材料和试剂

A. 飞股票

1. Canton-S作为野生型参考菌株

2. dome-Gal4,UAS2xEGFP（加州大学洛杉矶分校Utpal Banerjee提供）

3. srpHemo-Gal4-UAS-GFP（国家生物科学中心（NCBS），飞行设施）

B. 材料

1.细漆刷（2号）

2.玻璃腔盘40×40 mm（Atom Scientific，目录号：SDCE4040-1）

3. Sylgard（Sigma-Aldrich，目录号：761036）或同等产品

4. 微量测试板，96 孔（Tarsons，目录号：941196）或等效物

5. 35 mm 培养皿（Tarsons，目录号：460035）或同等产品

6. 1.5 ml 微量离心管（Axygen，目录号：MCT-150-C）

C. 试剂组织解剖和固定

1. NaCl（Fisher Scientific，目录号：S25542）

2. Na 2 HPO 4（默克，目录号：S9763）

3. NaH 2 PO 4 ·2H 2 O（默克，目录号：71505）

4.多聚甲醛（Fisher Scientific，目录号：23995）

5. 10×磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7）储备（见配方）

6. 4% 多聚甲醛 (PFA)（见配方）

免疫染色和安装

1. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）

2.正常山羊血清（GeNei，目录号：NS1）

3.一抗：小鼠抗P1/NimC1和小鼠抗Hemese（由Istvan Ando提供，匈牙利科学院生物研究中心）、兔抗Asrij（Kulkarni等。, 2011)

4.二抗：Alexa fluor 568山羊抗小鼠（Invitrogen，目录号：A11004）Alexa fluor 488 山羊抗兔（Invitrogen，目录号：A11008）

5. 与 Alexa fluor 633 结合的鬼笔环肽（Invitrogen，目录号：A22284）

6. DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐，ThermoFisher Scientific，目录编号：D1306)

7.甘油（默克，目录号：BP229-1）

8.中性红（默克，目录号：N4638）

9. PBS (PTX) 中的 0.1% Triton X-100（见配方）

RNA原位杂交

1.原位杂交探针：tep4 (Rodrigues et al. , 2021)

2.甲醇（默克，目录号：34860）

3. Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）

4.柠檬酸钠（Na 3 C 6 H 5 O 7）（HiMedia，目录号：TC249）

5. 分子级水-UltraPure DNase/RNase-free 蒸馏水（Invitrogen，目录号：10977015)

6.甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：11814320001）

7. tRNA（Sigma-Aldrich，目录号：10109517001）

8.肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H3149）

9.罗氏封闭剂（Sigma-Aldrich，目录号：11096176001）

10. CHAPS（Sigma-Aldrich，目录号：C9426）

11. EDTA（Fisher Scientific，目录号：S311-100）

12. NaCl（Fisher Scientific，目录号：S25542）

13. MgCl 2（Fisher Scientific，目录号：BP214-500）

14.与碱性磷酸酶缀合的抗DIG（Sigma-Aldrich，目录号：11093274910）

15. NBT/BCIP（Promega，目录号：S3771）

16. FastRed 底物套件（Abcam，目录号：ab64254）

17. PBS (PBS-T) 中的 0.1% Tween-20（见配方）

18. 20×生理盐水-柠檬酸钠缓冲液（20×SSC，pH 7）（见配方）

19. 杂交缓冲液（见配方）

20. 染色缓冲液（见配方）

设备

1、体视显微镜（Olympus SZ51，放大倍数0.8-4×）

2. 细镊子（Fine Science Tools，Dumont #5，目录号：11252-20）

3.弹簧剪刀2.5毫米刀刃（Fine Science Tools，目录号：15000-08）

4.昆虫针（Fine Science Tools，Minutien，0.1 mm，不锈钢，目录号：26002-10）

5. 共聚焦显微镜（蔡司，型号：LSM 880）软件1.ImageJ2. Adobe Photoshop CS5（Adobe 系统）

程序

A. 获得完整淋巴腺 (LG) 的幼虫鱼片制备可以获得一、二、三龄幼虫的完整LG制剂，以及蛹，使用这种解剖方法。苍蝇育种和杂交使用标准进行协议。幼虫在标准玉米面琼脂培养基上培养到适当的阶段，在非饱和密度。图 1A 显示了第一、第二和第三龄幼虫的相对大小。1. 用细刷子将幼虫转移到装有水的腔盘/培养皿中，然后冲洗幼虫以去除任何食物颗粒。

2. 将幼虫转移到干净的腔盘中，置于冰上 20-30 分钟以固定幼虫。固定（可选）有助于固定幼虫（见步骤 A4）。

3. 将冷却的幼虫背面朝上放在 Sylgard 培养皿上，并通过放大倍数为 4 倍的立体显微镜（变焦范围 0.8-4 倍），聚焦于背部角质层。全部随后的步骤将在显微镜下观察幼虫组织时进行。

4. 通过在靠近前部和后部的地方将昆虫针牢固地插入幼虫来抑制幼虫气孔，并通过 Sylgard 培养皿（图 1B）。加入一滴 PBS（约 200 µl）以防止幼虫干燥。

5. 使用精细解剖剪刀，在靠近右侧的角质层上做一个小切口。后端。将剪刀插入切口端并横向切开角质层（图 1C和 1D）。

6. 用细镊子将角质层松散的一端提起，向左侧延伸，切开沿着角质层的左侧边缘（图 1E）。7. 小心地取出内脏。找到连接到前脑叶的 LG背血管两侧的区域，其次是后端的心包细胞行（图 1F）。双鹅颈光源的侧面照明可以帮助区分折射LG。图 1. 幼虫 LG 解剖示意图。（一）代表形象一、二、三龄幼虫。(BF) LG 解剖的逐步示意图来自游荡的三龄幼虫。BL：脑叶，VNC：腹神经索，LG：淋巴腺，和PC：心包细胞。LG 叶之间的心包细胞数量可能不同。幼虫和 LG 图像未按比例绘制，但为清晰起见放大。

8. 加入一滴新鲜的 PBS 并轻轻地将其除去以除去任何组织碎片。如果需要，请重复。

9. 用 200 µl 固定剂（4% 多聚甲醛，参见配方）替换 PBS 并孵育 20分钟在室温下。取出固定液，用 PBS 洗涤 3 次。小心移除针，从后部缓慢提起 LG 制剂（带有下方的腹侧角质层）最后，转移到 96 孔板或 1.5 ml 微量离心管中进行免疫染色或在现场手续。

B. 获得完整淋巴腺 (LG) 的蛹鱼片制备整个 LG 可以在蛹形成 (APF) 后 0 到 20 小时内制备。根据我们的经验，大多数叶通过 15 小时 APF 进行组织分解（Rodrigues等，2021）。1. 将蛹背面朝上放在 Sylgard 培养皿上。所有后续步骤都必须在立体显微镜下观察蛹组织时进行。

2. 通过 Sylgard 培养皿在前气门附近牢固插入细昆虫针（图 2A）。添加一滴 PBS（约 200 µl）以防止蛹变干。

3. 使用精细解剖剪刀，沿后气门水平切割（图 2A）。

4. 将剪刀插入切口端，沿角质层右侧横向切开一条，然后是沿前部的切口，如虚线所示（图 2B）。

5. 提起角质层松散的一端，小心地向左侧延伸，沿左侧剪开沿虚线的角质层的侧边缘 (图 2B)。

6. 在不损坏 LG 的情况下小心取出内脏器官（图 2C）。心导管和心包细胞是定位剩余 LG 叶的良好标志（图 2D）。添加一个滴一滴新鲜的 PBS 以去除任何组织碎片，并在需要时重复。图 2. 蛹 LG 解剖示意图。(AD) 逐步示意图蛹 LG 解剖的代表。BL：脑叶，VNC：腹神经索，LG：淋巴腺体和 PC：心包细胞。LG 叶之间的心包细胞数量可能不同。蛹和 LG 图像未按比例绘制，但为清晰起见放大。

7. 按照步骤 A9 开始幼虫 LG 解剖并进行免疫染色或原位染色程序。

C. 淋巴腺 (LG) 的中性红色染色，以便于观察

1. 如上所述解剖并固定幼虫或蛹 LG。在 PBS 中洗涤三次，每次 8-10 分钟。

2. 加入 100 µl 0.2% 中性红溶液（PBS 中 0.2% 中性红），室温孵育5-7 分钟或直到 LG 明显染色。

3. 用 PBS 洗去中性红。脑叶和 LG 叶应该很容易看到。第一秒，和三龄和蛹 LG 可以很容易地通过中性红染色 (图 3A-3D) 识别。

图 3. 用中性红染色的 LG 制剂。(AD) 半解剖鱼片制备完整的初级和后叶被中性红染色。LG 裂片被严重染色（红色）如一龄 (A)、二龄 (B)、三龄 (C)、幼虫和蛹 (D) 所示。黄色箭头表示淋巴腺。BL：脑叶，VNC：腹神经索，LG：淋巴腺，Pri：初级叶，Sec：次级叶，Tert：三级叶。星号表示心包细胞。比例尺：100 µm

D. 淋巴腺 (LG) 免疫染色

1. 所有步骤都是通过将 96 孔培养皿放在平板摇杆上来执行的。

2. 用 200 µl PBS 在 96 孔培养皿中清洗 10-12 个固定的 LG 制剂，3 次，每次 10-15 分钟每个。

3. 将 200 µl 0.1% Triton X-100 的 PBS（0.1% PTX，参见配方）作为渗透剂加入到LG 制剂孵育 15-20 分钟。

4. 弃去 PTX，加入 100 µl 20% 正常山羊血清的 PBS 作为封闭剂，封闭 30 分钟。

5. 去除封闭剂，加入 40 µl 所需浓度的一抗用 PBS（或封闭剂）稀释。在 4°C 下孵育过夜。6. 去除一抗，用 PBS 清洗 LG 制剂 3 次 10-15分钟每个。

7. 弃去 PBS，加入 100 µl 20% 正常山羊血清，孵育 30 分钟。

8. 用 PBS 中的 40 µl 二抗（通常为 1:400）替换并在室温下孵育 2 小时温度。

9. 去除二抗，用 200 µl PBS 洗涤，3 次，每次 10-15 分钟。继续安装步骤（见下文，程序部分 F）。

E.淋巴腺原位杂交 (LG)

1. 用 500 µl PBS 在微量离心管中清洗 15-20 个固定的 LG 制剂，3 次用于每次 10-15 分钟。

2. 为了长期储存，用甲醇清洗 LG 制剂四次，并储存在甲醇中 -20°C。要继续实验，请用甲醇和 PBS 的混合物冲洗样品一次(1:1) 和 3 次在 PBS 中。

3. 用 500 µl 0.1% Tween-20 的 PBS (PBS-T) 清洗 LG 制剂，3 次，每次 10-15 分钟每个（参见 0.1% PBS-T 的食谱）。

4. 在 500 µl 等体积的 0.1% PBS-T 和杂交缓冲液中平衡 LG 制剂(HB)（参见杂交缓冲液的配方）。

5. 弃去 PBS-T-HB 溶液，在 500 µl HB 中 65°C 预孵育 1 小时。

6. 去除 HB 并用 1 µl 地高辛 (DIG) 标记的 RNA 探针替换 200 µl HB（探针的稀释需要根据探针浓度凭经验调整和目标基因的表达水平）。在 65°C 下杂交过夜。

7. 小心取出 HB，在 65°C 下用 500-800 µl HB 清洗 LG 制剂 1 小时。

8. 在 500-800 µl 等体积的 0.1% PBS-T 和 HB 中将 LG 制剂在 65°C 下洗涤 30 分钟，然后在室温下在 0.1% PBS-T 中快速洗涤 3 次。

9. 在室温下用 0.1% PBS-T 清洗 3 次，每次 10 分钟。10. 用 1% 牛血清白蛋白 (BSA) 或正常山羊血清 (NGS) 阻断非特异性结合在 0.1% PBS-T 中 30 分钟。

11. 与稀释 (1:1,000) 的碱性磷酸酶偶联的抗 DIG 抗体孵育室温封闭液 2 小时。

12. 去除抗 DIG 封闭溶液混合物，然后在 0.1% PBS-T 中快速冲洗 3 次。然后，用 0.1% PBS-T 洗涤 3 次，每次 10 分钟。

13. 在 500 µl 新鲜制备的染色缓冲液 (SB) 中平衡 10 分钟（参见配方）。

14. 在室温或 37°C 下用 1 ml SB (6.5 µl NBT + 3.5 µl BCIP) 中的 NBT/BCIP 进行可视化直到染色可见（图 4）。

15. 在 PBS 中洗涤 3 次并按指示安装 LG 制剂（见下文，程序F) 节。图 4. RNA原位杂交过程的示意图。逐步淋巴腺 RNA原位杂交方案的表示。Pri：初级叶，Sec：二级裂片，Tert：三级裂片。安装的 LG 制剂显示Latran 的表达为NBT/BCIP 透露。

F. 安装完整的淋巴腺 (LG)

1. 将固定和染色的幼虫鱼片置于盖玻片底部 35 mm 培养皿中。这些也可以通过在 35 mm 培养皿上打一个直径为 1 cm 的孔并粘合盖玻片到菜的底部（图 5）。加入一小滴 (10-20 µl) 70% 甘油DAPI (1:500) 或安装介质，以防止样品干燥。

图 5. 安装在 35 毫米盖玻片底盘中的 LG 制剂。七龄幼虫 LG 制剂在 35 毫米盖玻片底盘上染上中性红。黑色点缀线表示 LG 瓣。LG：淋巴腺，PC：心包细胞。

2. 用镊子夹住前端的圆角角质层。再用一把细镊子，小心地将脑叶与角质层的其余部分分开。LG 通过环形压盖连接到脑叶和背侧血管 (图 1F)。此程序将部分移走它来自角质层。

3. 接下来，用一把镊子夹住后端的角质层，再用另一把镊子，小心地将背血管的后部与心包细胞分开并滑动盖玻片上。组织非常脆弱，整个过程必须轻柔地进行，同时通过立体显微镜观察。

4. 将 LG 从前后两端松开后，小心地将 LG 移开从腹侧角质层。请勿直接提起或握住 LG。移动LG时，抓住大脑前端为心叶，后端为心包细胞。

5. 多个淋巴腺可以通过这种方式安装在一个培养皿中（图 5），并且可以进行高分辨率成像分析。数据分析A. 代表性成果在果蝇第三龄幼虫LG是多叶形器官侧翼背脉管。首先一对叶，称为初级叶，后面是 2-3 对后叶 - 二级、三级、和（很少）四级叶 - 由充当肾细胞的心包细胞分隔。为了为简单起见，我们将二级、三级和四级叶称为后叶。行心包细胞在后端排列在背血管上。为了证明这种解剖方法保持组织完整性，我们分析了标记物整个 LG、心导管和心包细胞。鬼笔环肽标记肌动蛋白，可用于可视化 LG 叶和背血管的完整性 (图 6A)。血红素，一种通用的血细胞标记（Kurucz等人，2003 年），在原代的所有细胞和大部分后部细胞中表达裂片 (图 6B)。Asrij (Kulkarni et al. , 2011)，另一种泛血细胞标记物，标记 LG 血细胞初级和后叶（图 6C）。srpHemo-Gal4，包含一个调控区该蛇基因，是活跃在胚胎血细胞（布鲁克纳等人，2004）和强烈在心包细胞中表达 (图 6D)。然而，初级叶中很少有细胞表达srpHemo-Gal4 (图 6D) 。在上述标记的帮助下，我们确认这解剖方法可用于分离完整的 LG 初级和后叶。

图 6. 使用泛血细胞、祖细胞和分化标记。从游荡的第三龄幼虫开始的整个 LG 准备包括初级和后叶。(A) 鬼笔环肽（黄色）标记肌动蛋白，用于识别 LG血细胞和心导管。泛血细胞标记物 (B)、Hemese（红色）和 (C) Asrij（绿色）在 LG 裂片中表达并有助于识别完整的裂片。(D) srpHemo-Gal4（绿色）是在心包细胞中强烈表达。(E)圆顶（绿色）标记初级中的祖细胞和后叶，P1/Nimrod C1（红色）标记浆细胞。(F)原位杂交tep4（红色）在 MZ、二级叶和一些三级细胞中高表达裂片。Pri：初级叶，Sec：次级叶，Tert：三级叶。(AF) 比例尺：100 µm。为了深入分析组织完整性，我们进一步检查了已知祖细胞 (MZ) 和分化 (CZ) 标记，如前叶中所定义。进行了记者，免疫染色或 RNA原位分析来分析标记表达。如前所述，

无穹顶祖标记（Jung等人，2005）在 MZ、次级叶和在三级叶的一些细胞（图 6E）。分化标记 P1/Nimrod C1（Kurucz等人，2007) 表达仅限于初级叶的 CZ (图 6E)。RNA原位再祖标记tep4（Rodrigues等人，2021 年）显示 MZ 中的高表达，次要裂片，以及在第三裂片的一些细胞中（图 6F）。使用LG解剖的圆角方法，我们获得了完整的初级和后叶，如用 MZ 和 CZ 标记染色所观察到的。完整LG 叶也可用于分析生态位细胞、祖细胞和分化细胞的数量。每个叶中的血细胞。因此，可以使用 IMARIS 软件重建 3D 图像。使用 2D Slice 模块，为由 DAPI 标记的细胞核定义直径。景点模块用于估计 DAPI +原子核的数量。以 P1 或使用表面模块分析由圆顶标记的祖细胞。表面模块也是用于 3D 渲染，具有 3D 表面（P1 或圆顶）和点之间的距离（DAPI +）由二维切片模块定义。接下来，使用模块“查找更接近表面的点”或“查找点”远离表面，”特定标记的正负点数 (DAPI + ) 可以是决定。使用这种解剖方法，我们成功地分离了初级和后叶，进行了 RNA 测序分析（图 7）。这导致了新的标记物的鉴定LG 血细胞（Rodrigues等，2021）。保持组织完整性和样本质量取决于解剖过程中的关键步骤。虽然解剖要求很高，识别 LG 并执行快速解剖（2-3 分钟）已通过 2-3几天的练习，即使是经验不足的暑期实习生。这个详细的协议旨在建立LG 解剖和综合分析的标准方法，也可适用于从早期幼虫龄期和蛹期分离 LG。

图 7. RNA 的解剖策略和工作流程示意图测序分析。解剖策略和 RNA 测序的逐步表示分别获得初级和后叶的转录组谱。Pri：初级裂片，Sec：二级裂片，Tert：三级裂片，Post：后裂片。B. 讨论与脊椎动物 HSPC 不同，大多数果蝇血液祖细胞位于单个造血器官中，淋巴腺，它也包含它们分化的后代。LG 的小尺寸（~1.5-2mm 长）对其常驻祖先进行了完整而全面的原位分析，并且差异化池成为可能。然而，我们对幼虫 LG 造血的大部分理解都来源于从深入分析仅限于最前叶，称为初级叶。直到最近，在初级叶中运作的细胞和分子机制被认为是适用的到后叶。然而，前叶和后叶在基因上有显着差异。表达和突变表型（Kulkarni等人，2011 年；Khadilkar等人，2014 年；Rodrigues等人，2021）。此外，后叶与前叶 PSC 物理分离，并且分化的血细胞参与调节前叶中的祖细胞命运（图 1F）。此外，更多的血祖细胞位于后叶（Rodrigues等，2021）。因此，对 LG 的不完整分析忽略了重要的发育和功能信息关于造血，这可能与脊椎动物的造血有关。帮助解剖和完整完整的 LG 分析，我们描述了一个详细的协议，这也将是有用的分析整个祖先群体。LG 初级叶是在胚胎阶段指定的，而后叶在二龄幼虫阶段形成并继续发育直到。游荡幼虫阶段。因此，这种解剖方法允许同时分析单个动物的发育造血功能（Rodrigues等，2021）。我们通过分析泛血细胞、祖细胞和RNA和蛋白质水平的分化标志物。获得完整的 LG 叶是必不可少的用于了解生理和免疫条件下的祖细胞异质性（Rodrigues etal ., 2021)。该协议可用于研究个体发育、发育和免疫方面LG 血细胞。它还可以用于分离不同的叶以进行后续的生化和组学化验（Sinha等人，2019 年；Rodrigues等人，2021 年）。因此，该协议将特别获得关于血细胞祖细胞命运调节的新的和更完整的见解是有价值的。

笔记

1. 我们使用中性红染色制剂只是为了便于训练期间的可视化和练习 LG 解剖，而不是用于免疫染色或原位杂交实验。

2. 避免将盖玻片放在 LG 制剂上，因为这会损坏组织。我们更愿意使用盖玻片底培养皿进行安装。有经验，8-10个LG制剂即可安装在单个盖玻片底盘中（图 5）。

3. LG解剖的圆角方法保留含有无蒂血细胞的腹侧幼虫角质层可以在样品安装步骤中检索到的簇（参见步骤 F4），允许同时对来自不同原基的血细胞的分析（Khadilkar等，2014）。

4. 该协议有助于分离三个器官系统：背血管、心包细胞和 LG在单个样品制备中使用相同的动物。

5. 由于前/初级叶祖细胞由一龄指定，而二级和三级裂片仅在后续阶段发育，此方法允许分析发育阶段在单个动物中。

食谱

1. 10×PBS氯化钠 18.9 克Na 2 HPO 4 2.48 克NaH 2 PO 4 ·2H 2 O 1.17 g溶解在高压灭菌的蒸馏水中。将体积调节至 250 毫升。将 pH 值调整为 7.0。在室温下储存。2. 4% 多聚甲醛 (PFA)将 4 g PFA 粉末溶解在 80 ml 1× PBS 中。用 1× PBS 溶液将体积调节至 100 ml。将混合物置于 60°C 的水浴中以溶解 PFA。储存在 4°C。3. PBS (PTX) 中的 0.1% Triton X-100在 100 ml PBS 中加入 0.1 ml Triton X-100。在室温下储存。4. 0.1% Tween-20 在 PBS (PBS-T)在 100 ml PBS 中加入 0.1 ml Tween-20。在室温下储存。5. 20× 柠檬酸钠缓冲液 (SSC)氯化钠 43.82 克Na 3 C 6 H 5 O 7 22.05 克溶于分子级（无 DNase/RNase）水中。用分子级（无 DNase/RNase）水将体积调节至 200 ml。将 pH 值调整为 7.0。高压灭菌并储存在 -20°C。6. 杂交缓冲液甲酰胺 50 毫升20×SSC 10 毫升酵母 RNA (50 毫克/毫升) 2 毫升肝素 (0.05 g/ml) 100 µl罗氏封闭剂 (10%) 20 ml（根据制造商的说明制备）。CHAPS (10%) 1 毫升EDTA (0.5M) 1 毫升吐温 20 (10%) 1 毫升使用分子级水（无 DNase/RNase）将体积调节至 100 ml。储存在-20°C。7. 染色缓冲液5 M 氯化钠 200 微升1 M 氯化镁2 500 微升Tris-HCl pH 9.5 1 毫升吐温 20 (10%) 1 µl用高压灭菌的蒸馏水将体积调节至 10 ml。

致谢

我们感谢果蝇社区提供苍蝇种群和抗体；国家生物中心科学、股票飞行设施、JNCASR 成像设施和我们的实验室成员宝贵的意见和建议。原理图是使用 BioRender.com 创建的。这项工作是由印法高级研究促进中心 (IFCPAR/ CEFIPRA )资助授予 MSI 和 LW。MSI 的工作还得到了 SERB 赠款、JC Bose 奖励项目和贾瓦哈拉尔·尼赫鲁高级科学研究中心。作者贡献：DR、LW 和 MSI 进行了实验；DR、KVR、LW 和 MSI 编写了手稿; MSI 和 LW 为这项工作获得了资金和设施。原始研究论文：JAK-STAT 信号的差异激活揭示了果蝇的功能区室化血祖。DOI： 10.7554/eLife.61409。利益争夺作者宣称没有利益冲突。

参考

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