材料和试剂

40毫升玻璃试管
棉团
1.5 ml离心管（Tarsons，目录号：500010）
15毫升猎鹰管（Tarsons，目录号：546021）
0.5 mm 直径玻璃珠（BioSpec Products，目录号：11079105）
96 孔板（Biofil，目录号：011096）
甲萘醌（Sigma-Aldrich，目录号：M5625）
乙醇（PHARMCO-AAPER，目录号：111WORLDUV200）
200 mM苯甲基磺酰氟（PMSF，丝氨酸蛋白酶抑制剂）（Amresco，目录号：0754-5G）
100 mM原钒酸钠（NaOVa，Tyr和碱性磷酸酶抑制剂）（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）
200 mM氟化钠（NaF，Ser / Thr和酸性磷酸酶抑制剂）（Sigma-Aldrich，目录号：450022）
100 ×蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号： P8215）
Pierce TM BCA 蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific，目录号：23227）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH；NAD 的还原形式），二钠盐，大约 2 级。98%（500 µM）（罗氏，目录号：10128023001）
NAD（P）H：来自费氏光杆菌的FMN氧化还原酶（Roche，目录号：10476480001）
培养基：酵母提取物（1％）-蛋白胨（2％）-葡萄糖（2％）YPD（Becton，Dickinson and Company（BD）Diagnostic Systems，目录号：242810）（参见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
NaCl（Affymetrix，目录号：21618）
KCl（G-Biosciences，目录号：RC1167）
Na 2 HPO 4 （Fisher Scientific，目录号：27785）
KH 2 PO 4 （Fisher Scientific，目录号：13405）
细胞裂解缓冲液（见配方）
Tris 碱（MP Biosciences，目录号：808229）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E6635）
葡萄糖（Becton，Dickinson and Company（BD）Biosciences，目录号：215530）
醌还原酶活性测定缓冲液（见配方）
Tris 碱（MP Biosciences，目录号：808229）
NaCl（Affymetrix，目录号：21618）
HPLC 级水（Merck Life Science Pvt. Limited，目录号：61765010001730）

设备

30°C 摇床培养箱（New Brunswick Innova，型号：43R）
分光光度计/细胞密度计（Biowave-WFA，型号：C08000）
精细天平（梅特勒托利多，型号：MS205DU）
FastPrep 24 匀浆器或珠子搅拌器（MP Biomedicals，型号：19083976）
冷却台式离心机（Eppendorf，型号：5424R）
石英比色皿，10 mm 光路（Hellma Analytics，目录号：104-10-40）
SpectraMax 多模式酶标仪（Molecular Devices，型号：M5）
针和抹刀（当地商店）

软件

Excel 2018 (微软)
SoftMax Pro 软件 7.0
GraphPad棱镜7

程序

C. glabrata培养
从带有 5 毫升 YPD 培养基的 40 毫升玻璃试管中接种一个来自C. glabrata条纹 YPD 琼脂平板的单菌落。
将管子放入塑料烧杯中，并在管子周围放上棉团，使它们紧紧地排列在烧杯中。
将烧杯放入培养箱摇床中，并在 30°C 下以 200 rpm（每分钟旋转）搅拌培养培养物过夜（14 至 16 小时）。
第二天早上，使用分光光度计测量 600 nm (OD 600 )培养物的光密度，在无菌 PBS 中稀释 20 倍。
要获得对数 (log) 期培养物，请在 OD 600为 0.1 的情况下用过夜培养的培养物接种新鲜的 YPD 培养基（10 毫升，在 100 毫升烧瓶中），并在 30°C 下以 200 rpm 搅拌孵育 4-5 小时, 直到 OD 600达到 0.4-0.6。可在孵育 4 小时后每半小时测量一次OD 600 。

细胞裂解
将 10 ml 对数期培养物 (0.4-0.6 OD 600 ) 转移到 15 ml 锥形离心机/Falcon 管中。
在 4°C 下以 4,700 × g离心管5 分钟。
弃去上清液，向细胞沉淀中加入 10 ml PBS。
在 4°C 下以 4,700 × g离心管5 分钟，然后弃去上清液。加入 1 ml PBS 并通过轻柔移液将细胞沉淀悬浮在 PBS 中。
将细胞悬液转移至 1.5 ml 微量离心管和离心管中，在 4°C 下以 2,400 × g的速度在冷冻微量离心机中离心 5 分钟。
使用 1 ml 微量移液器吸头完全去除上清液，不要干扰沉淀，在每个管中加入 200 μl 细胞裂解缓冲液，轻轻移液悬浮细胞沉淀。
将 0.5 mm 玻璃珠添加到每个管中，直至体积等于细胞悬浮液的体积，并使用 FastPrep 24 匀浆器以 6.5 M/s 的最大速度设置裂解细胞，每个循环 60 s，每次 3-5循环之间的分钟冰孵化。值得注意的是，根据真菌种类，此细胞裂解步骤可能需要对最佳循环数和珠打速度设置进行标准化。
从 FastPrep 均质器中取出管子，然后用针在底部刺穿它们。将含有细胞匀浆的穿刺管放入新的 1.5 ml 微量离心管中，其盖子保持打开状态。将管子放入离心机中，打开盖子朝内并朝向转子中心，并在 4°C 下以 2,400 × g离心5 分钟。上清液将被转移到下管，而玻璃珠将留在上管。或者，将含有细胞匀浆的管在4°C 下以21,000 × g离心10 分钟以去除珠子，并将上清液转移到新管中。
再次在4°C 下以21,000 × g离心10-15 分钟以去除细胞碎片和未裂解的细胞，并在新的微量离心管中收集含有细胞蛋白（约 150 μl）的透明上清液。
按照制造商的说明，使用 BCA 蛋白质检测试剂盒测量细胞裂解物中的蛋白质浓度。为此，添加 11.5 μl 无菌水和 1μl 每个测定的细胞裂解物。96 孔板每个孔中的反应混合物体积为 12.5 μl。对于标准绘图生成，在 96 孔板的五个独立孔中加入 1 μl 至 5 μl BSA（牛血清白蛋白；试剂盒提供的浓度为 2 mg/ml）。用无菌水将每个孔的体积补足至 12.5 μl。保留一口含有 12.5 μl 无菌水的孔作为空白，其中不添加蛋白质样品。向每个孔中加入 100 μl BCA 溶液（溶液 A 和溶液 B 的比例为 50:1）。用铝箔盖住板并在 37°C 下孵育 30 分钟。在多模式酶标仪中测量 562 nm 处的样品吸光度。使用 BSA 标准曲线计算细胞裂解物样品中的蛋白质浓度，通常范围为 5 至 10 μg/μl。

反应混合物的设置
将 1.5 ml 离心管置于冰上，开始制备 1 ml 总体积的反应混合物。它将包含 500 µg 蛋白质、500 µM 甲萘醌和 500 µM NADH。
将对应于 500 µg 蛋白质的细胞裂解液和 10 µl 50 mM 甲萘醌原液（通过将 8.609 mg 粉末溶解在 1.5 ml 微量离心管中的 1 ml 无水乙醇中而新鲜制备）添加到反应混合物中。值得注意的是，该测定需要甲萘醌，因为在没有外源甲萘醌的情况下没有观察到酶活性。然而，甲萘醌可能会被其他醌取代，以检查细胞裂解物中存在的不同醌还原酶的特异性。同样，由于 Fld-LPs 的水平和活性可能会在各种压力条件下发生变化，因此使用 2-3 种不同浓度的细胞裂解物对测定进行标准化并测量线性范围内的吸光度值非常重要。
用测定缓冲液将反应体积补至 950 µl。
对于每个细胞裂解物，准备一个包含所有试剂的空白对照。
通过添加 20 μl NAD(P)H: FMN 氧化还原酶 (1 Unit; Roche) 而不是细胞裂解物来设置阳性对照。
在进行吸光度测量步骤之前，将 6.6343 mg 粉末溶解在 1 ml HPLC 级水中，制备 10 mM NADH 库存溶液。

吸光度测量
设置 Spectramax M5 读板机，以 10 秒的间隔在 60 秒内测量 340 nm 处的吸光度。
在黑暗中执行以下所有步骤。
向反应混合物中加入 50 µl 10 mM NADH 溶液，混合均匀，转移至石英比色皿（1 厘米光程），并在 60 秒内以 10 秒的间隔读取 340 nm 处的吸光度。由于加入 NADH 会启动醌解毒反应，因此该步骤需要尽快进行。因此，在吸光度测量之前单独开始反应很重要。
作为阴性对照，在 60 秒内以 10 秒的间隔测量空白样品（不添加 NADH）在 340 nm 处的吸光度。
对所有细胞裂解物和阳性对照样品重复上述步骤。

数据分析

对于每个样品，使用 SoftMax Pro 软件 7.0 生成的 SpectraMax M5 多模式微孔板系统上将出现一个显示吸光度值随时间变化的图表。将原始文件另存为 pdf 并将原始值导出到 excel 文件。这可以通过右键单击图表并选择复制比色皿数据选项，然后将数据粘贴到 Excel 表中来完成。
通过按测量时间升序放置样品吸光度值，在新的 Excel 表中排列数据。
考虑底物 NADH 在 0 s 时间点的吸光度为 100，通过将每个时间点的吸光度除以 0 s 吸光度并将数字乘以 100 来计算每个样品中的 NADH 氧化。获得的数字反映了 NADH（底物）量在那个特定的时间点留在反应混合物中。
使用 GraphPad Prism 7 或任何其他软件绘制底物剩余量与测量吸光度的时间点（以秒为单位）的关系图。图 3 显示了一个代表性的图表。在生物一式三份中执行实验。

图 3.光滑念珠菌细胞裂解物中的NADH:醌氧化还原酶活性测量，使用甲萘醌和 NADH 进行测量。的光滑念珠菌的野生型菌株BG2是在YPD培养基中生长至对数期，接着细胞收集并用玻璃珠裂解。细胞裂解物 (500 μg) 与甲萘醌 (500 μM) 和 NADH (500 μM) 一起孵育，并在 60 秒内在 340 nm 处记录吸光度。底物 NADH 在 0 h 时间点的吸光度为 100，NADH 氧化的计算公式为：[（每个时间点的吸光度/0 h 吸光度）×100]。数据代表平均值 ± SEM (n = 3)。星号表示野生型细胞裂解物和包含除 NADH 以外的所有试剂的空白样品之间的活性差异有统计学意义。*，P < 0.0332；**，P < 0.0021；分组多重t检验。

笔记

NADH 和甲萘醌溶液应在使用前新鲜制备。
使用 HPLC 级水制备试剂和缓冲液，以避免与水质相关的变化。
应严格保持细胞裂解缓冲液的 pH 值，因为酶促反应仅适用于 pH 值 7.4-7.5 的缓冲液。
NADH 溶液应用铝箔包裹以尽量减少暴露在光线下并储存在 4℃ 在酶分析过程中。
如果使用从大肠杆菌中纯化的类黄酮素蛋白进行检测，请将 FMN (100 μM) 或 FAD (100 μM) 作为辅因子添加到纯化的酶中，并在 4°C 下孵育 1 小时，然后添加将甲萘醌和其他试剂加入反应混合物中。
NAD(P)H:醌氧化还原酶活性也可以在用不同醌处理的细胞中测量。使用此协议，我们测量了对数期甲萘醌 (90 µM) 处理的光滑念珠菌培养物中的NAD(P)H:醌氧化还原酶活性（Battu等人，2021 年）。通过将 20 μl 甲萘醌原液 (50 mM) 添加到 10 ml 对数期培养物中并在 30°C 下以 200 rpm 搅拌培养 90 分钟来进行甲萘醌处理。保留一份培养物作为未处理的对照，其中不添加甲萘醌。使用上述方案中描述的步骤处理培养物 [甲萘醌治疗可以通过暴露于任何其他压力源或突变菌株的生长来代替]。

食谱

酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖 (YPD) 培养基 (1 L)
YPD 培养基可以使用 BD Difco TM YPD Broth (#242810)制备，也可以将以下成分添加到无菌水中，然后进行高压灭菌。
10 克酵母提取物
20 克蛋白胨
20 克葡萄糖
磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (1 L)
137 毫米氯化钠
2.7 毫米氯化钾
10 mM Na 2 HPO 4
1.8 mM KH 2 PO 4
将 80 g NaCl、2 g KCl、14.4 g Na 2 HPO 4和 2.4 g KH 2 PO 4溶解在水中以制备 10× 溶液。
用 HCl 将最终 pH 值调整到 7.4。用蒸馏水将 10x 溶液稀释为 1x 溶液。
细胞裂解缓冲液（100 毫升）
50 mM Tris-HCl (pH 7.5)（50 ml 1 M 储备溶液）
2 mM EDTA（133.3 µl 1.5 M 原液）
2% 葡萄糖（4 ml 50% 原液）
10 mM 氟化钠 (NaF)*
1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)*
1 mM 原钒酸钠 (NaOV)*
1× 蛋白酶抑制剂混合物*
*抑制剂储备液可以提前制备，并在 -20°C 下分装储存。在使用前解冻等分试样并添加到裂解缓冲液中。
醌还原酶活性测定缓冲液（10 ml）
10 mM Tris-HCl (pH 7.4)（100 µl 1 M 储备溶液）
150 mM NaCl（300 µl 5 M 原液）
用 HPLC 级水定容至 10 ml。

致谢

这项工作得到了 DBT/Wellcome Trust India Alliance Senior Fellowship to RK (IA/S/15/1/501831; www.indiaalliance.org/ ) 的全力支持。Kaur 实验室的研究也得到了生物技术系 (BT/HRD/NBA/37/01/2014; http://www.dbtindia.gov.in/ ) 和科学与工程研究委员会的资助。科技 (EMR/2016/005375; http://www.serb.gov.in/home.php )，印度政府。AB 是印度新德里生物技术部研究奖学金的获得者 ( http://dbtindia.gov.in/ )。
该协议源自先前为大肠杆菌描述的活性测定。-纯化的蛋白质（Herrou等人，2016 年）。我们最近的出版物（Battu等人，2021 年）中描述了这种关于 NAD(P)H:醌氧化还原酶活性的C. glabrata细胞提取物的方案。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突。

参考
Battu, A.、Purushotham, R.、Dey, P.、Vamshi, SS 和 Kaur, R.（2021 年）。天冬氨酰蛋白酶介导的裂解调节类黄酮素蛋白的结构和功能，并有助于氧化应激存活。 PLoS 病原体17(2)：e1009355。
Bongomin, F. 和 Gago, S. (2017)。真菌疾病的全球和多国流行率 - 估计精度。 J 真菌3（4）：57。
Briones-Martin-Del-Campo, M., Orta-Zavalza, E., Cañas-Villamar, I., Gutiérrez-Escobedo, G., Juárez-Cepeda, J., Robledo-Márquez, K., Arroyo-Helguera, O., Castaño, I. 和 De Las Peñas, A. (2015)。光滑念珠菌的超氧化物歧化酶可防止氧化损伤，是赖氨酸生物合成、DNA 完整性和按时间顺序排列的生命存活所必需的。微生物学（阅读）161（Pt 2）：300-310。
Brunke, S. 和 Hube, B. (2013)。两个不同的表亲：白色念珠菌和光滑念珠菌感染策略。细胞微生物15(5): 701-708。
Carey, J., Brynda, J., Wolfova, J., Grandori, R., Gustavsson, T., Ettrich, R. 和 Smatanova, IK (2007)。WrbA 连接细菌黄素氧还蛋白和真核 NAD(P)H:醌氧化还原酶。蛋白质科学16(10)：2301-2305。
Chakrabarti, A., Sood, P., Rudramurthy, SM, Chen, S., Kaur, H., Capoor, M., Chhina, D., Rao, R., Eshwara, VK, Xess, I., et al . (2015)。印度 ICU 获得性念珠菌血症的发生率、特征和结果。重症监护医学41(2)：285-295。
Cuéllar-Cruz, M., Briones-Martin-del-Campo, M., Cañas-Villamar, I., Montalvo-Arredondo, J., Riego-Ruiz, L., Castaño, I. 和 De Las Peñas, A. (2008)。真菌病原体光滑念珠菌对氧化应激的高抵抗力由单一过氧化氢酶 Cta1p 介导，并受转录因子 Yap1p、Skn7p、Msn2p 和 Msn4p 的控制。真核细胞7(5)：814-825。
Deller, S.、Macheroux, P. 和 Sollner, S.（2008 年）。黄素依赖性醌还原酶。细胞分子生命科学65(1):141-60。
Farías-Rico, JA、Schmidt, S. 和 Höcker, B.（2014 年）。两个古老蛋白质超折叠的进化关系。Nat Chem Biol 10(9): 710-715。
Herrou, J., Czyż, DM, Willett, JW, Kim, HS, Chhor, G., Babnigg, G., Kim, Y. 和 Crosson, S. (2016)。WrpA 是一种受流产布鲁氏菌一般应激反应系统调控的非典型黄素氧还蛋白家族蛋白。J Bacteriol 198(8): 1281-1293。
向 LJ (2020)。单核细胞和宿主对真菌病原体的反应。 Front Cell Infect Microbiol 10: 34。
Houwman, JA 和 van Mierlo, CPM (2017)。具有类黄酮素结构的蛋白质折叠。FEBS J 284(19): 3145-3167。
Kaur, R., Ma, B. 和 Cormack, BP (2007)。光滑念珠菌的毒力需要糖基磷脂酰肌醇连接的天冬氨酰蛋白酶家族。 Proc Natl Acad Sci USA 104(18): 7628-7633。
Koch, K.、Hromic, A.、Sorokina, M.、Strandback, E.、Reisinger, M.、Gruber, K. 和 Macheroux, P. (2017)。来自Saccharomyces cerevisiae的重组 Pst2p 的结构、生化和动力学特性，这是一种 FMN 依赖性 NAD(P)H:醌氧化还原酶。 Biochim Biophys Acta Proteins Proteom 1865(8): 1046-1056。
Lamoth, F.、Lockhart, SR、Berkow、EL 和 Calandra, T.（2018 年）。侵袭性念珠菌病流行病学格局的变化。J Antimicrob Chemother 73(suppl_1)：i4-i13。
Lodeyro, AF, Ceccoli, RD, Pierella Karlusich, JJ 和 Carrillo, N. (2012)。黄酮素对光合微生物和转基因植物环境胁迫耐受性的重要性。机制、进化和生物技术潜力。 FEBS Lett 586(18): 2917-2924。
Netea, MG, Joosten, LA, van der Meer, JW, Kullberg, BJ 和 van de Veerdonk, FL (2015)。对念珠菌真菌感染的免疫防御。 Nat Rev Immunol 15(10): 630-642。
Patridge, EV 和 Ferry, JG (2006)。来自大肠埃希氏菌和古生球藻的 WrbA是一种 NAD(P)H:醌氧化还原酶。J Bacteriol 188(10): 3498-3506。
Pfaller, MA, Diekema, DJ, Turnidge, JD, Castanheira, M. 和 Jones, RN (2019)。SENTRY 抗真菌监测计划二十年：1997 年至 2016 年念珠菌属物种的结果。开放论坛 Infect Dis 6（增刊 1）：S79-S94。
Rai, MN、Balusu, S.、Gorityala, N.、Dandu, L. 和 Kaur, R. (2012)。光滑念珠菌-巨噬细胞相互作用的功能基因组分析：染色质重塑在毒力中的作用。PLoS 病原体8(8)：e1002863。
桑乔，J.（2006 年）。黄酮素：序列、折叠、结合、功能等。细胞分子生命科学63(7-8): 855-864。
Seider, K.、Brunke, S.、Schild, L.、Jablonowski, N.、Wilson, D.、Majer, O.、Barz, D.、Haas, A.、Kuchler, K.、Schaller, M. 和Hube, B. (2011)。兼性细胞内病原体光滑念珠菌破坏巨噬细胞细胞因子的产生和吞噬溶酶体的成熟。J Immunol 187(6): 3072-3086。

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