材料和试剂

血样收集iNKT细胞
Ficoll-Paque Plus（GE Healthcare Biosciences，目录号：17-1440）
PE-anti-Vα24Jα18抗体（6B11）（Biolegend，目录号：342904）
抗CD16/32抗体（Biolegend，目录号：101320）
抗-Vα24抗体（Beckman Coulter，目录号：IM2283）
抗CD3抗体（Biolegend，目录号：300312）
重组人GM-CSF（R& D Systems，目录号：215-GM）
重组人IL-4（R& D Systems，目录号：204-IL）
重组人IL-2（Proleukin）（BD Biosciences，目录号：354043）
人树突细胞分离试剂盒（人CD14磁珠）（MiltenyiBiotec，目录号：130-050-201）
丝裂霉素C（Sigma-Aldrich，目录号：M4287）
人iNKT细胞分离试剂盒（Vα24Jα18磁性微珠）（MiltenyiBiotec，目录号：130-094-842）
α-半乳糖苷神经酰胺（α-GalCer，KRN7000）（Enzo Life Sciences，目录号：BML-SL232）
RPMI-1640培养基（Life Technologies，< Gibco ，目录号：11875）
非必需维生素溶液（Life Technologies，Gibco ，目录号：11140-050）
MEM维生素溶液（Life Technologies，< Gibco ，目录号：11120-052）
丙酮酸钠（Life Technologies， Gibco ，目录号：11360-070）
2-巯基乙醇（Life Technologies，Gibco ，目录号：21985-023）
Nalgene冷冻容器（Thermo Fisher Scientific，目录号：15-350-50）
抗生素：青霉素 - 链霉素
热灭活的胎牛血清
MACS缓冲区（参见配方）
完整介质（见配方）

设备

离心机带有旋转转子，能够提供300-700 x g
BD LSR II流式细胞计数器（BD Biosciences）
灭菌的巴斯德移液器
50ml锥形管
0.22μM滤波器
T-175烧瓶
T-25烧瓶
37℃5％CO 2培养箱

程序

收集外周血单核细胞（PBMC）。对于Ficoll密度梯度离心分离淋巴细胞与血沉棕黄层或白细胞提取包，首先用等体积的1x PBS在室温下稀释肝素化的血液。
加入15ml Ficoll（温至室温）至50ml锥形管中。然后在Ficoll顶部缓慢覆盖25ml稀释的血液混合物。在室温下以400×g离心30分钟，并关闭制动器
小心地取出2-3毫升淋巴细胞界面（介质和Ficoll之间的白色环，请参见图1中的示意图），使用灭菌的巴斯德吸管，并转移到新的50ml锥形管。

图1. Ficoll-Paque Plus分离人外周血的示意图
通过将细胞沉淀重悬在5ml PBS中来洗涤细胞，然后将所有沉淀合并到一个50ml管中，并用PBS填充管至50ml，并在400×g离心10分钟分钟，制动器打开
弃去上清液并将来自单个供体的管合并到单个管中，并再次用20ml PBS洗涤PBMC。然后计数PBMC，并在冰冷的MACS缓冲液中以5×10 7个细胞/ml的浓度重悬。
注意：白细胞通常用于这些研究，并且血液的初始体积为400-450ml，但产物已富集白细胞，并且步骤1中用于Ficoll分离的最终体积为约40ml。完成步骤5后，最好继续其余的协议。如果不是，细胞应该在T-175培养瓶中以10×10 7个细胞/ml的完全培养基在37℃5％CO 2下培养过夜， CO
第1-天 - 分离人CD14 ⁺细胞：根据制造商的说明使用人类CD14 ^-磁性微珠。
1. 对于CD14阳性的PBMC，用8ml完全培养基和20ng/ml rhGM-CSF和20ng/ml rhIL-4培养10天7天的细胞4-5天， T-25烧瓶中以产生未成熟的树突细胞（DC）。冻结额外的储存格，以便日后在10 ⁷ /瓶使用。
2. 保持CD14 ^neg级分用于iNKT细胞分离。为了维持细胞，在T-175烧瓶中以10μL/ml在完全培养基和10U/ml rhIL-2中培养。当扩展DC电池时，不必更换介质
第5天 - 扩增原代iNKT细胞：收集CD14阴性PBMC，并用10ml完全培养基洗涤。根据制造商的说明使用人类iNKT细胞分离试剂盒。
1. 为了分离Vα24^{+ hNKT细胞：收集CD14 ^- PBMC，并用洗涤培养基洗涤一次
  用30ml冰冷的MACS缓冲液重悬沉淀，通过70μm无菌细胞过滤器，然后以400×g离心5分钟。
  
  用1ml MACS缓冲液重悬沉淀，加入抗-Vα24抗体，5μg/10 6阳性细胞（NKT细胞占PBMC中淋巴细胞群体的0.01％-0.5％）。在冰上孵育30分钟。
  
  在30ml冰冷的MACS缓冲液中洗涤细胞两次
  用1ml MACS缓冲液重悬沉淀，加入抗小鼠IgG微珠20μl/10 6阳性细胞。在冰上孵育20分钟。
  
  在30ml冰冷的MACS缓冲液中洗涤细胞一次，同时离心通过加入500μlMACS缓冲液制备MS柱。
  
  重悬细胞在500微升ml MACS缓冲液。然后吸取细胞进入MS分离柱。确保避免通过慢慢吸移产生气泡。通过加入500μlml MACS缓冲液冲洗色谱柱。重复两次。加入1ml新鲜MACS缓冲液，从磁铁中取出柱。将柱放入15ml锥形管中。插入柱塞和推出内容，以获得纯化的iNKT细胞。计数NKT细胞富集级分。您应该有0.02-0.5百万个单元格。}
为了扩展原代人iNKT细胞：
1. 首先，用丝裂霉素C预处理未成熟的DC。在含有0.05mg/ml丝裂霉素C的RPMI中以5×10 6个细胞/ml重悬未成熟的DC，在37℃下在黑暗中孵育30分钟，然后用10ml完全培养基洗涤三次
2. 通过将细胞在含有200ng/mlα-GalCer和20U/ml rhIL-2的完全培养基（12孔板/1ml /孔）中在2-3×10 6 /细胞/ml，37℃孵育1小时
向12孔板中 - 向含有负载α-GalCer的DC（DC：iNKT）的孔中加入1ml在含有20U/ml rhIL-2Vα24+人类iNKT细胞的完全培养基中的比例应为5:1 ，例如2×10 6个DC细胞+ 0.4×10 6个NKT细胞）轻轻混合。
2天后，用灭菌的血清移液管收集细胞并转移到15ml管中。用含有5％FBS的RPMI培养基使体积达到10ml。以300×g离心10分钟，制动，弃去上清液，并用0.4×10 6个细胞/ml的完全培养基加20U/ml rhIL-2重悬细胞，然后在12孔板中以3ml /孔培养细胞
培养细胞7-10天，并且每2天更换培养基作为步骤9.
扩增iNKT细胞的流式细胞术分析通过流式细胞术分析，使用PE抗Vα24Jα18抗体（6B11）在淋巴细胞上门并检查纯度 - 参见图2.

图2.人PBMC中的iNKT细胞; B.从人PBMC分离和扩增的iNKT细胞系

流式细胞术程序：
1. 收集0.1×10 6个细胞，并转移到1.5ml管中，并填充1ml FACS缓冲液（PBS中的0.2％FBS）。
2. 离心细胞600×g 5分钟，然后丢弃上清液
3. 重悬细胞在50微升FACS缓冲液，并加入0.5微升抗CD16/32抗体 15分钟以阻断非特异性结合，然后作为步骤a洗涤
4. 重悬细胞在50μlFACS缓冲液，并加入5μlPE抗-Vα24抗体和5μlAPC抗CD3抗体在冰上在黑暗中30分钟，然后作为步骤a洗涤
5. 重悬细胞在200μlPBS，并在LSRII FACS机器上运行样品
保持iNKT细胞培养：将iNKT细胞培养于完全培养基加20U/ml rhIL-2，每2-3天更换新鲜培养基。当活细胞的密度大于2×10 6个细胞/ml时，应用完全培养基加20U将细胞稀释至0.4×10 6个细胞/ml/ml rhIL-2。为了使用Nalgene冷冻容器以5×10 6个细胞/ml培养基/冷冻小瓶制备iNKT细胞，iNKT细胞与冰冷的RPMI培养基加10％DMSO和20％FBS的储液。 />

食谱

完成媒介
RPMI培养基
100mM丙酮酸钠 10 mM非必需维生素溶液
100mM MEM维生素溶液 5×10 5 M 2-巯基乙醇 50 U/ml青霉素 - 链霉素 10％热灭活的胎牛血清
MACS缓冲区
1L不含Ca 2+ 2 +和Mg 2+ 2 +
的PBS 5 g BSA
2 mmol EDTA
通过0.22μM过滤器灭菌

致谢

这项工作得到国立卫生研究院（NIH），国家癌症研究所批准K01 CA131487，R21 CA162273和R21 CA162277到T.J. Webb，NIH AI 70258 to M.Tsuji，NIH AI 44129，CA 108835和P01 AI072677 to J.P.Schneck。该方法公开在Webb等人（2012）中，并且是对Exley等人（1997），Harada等人。（2005）和Shiratsuchi （2009）。

参考文献

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Harada，Y.，Imataki，O.，Heike，Y.，Kawai，H.，Shimosaka，A.，Mori，S.，Kami，M.，Tanosaki，R.，Ikarashi，Y.，Iizuka， Yoshida，M.，Wakasugi，H.，Saito，S.，Takaue，Y.，Takei，M.and Kakizoe，T。（2005）。在没有动物材料的情况下培养的α-半乳糖苷神经酰胺刺激的Valpha24 + NKT细胞的扩增

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Shiratsuchi，T.，Schneck，J.，Kawamura，A。和Tsuji，M。（2009）。人CD1二聚体蛋白作为用于CD1结合脂质和CD1限制性T细胞研究的不可或缺的工具。免疫方法 345（1-2）：49-59

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