材料和试剂

D-葡萄糖
NaNO ₃
KCl
MgSO 4。。 O
KH ₂ PO ₄
ZnSO 4 。 7H O
H ₃ BO ₃
MnCl 2 ^。 4H O
FeSO 4 ^。 7H <2> O
CoCl <2> ^。 5H ₂ O
CuSO 4 ^。 5H sub 2 O
（NH 4）6 Mo 7+ O 24+。在本发明的一个实施方案中， O
EDTA
精胺
亚精胺
PMSF
山梨醇
Halt蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：PI-78437）
NaCl
KCl
Tris碱
甘氨酸
甲醇
Bio-Rad蛋白质测定（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
Miracloth（Calbiochem，目录号：475855）
针对组蛋白H4乙酰基K5（1:2,500）的兔多克隆抗体（Abcam，目录号：ab51997）
针对组蛋白H4乙酰基K8（1:2,500）的兔多克隆抗体（Abcam，目录号：ab15823）
针对人C末端组蛋白H4抗体的兔多克隆抗体（1:2,500）（Abcam，目录号：ab10158）
针对TATA结合蛋白（TBP）（1：1,000）的小鼠单克隆抗体（Abcam，目录号：ab61411）
泛酰乙酰H4（1:1000）（Active Motif，目录号：39925）的小鼠单克隆抗体
山羊抗小鼠碱性磷酸酶缀合的抗体（1:5,000）（Life Technologies，Gibco ，目录号：13864-012）
山羊抗兔碱性磷酸酶偶联的抗体（1：5,000）（Pierce Antibodies，目录号：31342）
1步NBT/BCIP（Thermo Fisher Scientific，目录号：34042）
葡萄糖最小培养基（GMM）（参见食谱）
2x Laemmli 缓冲区（请参阅配方）
核隔离缓冲区（参见配方）
重悬缓冲液（见配方）
ST缓冲区（参见配方）
TBS-T（参见配方）
Western传输缓冲区（请参阅配方）
媒体食谱（见配方）

设备

砂浆和杵
Bio-Rad Mini-Protean凝胶电泳系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-3940）
半干印迹仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-3940）
轨道振动器
15 ml Falcon管
50ml Falcon管
30 ml离心管
Microfuge管

程序

核提取物：
注意：所有的核隔离步骤和解决方案都应保存在冰上。
1. 接种250ml液体葡萄糖基本培养基（GMM）至终浓度为1×10 6孢子/ml，并在37℃，250rpm培养48小时。
2. 通过真空过滤通过两层miracloth收集菌丝体。通过在纸巾之间挤压去除多余的水分。
3. 将菌丝体放入15毫升Falcon管中，在液氮中快速冷冻。冷冻后，在液氮下用研钵和研杵将菌丝体研磨成细粉。
4. 转移〜5克地面菌丝至50毫升Falcon管
5. 加入40ml冰冷的核分离缓冲液并涡旋混合。
6. 在1,000×g离心10分钟，4℃。通过双层miracloth过滤上清液到30ml离心管中。
7. 在4℃下离心10,000分钟，15分钟。
8. 弃去上清液并将沉淀物重悬于10ml冰冷的重悬缓冲液中
9. 在4℃下离心10,000分钟，15分钟。
10. 弃去上清液，并在1ml冰冷的ST缓冲液中重悬沉淀
11. 将悬浮液转移到1.5ml离心管中，并通过在4,000×g离心30分钟，室温下沉淀碎片。
12. 将上清液转移到无菌的1.5ml离心管中。如有需要，存放于-20°C
13. 使用Bio-Rad Protein Assay或等同物定量蛋白质水平。
Western印迹：
1. 用适当的样品上样缓冲液（例如Laemmli 2×样品缓冲液）将标准量的每个样品（例如50μg）加载到SDS-PAGE凝胶上。
  1. 我使用根据Schägger（2006）和Bio-Rad Mini Protean凝胶电泳系统进行的10％Tricine-SDS-PAGE。
1. 通过使用Bio-Rad半干燥印迹仪的电印迹（可以在室温下进行）转移到硝酸纤维素膜。
  1. 浸泡你的凝胶在西部转移缓冲液中30分钟，将硝化纤维素膜浸泡在西方转移缓冲液中10分钟，之后吸干。
  2. 在西方转移缓冲液中浸泡超厚的吸墨纸 - 根据半干转移手册构建"三明治"。从底部（+极）工作到顶部（ - 极）：超厚吸墨纸，硝酸纤维素膜，丙烯酰胺凝胶，超厚吸墨纸。
  3. 装配设备，在15 V运行1小时。
1. 在使用5％脱脂奶粉的TBS-T中的定轨振荡器上室温封闭膜1小时。
2. 与一抗在TBS-T中孵育1小时。 10ml对于小印迹是足够的。也可以在4℃下进行孵育，特别是如果计划重复使用一抗溶液。
3. 倒掉一抗溶液。初级抗体溶液可重复使用多达5次，尽管抗体浓度随每次使用而降低。（ n ote：这些溶液含有叠氮化钠作为防腐剂。
4. 在TBS-T中洗涤3×10分钟。应用二抗在TBS-T在室温下1小时。 10 ml足以进行小印迹
5. 倒出二抗溶液（不需要保留）。在室温下在轨道摇床上在TBS-T中洗涤3×10分钟
6. 加入一步NBP/BCIP显影液，轻轻搅拌。保持眼睛的信号强度，它只会是几分钟的发展和开发时间将是不同的每个抗体。当达到所需强度（或刚好在之前），倒出显影溶液，并在几次更换蒸馏水冲洗。在ddH 2 O中孵育〜20分钟。
  （注意：NBP/BCIP显影剂导致有色物质在膜上沉淀，因此，膜不能被剥离和重新探查。如果打算重新扫描膜，应当使用替代的第二抗体（例如HRP或荧光缀合的）。）
7. 印迹可以在台上干燥以保存。在直接暴露于光线下，信号会消失。

食谱

2×Laemmli缓冲液（1ml）

4％SDS	400μl10％SDS
10％2-巯基乙醇	100微升
20％甘油	200μl
0.004％溴酚蓝	40μl饱和溶液（0.1％）
0.125M Tris HCl	&125μl1M Tris HCl（pH 6.8）

用水稀释至1ml。

核分离缓冲液（1 L）

1 M山梨醇 182.2克

10mM Tris-HCl（pH7.5） 10ml的1M Tris-HCl

10 mM EDTA
·20ml 0.5M EDTA

高压灭菌，然后添加以下内容：

0.15mM精胺
52.2mg

0.5 mM亚精胺 127 mg

使用前，请添加：

2.5 mM PMSF
435 mg

注意：PMSF在水溶液中的半衰期短，为30-100分钟。
重悬缓冲液1 L 500 ml

1 M山梨醇 182.2克
91.1克

10mM Tris-HCl pH7.5
10ml 1M Tris-HCl
5 ml

1mM EDTA
2ml 0.5M EDTA
1 ml

高压灭菌，然后添加以下内容：

0.15mM精胺
52.2毫克
26.1mg

0.5 mM亚精胺 127 mg
63.5毫克

在使用之前，添加（可选）：

2.5 mM PMSF
435 mg
218 mg
ST缓冲液100 ml

1 M山梨醇 18.2克

10mM Tris-HCl（pH7.5） 1ml 1M Tris-HCl

高压灭菌。
在使用前加入蛋白酶抑制剂混合物，每1ml加10μl
TBS-T 1 L

NaCl
8克

KCl
0.2 g

Tris碱
3克

在〜800ml dH 2 O中混合，用HCl调节pH至7.4，然后将体积调节至1L。
高压灭菌器
冷却后，加入1ml吐温20.
西部传输缓冲区 1 L 9 L

Tris碱
3.03克
27.3克

甘氨酸
14.4 g
129.6克

甲醇
200 ml
1.8 L

用dH <2> O调整音量以校正音量
储存于4°C长达1个月

媒体配方
葡萄糖最小培养基（GMM）

20x硝酸钠盐^*	50 ml/L
微量元素（使用前摇动）	1 ml/L
D-葡萄糖	10 g/L

将pH调节至6.5
添加ddH2O到一升
高压灭菌15分钟，121℃
^* 2 Ox硝酸钠溶液

NaNO ₃	120克
KCl	10.4克
MgSO 4·7H 2 O 2·h/v	10.4 g
KH ₂ PO ₄	30.4克

将ddH <2> O添加到1 L
高压灭菌并在室温下储存。
^** T 比赛元素

ZnSO 4·7H 2 O·n/2	2.2 g
H ₃ BO ₃	1.1克
MnCl 2·4H 2 O ...	0.5克
FeSO 4·7H 2 O·m/2	0.5克
CoCl 2·5H 2 O·m/2	0.16 g
CuSO 4·5H 2 O·m/2	0.16 g
（NH 4）6 Mo 6 Mo 7 Au 24 CH 4 O 2 br />	0.11g
Na EDTA	5.0g

加入固体以得到80ml的H 2 O，在加入下一个之前完全溶解每一个。将溶液加热至沸腾，冷却至60℃。用KOH颗粒调节pH至6.5-6.8。冷却至室温，并用ddH 2 O调节体积至100ml。

参考文献

Palmer，J.M.，Perrin，R.M.，Dagenais，T.R.and Keller，N.P。（2008）。 H3K9甲基化调节烟曲霉中的生长和发育。 Eukaryot Cell 7（12）：2052-2060。
Schagger，H。（2006）。 Tricine-SDS-PAGE。 Nat Protoc 1（1）：16-22。
Soukup，A.A.，Chiang，Y.M.，Bok，J.W.，Reyes-Dominguez，Y.，Oakley，B.R.，Wang，C.C.，Strauss，J.and Keller，N.P.（2012）。构巢曲霉组蛋白4乙酰转移酶的过度表达EsaA增加次级代谢产物的激活。 Mol Microbiol 86（2）：314-330。