材料和试剂

材料

1. 拟南芥种子（生态型 Col-0 或根据需要）

2. 移液器吸头 PIPETMAN DIAMOND D10、D200、D1000（Gilson，目录号：F161630、F161930、F161670）

3. 2 ml 圆底微量离心管卡扣管（例如，BRAND，微量离心管，2 ml 带盖，PP；默克，目录号：BR780546-500EA）

4. 用于 2 毫升微量离心管的圆形支架（例如，PrepSafe ^TM微量离心管迷你浮动架，透明；默克，目录号：Z756385）

5. 50 毫升玻璃烧杯（例如，BRAND，目录号：91217）

6. 方形培养皿 120 × 120 × 17 mm，Greiner Bio-One（Fisher Scientific，目录号：07-000-330）

7. 微孔胶带（3M，目录号：1530-1）

8. 铝箔（例如，Sigma，目录号：Z185140-1EA）

9. 带有锥形底部的离心玻璃 DURAN ^®，12 ml（Carl Roth，目录号：K211.1）

10. 25-μl 校准玻璃注射器（型号 702 N；Hamilton，目录号：CAL80400）

11. 1.5 毫升带 8 毫米特氟龙内衬螺旋盖的螺旋琥珀色玻璃小瓶（例如，VWR，目录号：VWRI548-0019 和 548-0360）

12. Corning ^®Pasteur 移液器，非无菌，228 mm（Merck，目录号：CLS7095B9）

13. PARAFILM ^®M（默克，目录号：P7793）

14. 带卡扣盖的透明玻璃罐，11 毫升，22 × 45 毫米（VWR，目录号：548-0625）

15. 对于气生组织，显微镜载玻片 76 × 26 × 1 mm，带切边（Histolab，目录号：06300）

16. 对于根组织，诊断显微镜载玻片 25 × 75 mm，8 个 6 mm 孔，腔周围有黑色环氧树脂场（Histolab，目录号：06260）

17. 盖玻片 1、18 × 24 毫米和 24 × 24 毫米（Histolab，目录号：06602 和 06608）

试剂

所有试剂都可以在室温下储存，除了 NBD-磷脂溶液，它应保持在 -20°C 以长期储存。

1. 次氯酸钠（14% Cl ₂）水溶液，GPR RECTAPUR ^®（VWR Chemicals，目录号：27900.296）

2. 37％盐酸溶液（Sigma，目录号：320331）

3. Phytoagar（Duchefa Biochemie，目录号：P1003）

4. 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（Merck-Millipore，目录号：1061261000；CAS号：4432-31-9）

5. 氢氧化钾（Sigma，目录号：484016-1KG；CAS 号：1310-58-3）

6. 二甲基亚砜（DMSO），无菌过滤，生物性能认证（Sigma，目录号：D2438）

7. 甲醇（Sigma，目录号：179337；CAS 号：67-56-1）

8. 氯仿，乙醇稳定并经认证不含光气和 HCl（Sigma，目录号：650471）

9. 氯仿中的荧光 C ₆-NBD-磷脂

C ₆-NBD-磷脂酰乙醇胺（Avanti Polar Lipids，目录号：810153）

C ₆-NBD-磷脂酰丝氨酸（Avanti Polar Lipids，目录号：810192）

C ₆-NBD-磷脂酰胆碱（Avanti Polar Lipids，目录号：810130）

NBD-溶血磷脂酰胆碱（Avanti Polar Lipids，目录号：810128）

C ₆-NBD 鞘磷脂（Avanti Polar Lipids，目录号：810218）

10. Tergitol NP-40型溶液（Sigma，目录号：NP40S）

11. 低熔点琼脂糖，分析级（Promega Corporation，目录号：V2111）

12. 含维生素的 Murashige 和 Skoog（MS）盐（Phyto Technology Laboratories，目录号：M519）

13. 半强度 MS 液体培养基（见配方）

14. 半强度 MS 板（见配方）

15. 琼脂糖溶液（见食谱）

16. C ₆-NBD-脂质储备（见配方）

设备

1. 移液器 PIPETMAN Classic P2、P20、P200、P1000（Gilson，型号：F144801、F123600、F123601、F123602）

2. 5 型精密镊子，细针锋利，防磁不锈钢（默克，目录号：T4537）

3. 手术刀（例如，Sigma，目录号：S2646 和 S2896）

4. 玻璃干燥器（例如，Boro 3.3 干燥器 20 cm 带旋钮盖；BRAND，目录号：65038）

5. 浅水浴（例如，Precision GP 2S，2L 浅水浴；ThermoFisher，目录号：TSGP2S）

6. 60°C 的培养箱或加热块（例如，VWR，目录号：75838-270）

7. 分析天平（例如，Sartorius Entris-i II，220 g/0.1 mg，Buch Holm，目录号：4669128）

8. 高压灭菌器（例如，Presoclave III，80 升，Ø：40 × 62 cm，Buch Holm，目录号：5083042）

9. 冷冻机（例如，GRAM Bioline，型号：BioCompact 210RF）

冰箱（例如，GRAM Bioline，型号：BioCompact 210RR）
旋转蒸发仪配备有真空泵或氮气供给[例如，步琪^®旋转蒸发仪^®RII蒸发器与插座和水浴（Sigma，目录号：Z564036），配备有VACUUBRAND隔膜真空泵模型MD1C（Sigma，目录号：Z656194） ]
水净化系统（例如，的Milli-Q ^®直接水净化系统，默克-Millipore公司，目录号：ZR0Q008WW）
通风柜（例如，Erlab ^TMCaptair 391 Smart Fume Hood，Fisher Scientific，目录号：15514360）
微波炉（例如，H2100 Microwave Oven 220 Volt，Merck，目录号：A9209）
层流柜（例如，Fortuna Clean Bench、ScanLaf、Labogene）
植物生长箱（如三洋多功能环境试验箱，型号：MLR-351H）
共聚焦显微镜，例如配备氩激光器（Leica Microsystems A/S）和 C-Apochromat 63×/1.2 W autocorr M27（CG=0.14-0.19 mm）（FWD=0.28 mm）的 Leica TCS SP5 共聚焦激光扫描显微镜在 CG=0.17 mm）物镜（Carl Zeiss Microscopy，目录号：421787-9971-790）

软件

1. Leica LAS X 软件，版本 3.5.7.23225 (Leica Microsystems A/S)

2. ImageJ 1.52n（美国国立卫生研究院，http: //imagej.nih.gov/ij ）（Schneider等，2012）

程序

A. 准备植物生长培养基

考虑到每 20-25 个种子需要一个板，准备 ½ MS 培养基板（参见配方）。对于每种脂质，每个实验至少应量化五株幼苗的吸收。允许一些额外的种子来解释过程中可能损坏的幼苗。

注意：平板可以提前制作并在无菌袋中在 4°C 下保存约一个月。

B. 种子杀菌和植物生长条件

我们使用干燥器内的氯蒸气对种子进行消毒，但该协议可用于任何其他消毒程序。

1. 将种子转移到用铅笔或耐氯笔标记的 2 毫升微量离心管（最多 50 粒种子/管）中，然后放在圆形架子上。

2. 将装有种子的管子（打开盖子）和 50 毫升烧杯和 25 毫升 14% 次氯酸盐溶液放入放置在通风橱中的干燥器罐中（图 1A 和 1B）。

图 1. 在脂质吸收测定中处理植物样品。

将种子放入开口的 2 毫升圆底试管 (A) 中，并与 50 毫升玻璃烧杯 (B) 中的 25 毫升次氯酸钠溶液一起放入干燥器罐中。通过添加 37% 的盐酸触发氯气灭菌。(C) 无菌种子镀在方形 ½ MS 板上，并用微孔 3M 胶带密封。(D) 分层后，将板垂直放置在长日制下的生长室中。(E) 幼苗在生长五天后即可进行脂质吸收测定。(F) 将幼苗转移到装有 ½ MS 培养基的小玻璃罐中，并置于 25°C。脂质摄取测定从添加所需的 NBD 脂质开始。(GH) 洗涤后，根 (G) 或地上部分 (H) 被转移到显微镜载玻片上进行可视化。比例尺：A、F 和 H，1 厘米；B和D，5厘米；C 和 E，2.5 厘米。

3. 小心地将 1 ml 37% 的盐酸溶液加入次氯酸盐溶液中，并立即关闭干燥器罐。

4. 在打开容器并立即尽快关闭管盖以保持无菌之前，允许通过氯气进行大约 3 到 4 小时的灭菌。

注意：灭菌时间超过 4 小时会降低种子活力。

5. 将装有种子的管子放到无菌工作台上，然后放在 ½ MS 方形板上（参见食谱），尝试覆盖整个表面，以便幼苗在生长时不会相互接触（图 1C）。

6. 用微孔胶带封闭板并在 4°C 下分层 2 至 4 天，然后将它们垂直放置在 22°C 的植物生长室中，在 16 小时光照/8 小时暗光制度下持续 5 天（图 1D-1E） .

注意：直接来自黑暗时期的植物的脂质吸收似乎很差。在开始实验之前，让幼苗在光照下至少站立 90-120 分钟。

C. NBD-脂质摄取测定

1. 对于每个脂质和植物系，准备一个装有 250 µl 液体 ½ MS 培养基的玻璃罐，并在 25°C 的浅水浴中孵育 5-15 分钟（图 2）。

2. 使用精密镊子，将 2-4 株幼苗转移到每个玻璃罐中并轻轻摇晃。避免接触稍后将被可视化的幼苗部分（图 1F 和图 2）。

在不接触幼苗的情况下向每个罐子（培养基中的最终浓度为 40 µM）添加 1 µl 10 mM C ₆-NBD-脂质（参见配方），开始标记。轻轻摇动并在 25°C 下孵育所需的时间。

注意：孵育时间取决于细胞壁对特定脂质的渗透性，这取决于脂肪酸尾长和头基电荷。对于 C ₆-NBD-鞘磷脂，15 分钟就足够了，而像 C ₆-NBD-磷脂酰乙醇胺和 C ₆-NBD-磷脂酰丝氨酸这样的脂质在 3 小时后首先可检测到。

图 2. 植物中的脂质吸收测定。

使用精密镊子，将 5 天大的幼苗转移到装有预热的 ½ MS 液体培养基的小玻璃罐中，而不会接触稍后将看到的幼苗部分。添加所需的 NBD 脂质后，将幼苗培养不同的时间段。随后，幼苗用含有洗涤剂的 ½ MS 培养基洗涤一次，用不含洗涤剂的培养基洗涤两次，然后转移到显微载玻片上。使用低浓度琼脂糖溶液固定根部，而地上部分则简单地置于水中。在样品用物镜覆盖并使用共聚焦显微镜进行可视化之前，在手术刀的帮助下去除不会被可视化的植物材料。

3. 去除上清液，小心不要接触幼苗，并在 25°C 下加入 400 µl ½ MS 液体培养基和 1% tergitol 溶液。轻轻摇晃并在 25°C 下孵育 2-3 分钟。

4. 在 25 °C 下用 400 µl 不含洗涤剂的 ½ MS 液体培养基重复洗涤步骤两次，并将植物保持在室温下的 ½ MS 液体培养基中，直至可视化（不超过 1 小时）。

注意：此时，可以使用脂质提取和薄层色谱分析来测试植物的荧光脂质类似物的代谢转化，如前所述（Poulsen等，2015）。

D. 显微可视化

1. 根的可视化

a. 注意不要触摸要可视化的区域，将根部置于 6 毫米孔内的幼苗放在显微载玻片上，并在顶部添加 3 微升 0.5% 琼脂糖溶液（图 1G 和图 2）。

b. 用手术刀去除地上部分，并用物镜盖住。

c. 将载玻片安装在显微镜上，并使用带有 63 倍物镜的明场模式调整感兴趣区域的焦点。

注意：暴露在激光下会导致漂白。因此，建议在切换到荧光模式之前在明场模式下调整焦点并立即获取图像。

d. 切换到 488 nm 激发和 490-508 nm 发射记录的共聚焦采集。针孔直径应低于两个艾里斑（约 100 μm）。

注意：这些设置适用于携带 NBD 组的脂质，在使用其他荧光团时需要进行调整。

e. 设置成像参数（激光功率、探测器增益或曝光时间）以获得明亮的信号而不会过度曝光。我们通常使用 20-40% 的激光功率和 4 次线平均扫描来防止样品漂白并通过增加检测器增益和降低偏移来补偿低信号强度。在这些设置下，信号在发生显着漂白之前稳定 25-45 秒。

f. 在不更改任何设置参数的情况下获取图像，并在所有植物的相似区域和共焦平面中获取图像（例如，参见图 3）。

图 3. 根和气生植物组织中脂质吸收成像的示例。

将幼苗（5 天大）与 NBD 脂质孵育指定的时间，并在去除多余的脂质后通过共聚焦显微镜观察。(A) 根和保卫细胞中脂质吸收测定的时间过程。比例尺：根，25 μm；保卫细胞，10 μm。(B) 受损根的例子。白色多边形标记损坏区域。比例尺：20 μm。

2. 叶子的可视化

a. 将 40-50 µl 水滴在普通显微镜载玻片上，并使用镊子将地上部分的幼苗放入水中（正面朝上）。注意不要触摸要可视化的区域（图 1H 和图 2）。

b. 使用手术刀去除根部并用物镜盖住。

c. 将载玻片安装在显微镜上，并使用明场模式和 63 倍物镜定位细胞。

注意：暴露在激光下会导致漂白。因此，我们建议在切换到荧光模式并立即获取图像之前，先在明场模式下调整焦点。

d. 切换到 488 nm 激发和 490-508 nm 发射记录的共聚焦采集。针孔直径应低于两个艾里斑（约 100 μm）。

注意：这些设置适用于携带 NBD 组的脂质，在使用其他荧光团时需要进行调整。

e. 设置成像参数（激光功率、探测器增益或曝光时间）以获得明亮的信号而不会过度曝光。我们通常使用 20-40% 的激光功率和 4 次线平均扫描来防止样品漂白，并通过增加检测器增益和降低偏移来补偿低信号强度。在这些设置下，信号在发生显着漂白之前稳定 25-45 秒。

f. 在不更改任何设置参数的情况下获取图像，并在所有植物的相似区域和共焦平面中获取图像（例如，参见图 3）。

数据分析

1. 以与 ImageJ 兼容的格式（例如，tif）从成像系统导出原始图像数据并导入 ImageJ。

2. 转到分析 > 设置测量并选择平均灰度值。

3. 在不存在荧光的图像区域中绘制感兴趣区域 (ROI)，然后使用 Crtl + m 获得背景的平均灰度值（图 4）。

4. 取消选择 ROI，转到 Process > Math > Substract，输入背景值，然后按 OK 调整图像。

5. 绘制一个新的ROI覆盖一个区域，该区域可以用适用于所有图像的清晰参数定义（例如，覆盖从根尖到尖端上方^第8^个表皮细胞的共聚焦图像区域，一个包括五个表皮细胞的区域，一个整体造口等）（图 4）。使用 Ctrl + m 测量平均灰度值。值按顺序出现在可以导出到 Excel 的表格中。

注意：与样品的其余部分相比，受损组织将显示异常荧光（见图 3B）。确保不要将其包含在量化中。

6. 对于每个植物系和脂质，使用至少三个独立实验的量化，每个实验有五个幼苗来计算整个种群的平均值，并使用适当的t检验进行统计分析。

图 4. 使用 ImageJ 进行图像分析。

将系统设置为测量平均灰度值（右上）后，为每个图像定义一个方便的感兴趣区域 (ROI) 以量化背景（左上）。使用 Process > Math > Substract 命令（左下角）应用背景校正。最后，定义一个新的 ROI 并测量样本的平均灰度值。比例尺：25 μm。

食谱

注意：在 25°C 下使用纯化灵敏度为 18 MΩ.cm 的超纯水制备所有培养基。

1. 半强度 MS 液体培养基

a. 将 2.21 g L ^-1Murashige 和 Skoog (MS) 盐与维生素和 0.5 g/L 2-(N-morpholino) 乙磺酸 (MES) 混合在所需的水量中。

b. 用 2 M KOH 将 pH 值调节到 5.7。

c. 在 121°C 下高压灭菌 20 分钟并在 4°C 下储存。

2. 半强度 MS 板

a. 混合 MS 盐和 MES 并调整 pH 值，如上。

b. 添加 0.7% 植物琼脂。

c. 在 121°C 下高压灭菌 20 分钟。

d. 让培养基冷却至大约 60°C，然后倒入层流工作台内的方形培养皿中。

e. 让板冷却并凝固，将它们放入无菌袋中，并在 4°C 下储存。

3. 琼脂糖溶液

a. 将低熔点琼脂糖与所需量的水混合，以获得 0.5% (w/v) 的溶液。

b. 在微波炉中加热直到溶液开始沸腾，然后从微波炉中取出并混合均匀。

c. 如有必要，重复煮沸步骤，直到所有琼脂糖完全融化。

d. 保存在 60°C 的加热块或培养箱中以防止凝固。

4. C ₆-NBD-脂质储备

所有步骤都必须在玻璃管中进行，以防止脂质的非特异性结合。

注意：氯仿是一种化学危害。不要吸入气体/烟雾/蒸气/喷雾。穿戴合适的防护服。在通风橱中工作。

a. 使用玻璃注射器将所需量的 C ₆-NBD-脂质转移到 12 毫升玻璃管中。

b. 在温和的氮气流下干燥脂质，使管底部形成干燥的脂质膜。

c. 将 C ₆-NBD-脂质在 DMSO 中重悬至 10 mM 的最终浓度。

注意：DMSO 脂质悬浮液可在 -20°C 下储存在盖好玻璃容器中，最多可使用 2 周。然而，由于它们的吸湿性，它们易于沉淀。

致谢

该协议改编自我们之前的工作（Poulsen等，2015）。这项工作得到了丹麦国家研究基金会 (DNRF85) 和丹麦独立研究委员会|自然科学 (FNU，项目编号 10-083406) 的支持。RLLM 小组目前的工作得到了诺和诺德基金会（NovoCrops；项目编号 NNF19OC0056580）和丹麦独立研究基金的支持 | 自然与宇宙（项目编号 1026-00024B）。成像数据是在哥本哈根大学丹麦高级生物成像中心 (CAB) 收集的。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

本协议中不使用人类或动物受试者。

参考

1. Andersen, JP, Vestergaard, AL, Mikkelsen, SA, Mogensen, LS, Chalat, M. 和 Molday, RS (2016)。P4-ATPases 作为磷脂翻转酶 - 结构、功能和谜团。前生理学7：275。

2. Lopez-Marques, RL, Theorin, L., Palmgren, MG 和 Pomorski, TG (2014)。P4-ATPases：细胞膜中的脂质翻转酶。 Pflugers Arch 466(7): 1227-1240。

3. Poulsen, LR, Lopez-Marques, RL, Pedas, PR, McDowell, SC, Brown, E., Kunze, R., Harper, JF, Pomorski, TG 和 Palmgren, M. (2015)。模式植物拟南芥中的磷脂吸收系统。 国家通讯社6：7649。

4. Roland, BP, Naito, T., Best, JT, Arnaiz-Yépez, C., Takatsu, H., Yu, RJ, Shin, H.-WW 和 Graham, TR (2019)。酵母和人类 P4-ATP 酶使用保守的结构基序运输鞘糖脂。J Biol Chem 294：1794-1806。

5. Nintemann, SJ, Palmgren, M. 和 López-Marqués, RL (2019)。抓住你的另一面：对翻转酶突变表型的批判性审查。趋势植物科学24：468-478。

6. McDowell, SC, López-Marqués, RL, Cohen, T., Brown, E., Rosenberg, A., Palmgren, MG 和 Harper, J. F (2015)。的损失拟南芥P4-ATP酶ALA6和ALA7也妨碍花粉健身和改变花粉管质膜。Front Plant Sci 6：197。

7. Schneider, CA, Rasband, WS 和 Eliceiri, KW (2012)。NIH Image to ImageJ：25 年的图像分析。Nat 方法9：671-675。

8. Shin, HW 和 Takatsu, H.（2019 年）。P4-ATPases 的底物：除了氨基磷脂（磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺）。FASEB J 33：3087-3096。