF-A单克隆抗体（Abcam，目录号：ab52917）
14.小鼠抗人RUNX-2单克隆抗体（Abcam，目录号：ab76956）
15. Alexa Fluor 488 偶联山羊抗小鼠 IgG2a 二抗（Life Technologies，目录号：A-21131）
16. Alexa Fluor 594 -偶联山羊多克隆抗兔 IgG 二抗（Life Technologies，目录号：A-11012）
17. DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：10236276001）
18. Vybrant TM多色细胞标记试剂盒（Life Technologies，目录号：V22889）
19. hMSC 培养基（见配方）
20.染色缓冲液（见配方）
21. CD146 染色液（见配方）
22.固定液（见配方）
23.琼脂糖溶液（见食谱）
24.通透缓冲液（见配方）
25.阻塞缓冲区（见食谱）
26. 一抗溶液（见配方）
27.二抗溶液（见配方）

用于微细加工和微流体的材料
黄铜板 (5 × 5 cm)
干膜光刻胶：Eternal Laminar E8020、Eternal Laminar E8013（Eternal Materials）和 Alpho NIT215（Nichigo-Morton）
K 2 CO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：P5833）
聚（二甲基硅氧烷）（PDMS）（道康宁，目录号：SYLGARD 184）
3M TM Novec TM 1720 电子级涂层 (3M)
3M TM Fluorinert TM电子液体 FC-40 (3M)
PEG-di-Krytox（RAN 生物技术）

设备

细胞培养设备
CO 2培养箱（粘合剂，CB 170）
细胞分选仪（流式细胞仪）（BD Biosciences, FACSAria III ）

微加工和微流体设备
办公室覆膜机（PEAK、pro PS320）
紫外线灯（滨松、Lightningcure）
微型铣床（Minitech Machinery、CNCMini-Mill/GX）
等离子清洁器（Harric，PDC-32G ）
100 μ l 和 1 ml玻璃注射器（SGE、分析科学、气密鲁尔锁注射器）
1 ml l塑料注射器 (Terumo, SS+01T1)
注射泵（neMESYS 低压注射泵，Cetoni GmbH）

显微镜
电动宽视场显微镜（Ti，Eclipse，Nikon），配备 CMOS（互补金属氧化物半导体）相机（ORCA-Flash4.0，Hamamatsu），荧光发光二极管源（Spectra X，Lumencor）和具有 4 毫米工作距离（超长工作距离）和 0.45 数值孔径 (NA)的 10 ×物镜（Plan Apo λ ，尼康）
电动（Ti2，尼康）共聚焦旋转圆盘显微镜，配备激光器（W1，横河）以及与上述相同的相机和物镜

软件

MATLAB (r2016a, MathWorks, Natick, MA)
程序

微流控芯片的微加工
1.可以在Amselem等人中找到有关芯片制造的详细协议。（2018 年）。该芯片包括的两个部分：1）顶部部分包括流动聚焦结，蛇纹石，发散轨道，和一个培养腔室中。模具是使用干树脂制造的，这些树脂经过蚀刻以通过标准软光刻法产生液滴发生器和引导通道的形状。2) 芯片底部由 270 个六边形毛细管阱阵列组成。芯片底部的模具是通过微铣削黄铜板制成的。特征的几何形状和尺寸可以在Sart等人中找到。（2020 年）（图 1 ）。

图 1. 不同区域的芯片设计和深度。1 、含有细胞和培养基的水相进样口；2 、交界处注油口；3 、注油口，推动捕集室内的液滴。

2.通过将聚二甲基硅氧烷 (PDMS)（90% 的基础和 10% 的固化剂的混合物）浇铸到模具中来制造芯片的顶部和底部。
3.将两个模具放在 80 °C的烘箱中 2小时，以促进 PDMS 的聚合。
4.提取从模具芯片的两个部分，并用手术刀切割它们。
5.通过使用等离子清洁器将两个表面粘合40秒来组装芯片的两个部分。
6.用 Novec 冲洗芯片并在 110 °C 下加热三个循环，使芯片内壁具有亲氟性。

细胞培养，分拣，和装载在微流体液滴
培育的hMSCs使用hMSC的培养米ë dium ，从通道2至7在常规T-175厘米2个烧瓶，并将其放置在一个培养箱中，在37建立℃下和5 ％CO 2 。
将细胞以 5 × 10 3细胞/cm 2的密度接种到烧瓶中，每周使用 TrypLE 进行传代，每 2 天更换一次培养基。
或者，通过流式细胞术根据 CD146 的表达水平对 hMSC 进行分类。CD146 是未分化状态的标志物，其表达水平在分化时降低（Sacchetti等，2007）。为了分离 CD146暗淡和 CD146明亮的hMSC，将细胞（第 5 代）从烧瓶中分离出来，并用CD146 染色溶液将它们孵育30 分钟。用过滤缓冲液清洗细胞。识别并通过使用绘图FSC-A和SSC-A信号选择的hMSC人口的流式细胞仪。通过对通过绘制 FSC- H与 FSC- A信号获得的主要群体进行门控来消除细胞双峰。从这个选定的群体中，绘制 FITC-A（或任何未标记细胞的荧光染料）与 Alexa-647-A 信号分布的关系图；用细胞仪分析 CD146 表达的扩散，并分选 25% 的最亮的细胞和 25% 的最暗的细胞。
将两个1毫升注射器containi毫微克1％在FC-40的溶液，以入口RAN＃3和＃2，数据块入口＃1，然后在50冲洗每个注射器的油μ升/分钟，以除去所述空气从所述芯片（图 2，步骤 1 ) 。
加载悬架6的× 10 6块体或50:50的混合CD146暗淡和CD146亮sorted-的hMSCs /毫升补充有在培养基琼脂糖溶液为100 μ升玻璃注射器。
将此注射器连接到入口 #1（图 2，步骤 2 ）。
适用的8-8.5流速微升/ min至注射器1和11的流速μ升/ min至注射器2含有细胞的溶液的交界处被夹持。这导致形成单分散液滴，每个液滴包含约 380 个细胞的悬浮液（图 2，步骤 2 ）。
在注射器 3 上应用 50 μl /min 的流速：液滴被推到导轨上，在培养室中均匀地引导它们。然后液滴被毛细管捕集器捕获（图 2，步骤 2 ）。
停止注射器 #1 的流动，并将 100 μl /min 的流速应用于注射器 #2 和 #3，以去除培养室中多余的非锚定液滴（图 2，步骤 3 ）。
停止油流；细胞在水滴底部安定下来并开始聚集。

图 2. 细胞加载和液滴形成的协议

微流体液滴中的球体形成和培养
将芯片放入 CO 2培养箱过夜，让细胞形成球体（图 3 和视频1 ）。

图 3.微流体液滴中 MB 形成的动力学。停止油流后，细胞被允许沉降到液滴的底部，在那里它们开始聚集。细胞通过实时成像连续监测，同时形成 MB。小号Cale的巴= 100 μ米。

视频 1. MB 的 3D 形态。在液滴的MB是由经受再循环施加的它们周围的油流。该协议允许 MB 绕其轴旋转。这部电影展示了 MB 的 3D 结构组织。

上吨他第二天，将芯片在4 ℃下30分钟，以胶凝琼脂糖。
用 1 ml 纯 FC-40 油以 80 μl /min 的速度冲洗芯片，以稀释表面活性剂。
通过将水溶液缓慢流入设备中, 用培养基替换油相。在这个阶段，3D 聚集体被水凝胶机械地保留在陷阱中。它们可以定期用培养基灌注；因此，他们现在已经准备好长-长期培养，而其余的完全可行的（萨尔特等，2020）。

微流体液滴内的球体标记和成像
要询问 MB 内的结构组织：
标记 CD146暗淡- 和 CD146明亮- hMSCs 与 Vybrant DiO（绿色）或 Vybrant DiD（红色）染料（5 μl用于 1 ml培养基）30 分钟，然后将它们加载到微流体滴中。
注：CD146 蛋白和 Vybrant 染料可溶于 Triton-X 100 溶液；因此，该协议不允许将免疫染色与检测不同的 CD146 亚群结合起来。
球状体形成和培养后，图像使用荧光显微镜的MB（例如，宽-场或者配备有大的工作距离的物镜共焦显微镜）（图4 ）。

图 4. MB 内CD146暗淡和 CD146明亮hMSC 的空间组织。CD146暗淡和CD146亮通过细胞分选，然后用标记的分离Vybrant细胞DIO（绿色）或Vybrant细胞DiD的（红色）之前将其装载到滴染料。小号Cale的棒= 100微米。

询问的MB内的功能单位（例如。，VEGF-A的表达区域，COX-2 ，或RUNX-2）：
通过灌注200的溶液固定的MB μ升的固定溶液，通过第一填充1米升塑料注射器与PFA，然后在80的流速流动微升/分钟。
在室温下用 PFA 溶液孵育 hMSCs 的聚集体 30 分钟。
在相同的流速（200用PBS洗培养室μ升在80 μ升/分钟）。
在80灌注透化的MB μ升/分钟与200 μ升的透化缓冲液中，并孵育5分钟。
（200用PBS洗培养室μ升在80 μ升/分钟）。
块的MB通过灌注的一个阻挡buffe - [R （200 μ升在80 μ升/分钟）孵育30分钟。
（阻塞，灌注腔室与初级抗体溶液后例如，抗- COX-2或抗VEGF-A抗体或抗RUNX-2 ; 200 μ升在80 μ升/分钟），并孵育˚F或4小时。
由（200灌注PBS洗一次抗体溶液μ升在80 μ升/分钟）。
灌注二抗溶液（200微升，80微升/分钟）并孵育 1小时30分钟。
洗涤用PBS（200 μ升在80 μ升/分钟）。
使用荧光显微镜对陷阱中的 MB 进行成像（图 5 ）。
为了验证一抗的特异性，只用二抗孵育样品，然后用 PBS 清洗。荧光信号的缺失证实一抗对其靶标（即，VEGF-A）具有特异性，并且用PBS漂洗有效地洗涤了过量的抗体（Sart等人，2020）。
为了验证不存在扩散限制，请省略封闭步骤并仅与二抗一起孵育。聚集体内均匀的荧光信号分布证明没有扩散限制（Sart等人，2020 年）.

图 5. MB 内的功能组织 hMSC：通过免疫染色检测 VEGF-A 表达。RUNX-2 和 COX-2 免疫染色获得了类似的结果（Sart等，2020）。比例尺 = 100 μ m。

数据分析

数据分析的目的是使用图像分析提供间充质体内结构和功能组织的定量表征。在以下实验中，数据是从在至少三个不同芯片中复制的大约270 次重复中生成的。
A.使用 Matlab ®量化 MB 内的结构组织
关于数据分析的详细信息可以在Sart等人中找到。（2017 年）。
确定每个球体的质心。
测量每个球体的面积 (A) 。
计算每个球体的半径 R，定义为 A/ π 的平方根。
测量Vybrant DiO（绿色，对应 CD146暗淡hMSC）或 Vybrant DiD（红色，对应 CD146亮hMSC）染色细胞的每个像素的荧光强度，以及它们到质心的归一化距离 (r/R) （图小号6A和6乙）。
将特定 (r/R) 处的荧光值分箱。
将两个荧光信号针对 DAPI 信号标准化，以考虑到聚集体的球形形状。
两种不同荧光信号的相对强度表明了MB 内不同半径的 CD146暗与 CD146亮hMSC的相对丰度（图6C ）（Sart等人，2020）。

图 6.量化 MB 结构组织的数据分析方法。(A)细胞分选产生了 CD146暗淡和 CD146明亮种群的分离。（B）P CD146的荧光信号的osition暗淡和CD146亮标记Vybrant细胞DIO（绿色）或Vybrant细胞DiD的（红色）通过它们的径向坐标（r / R）来标识。小号Cale的棒=100μm的。（C）的定量的不同CD146人口分布小号的MB内，基础计算的径向坐标。C 部分摘自 Sart等人。（2020 年）。

B.使用 Matlab ®用 MB 量化功能组织
关于数据分析的详细信息可以在Sart等人中找到。（2020 年）：
识别 DAPI 染色核的每个局部最大值（图 7A ）。
通过绘制每个相邻局部 DAPI 最大值之间的线段的垂直平分线来构建 Voronoi 图（Chang等人，2007），其近似于MB 内的单元形状（图 7A ）。
确定聚合内每层单元格的位置（图 7 B ）。
量化蜂窝细胞质荧光信号（COX-2，VEGF-A ，为的MB（中的每个小区和RUNX-2）图7 Ç ）。
将每个细胞的荧光信号与其在 MB 中的细胞层位置相关联（图 7 D ）。为了说明整个细胞（包括细胞核）的细胞质信号的可变性，单个细胞的荧光信号被定义为相应 Voronoi 细胞的 10% 最高像素的平均信号（Sart等人，2020 年）.
Bin 特定细胞层s的荧光值。

图 7. 量化 MB 功能组织的数据分析方法：VEGF-A 空间分布。（A）d etecti纳克的DAPI信号使绘制荷兰国际集团Voronoi图，它允许estimat荷兰国际集团的所占面积通过在聚集体的每个小区。(B)每个单元格的位置都分配给一个层号。(C)测量从 Voronoi 图定义的每个单元格中的荧光强度。(D)每个细胞中感兴趣的蛋白质的荧光强度与 MBs 内的细胞位置 (层数) 相关, 这允许映射MBs 内的细胞功能。对于RUNX-2和COX-2免疫染色，获得类似的结果（Sart的等人，2020）。

结果表明 hMSCs 以分层方式自组织：大多数未分化的 MSCs 位于核心，而部分定型的细胞位于 MBs 的边界（图 6 ）。此外，我们发现与骨内分泌功能的诱导相关（这样的结构组织即，COX-2和VEGF-A表达）（图7和萨尔特等人，2020年RUNX-2和COX-2）。

食谱

要准备的hMSC的培养基：
将 50 ml FBS 和 5 ml p en-strep (100X)与500 ml α -MEM 基础培养基混合，从而产生含有10% (v/v) FBS 和 1 X p en-strep的培养基。
准备染色缓冲液：
将 200 μl的 FBS 与 9.8 ml 的PBS 混合，从而在 PBS 中生成 2% FBS (v/v)溶液。
制备CD146 染色溶液：
混合10微升的Alexa氟647-缀合的抗CD146抗体原液与990微升染色的缓冲，这将导致1：100稀释的CD146抗体溶液。
制备固定溶液：
将 1 ml PFA 库存溶液（16% ，v/v ）与 3 ml PBS 混合，得到 4% PFA (v/v)溶液。
制备琼脂糖溶液：
称取 30 毫克琼脂糖粉并将其与 1 毫升 PBS 混合。地方个是在80℃下至少一小时的烘箱组解决方案，为了以熔化AG一个玫瑰。它导致一个液体琼脂糖溶液在浓度3 ％（W / V）。前小区负载在以滴，混合30微升的3％（W / V）琼脂糖溶液与70微升含有介质的6×10 6细胞。这导致溶液中含有浓度为 6 x 10 6细胞/ml 的细胞和 0.9% (w/v) 的琼脂糖。
准备渗透缓冲液：
混合5 00微升的的Triton-X100用10ml PBS ，该结果在一个透化缓冲液含0.5％的Triton-X100（V / V）。
准备 b锁定缓冲区：
混合500微升FBS与9. 5米升PBS，这导致bolocking缓冲器缓冲含5％FBS（V / V）溶液。
准备初级抗体溶液：
将 10 μl一抗原液（抗 COX2、抗 VEGF-A 、抗 RUNX-2）与 990 μl染色缓冲液混合，得到 1:100 稀释的一抗溶液。
制备二次抗体溶液：
混合10微升的Alexa氟594缀合的二级抗体原液和2 0微升DAPI溶液在1 4 μ中号（从制备5毫克DAPI再悬浮于1 0 ml的PBS，其股票溶液（1 。4毫摩尔），然后在稀释1：100 ，即1 0微升到990微升PBS ），用9 7 0 μ染色缓冲液升，这导致了1：100稀贡献的第二抗体的溶液containging 0 3 μ中号DAPI。

致谢

C. Frot 对微加工的帮助表示感谢，F. Soares da Silva 对流式细胞术的帮助表示感谢。我们感谢创新和技术研究中心的生物材料和微流体 (BMCF)小组以及转化科学中心 (CRT)-细胞计量学和生物标志物技术和服务部门 (CB UTechS) 的支持。原始论文(Sart et al. , 2020)已发表在 Science Advances (doi: 10.1126/sciadv.aaw7853 ) 上。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的利益。

参考

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