材料和试剂

50 ml Falcon 管（VWR International，目录号：734-0448）
透明底部 6 孔组织培养处理板（Scientific Laboratory Supplies，Falcon TM ，目录号：353046）
移液器吸头（STARLAB，目录号：S1110-3700 [10/20 µl XL Graded TipOne ® ]；S1111-1206-C [200 µl Yellow Bevelled TipOne ® Tip]；S1112-17200 [1,250 µl XL Graded TipOne ® ]
血清移液管（Corning，目录号：4101 [10 ml Stripette TM ]；4051 [5 ml Stripette TM ]；4251 [25 ml Stripette TM ]）
Opti-MEM TM （Thermo Scientific，Gibco TM ，目录号：11058021，储存条件：4°C，保质期：12 个月）
一次性称量舟 85 × 85 × 24 mm，PS，中型，白色，防静电（VWR，目录号：10770-448，储存条件：室温）
7毫升聚碳酸酯聚丙烯螺旋盖bijous（用于储存小体积样品的容器）（STARLAB，目录号：E1412-0710）
96孔德尔塔处理的白平底板（促进细胞附着和生长亲水性表面）（Fisher Scientific公司，Nunc公司，微孔，目录号：10182831）
组织培养瓶（Greiner Bio-One，目录号：660160 [175 cm 2 ]、658170 [75cm 2 ]）
1.5 ml Microcentrifuge 无菌 Eppendorf 管（STARLAB，TubeOne ® ，目录号：S1615-5510）
Millex-GP 注射器过滤器装置，0.22 µm 过滤器，聚醚砜，33 mm，伽马灭菌（默克，密理博，目录号：SLGP033RS，储存条件：室温）
人胚肾 293T，HEK293T 细胞（ATCC ® ，目录号：CRL-3216 TM ，储存条件：液氮气相）
Baby Hamster Kidney-21，BHK-21 细胞（ATCC ® ，目录号：CCL-10 TM ，储存条件：液氮气相）
质粒 DNA：ACE2 受体（pDISPLAY 表达载体，密码子优化，N 端信号肽 [鼠 Ig κ 链前导序列]，C 端 HA 标签），SARS-CoV Spike，SARS-CoV-2 Spike（ pcDNA3.1(+)，密码子优化，C 端 FLAG 标签）（BioBasic，加拿大 [Conceicao等人，2020]），p8.91，CSFLW，VSV-G（pcDNA3.1(+) 表达载体)（可根据要求提供）、pcDNA3.1（+）（Thermo Scientific，Invitrogen，目录号：V79020）和 pDISPLAY TM （Thermo Scientifc，Invitrogen TM ，目录号：V66020）
用于中和化验的血清或抗体，具有相关的生物风险评估和伦理批准
Dulbecco 改良 Eagle 培养基，DMEM（默克，Sigma-Aldrich，目录号：D5796 [含酚红]；D1145 [不含酚红]，储存条件：4℃， 12个月）
胎牛血清，FBS（生命科学生产，目录号：S-001A-BR，-20°C）
青霉素-链霉素，10,000 U/ml（Thermo Scientific，Gibco TM ，目录号：15240122，储存条件：-20°C，保质期：12 个月）
丙酮酸钠，100 mM（Thermo Scientific，Gibco TM ，目录号：11360070，储存条件：4°C，保质期：12 个月）
EDTA（0.5 M），pH 8.0，无RNase（Thermo Scientific，Ambion ® ，目录号：AM9269G）
1×胰蛋白酶-EDTA，0.25％，酚红（Thermo Scientific，Gibco TM ，目录号：2520072，储存条件：长期-20°C，使用时4°C，保质期：24个月）
Trans IT-X2 ®动态递送系统（Mirus，目录号：MIR 6000，储存条件：-20°C，保质期：12 个月）
聚乙烯亚胺，PEI（默克，Sigma-Aldrich，目录号：408727，储存条件：4°C）
无核酸酶，高压灭菌，0.2 µm 过滤 DEPC 处理水（Ambion，目录号：AM9906，储存条件：室温）
盐酸36.5-38.0％，生物试剂，用于分子生物学（Sigma-Aldrich，目录号：H1758-100 ml，储存条件：室温）
Bright-Glo TM荧光素酶测定系统（Promega，目录号：E2650，储存条件：-20°C）
55 ml StarTub PVC 试剂槽（STARLAB，无菌独立包装，目录号：E2310-1010）
DMEM-10%（见配方）
1 mg/ml PEI 的工作溶液（见配方）

设备

微生物安全柜，BSL-2（CAS，Biomat 2 – 2 级符合 BS EN 12469:2000）
CO 2培养箱（PHC Europe BV，PHCbi，目录号：MCO-170AICD-PE）
-86°C超低温冷冻柜（PHCbi、松下、vip plus、型号：MDF-DU900V）
-20°C 医用冷冻柜，带 14 个储物抽屉（利勃海尔，Profiline，型号：G5216）
4°C 冰箱（VDW CoolSystems、Labcold、Sparkfree，型号：RLV0217）
Sub aqua 5 plus 水浴（Fisher Scientific，Grant，型号：13251183）
用于血清移液器的自动移液器（Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，S1 Pipet Fillers，目录号：10072332）
单通道移液器（Gilson，Pipetman L，目录号：FA1001M [P2L 0.2-2 µl]，FA1003M [P20L 2-20 µl]；FA1005M [P200L 20-200 µl]；FA1006M，[P1000-1]
多道移液器（Thermo Scientific TM ，Finnpipette TM F2 多道移液器，目录号：4662010 [8 孔 5-50 µl]；4662070 [12 孔 30-300 µl]）
细胞培养倒置显微镜（Leica microsystem，型号：DMi1-S 40/0.45）
血细胞计数器（Fisher Scientific，Hirschmann TM Bright Lined Counting Chambers，目录号：105289616）
离心机（Kendo 实验室产品，Sorvall Legend RT，EASYset，型号：75004373）
台式高压釜（Fisher Scientific，Astell science，目录号：12755375）
GloMax ® Discover 酶标仪（Promega，目录号：GM3000）

软件

Microsoft Excel（Microsoft 365 for Windows，www.microsoft.com）
GraphPad Prism（8.4.2 版，适用于 Windows 的 GraphPad 软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥，www.graphpad.com）
GloMax ® Discover 系统软件（3.2.3 版，Promega，南安普敦，英国www.promega.co.uk）

程序

SARS-CoV-2和SARS-CoV假型病毒颗粒的产生
将 HEK293T 细胞维持在 75 cm 2组织培养瓶中的25 ml DMEM-10%（参见配方）中以生产假颗粒。
将 HEK293T 细胞以每孔7.5 × 10 5细胞的浓度接种在 3 ml DMEM-10% 的 6 孔板中，用于所需孔的总数。
使用快速上下左右运动搅动板中的细胞。这将确保细胞均匀分布且不会结块。在 37°C、5% CO 2下孵育过夜。
第二天，在下午设置转染混合物。接种的 HEK293T 细胞应在 60-80% 之间汇合，以获得最佳转染效率。设置 SARS-CoV-2 S 或 SARS-CoV S 质粒的转染，以及空载体阴性对照（无糖蛋白，无 GP）和阳性对照。例如，如果 SARS-CoV-2 S 和 SARS-CoV S 质粒位于 pcDNA3.1 骨架中，则使用空 pcDNA3.1 质粒作为无 GP 对照。通常，VSV-G 质粒被用作阳性对照，因为它被有效地转包衣到 HIV-1 颗粒中（即，它假型良好）。
在无菌的 1.5 ml Eppendorf 管中，加入 100 µl Opti-MEM 以及 0.6 µg p8.91 质粒（编码 HIV-1 gag-pol）、0.6 µg CSFLW 质粒（表达萤火虫荧光素酶的慢病毒骨架）和 0.5每孔微克糖蛋白（SARS-CoV-2 S、SARS-CoV S 或 VSV-G）或空载体 (pcDNA3.1)。在室温下孵育 5 分钟。
在单独的 1.5 ml Eppendorf 管中，每次转染加入 100 µl Opti-MEM plus 和 10 µl PEI (1 µg/ml)，并在室温下孵育 5 分钟。
对于 Opti-MEM 中的每 100 µl DNA 转染混合物，在 Opti-MEM 中加入 100 µl PEI，并用移液器剧烈混合十次。在室温下孵育 20 分钟。
将 200 µl 转染混合物的体积滴加到 6 孔板的每个孔中，并在 37°C、5% CO 2下孵育过夜。
第二天早上，使用血清移液器轻轻地从含有转染混合物的孔中取出培养基，方法是将培养皿向您倾斜并从孔的边缘抽吸，注意不要干扰单层。替换为 3 ml 的 DMEM-10%。在 37°C、5% CO 2下孵育过夜24 小时。
收集含有假型病毒颗粒的细胞上清液并转移至 50 ml Falcon，汇集类似转染的孔，并在 4°C 下储存。每孔用 3 ml DMEM-10% 替换培养基，并在 37°C、5% CO 2下孵育24 小时。
收获含有假型病毒颗粒的细胞上清液，并与前一天收获的假颗粒混合。在 4°C 下以2,500 × g离心10 分钟以去除细胞碎片。
将 4-5 ml 假颗粒分装到 bijous 中，并在 -80°C 下冷冻直至进一步使用。

注意：也可以在 10 cm 2培养皿中制备更大体积的假颗粒。此设置所需的必要细胞接种密度、DNA 浓度和体积可在表 1 中找到，并附有 6 孔板格式的相应值。无论使用的培养皿大小如何，步骤 A9-A12 都保持不变，仅更改所需的介质量。

表 1. 生成基于慢病毒的假型病毒的快速指南

检测 SARS-CoV-2 和 SARS-CoV 假颗粒感染性
在 6 孔板中以每孔7.5 × 10 5的密度接种 HEK293T 细胞，共 3 ml DMEM-10%。在 37°C、5% CO 2下孵育过夜。
确保铺板细胞的汇合度为 60-80%，以确保最佳转染效率。设置转染混合物以测试预先生成的 SARS-CoV-2 假颗粒。在无菌 1.5 ml Eppendorf 管中，每孔加入 200 µl Opti-MEM 和 500 ng 人 ACE2 质粒进行转染。使用前将 Tran IT -X2 转染试剂置于室温，直接向管中加入 2 µl（每 1 µg DNA），轻轻轻弹管混合。在室温下孵育 20 分钟。
将 200 µl 转染混合物逐滴加入预镀细胞的每个孔中，并在 37°C、5% CO 2下孵育过夜。
通过将培养皿向您倾斜并使用血清移液管从井的边缘吸出，从井中取出含有转染混合物的介质，注意不要干扰单层。每孔加入 1 ml DMEM-10% 并收获转染细胞。HEK293T 细胞附着力低，容易从板上脱落。因此，使用吸取液体的力足以收获细胞，但应注意确保获得无团块的单细胞悬浮液。胰蛋白酶应该避免，因为这将不必要地切掉的受体，阻碍未来的实验。转移到50ml隼和稀细胞2×10 5 / ml的DMEM-10％。
将 100 µl 稀释细胞（每孔2 × 10 4 ）接种到平坦的白底 96 孔板中，并在 37°C、5% CO 2下孵育过夜。
第二天，解冻一份 SARS-CoV-2 和/或 SARS-CoV 假颗粒，以及阴性（pcDNA3.1，无 GP）和阳性（VSV-G）对照。在透明底 96 孔板中滴定假颗粒，从顶行未稀释的病毒开始，在 DMEM-10% 中滴定 10 倍，最终体积为 100 µl 。
从接种了人 ACE2 转染细胞的白板上轻轻去除培养基，并添加 100 µl 滴定的假颗粒。在 37°C、5% CO 2下孵育 48 小时。
通过将培养皿向您倾斜并使用多通道移液器从孔边缘抽吸，从孔中取出培养基，然后加入 50 µl Bright-Glo TM用无血清、无酚红 DMEM 按 1:1 稀释。将板在黑暗中孵育 5 分钟，然后在 GloMax Multi+ 检测系统上根据发光协议测量荧光素酶信号，积分为 0.5 秒。
导出 USB 闪存驱动器上生成的 CSV 文件，以便使用 Microsoft Excel 进行分析，并在 GraphPad Prism 上绘制数据。

使用 SARS-CoV-2 和 SARS-CoV 假型病毒颗粒筛选 ACE2 受体使用情况（Conceicao等，2020）
将 BHK-21 细胞维持在 75 cm 2组织培养瓶中的25 ml DMEM-10%中。在 24 孔板中以 1 × 10 5 /孔的 DMEM-10%种子 BHK-21 细胞。在 37°C、5% CO 2下孵育过夜。
确保铺板细胞的汇合度为 60-80%，以确保最佳转染效率。在 100 µl Opti-MEM 中设置转染混合物以及 500ng 不同种类的 ACE2 表达构建体或空载体对照（例如，pDISPLAY）。使用前将 Tran IT -X2 转染试剂置于室温，每 1 µg DNA 加入 3 µl 直接加入管中，轻轻轻弹管混合。在室温下孵育 20 分钟。
将 100 µl 转染混合物逐滴添加到预镀 BHK-21 细胞的每个孔中，并在 37°C、5% CO 2下孵育过夜。
从孔中取出含有转染混合物的培养基，并在每孔中加入 0.5 ml 2 mM EDTA 的 PBS 以收获转染细胞。转移到 bijou 并用 DMEM-10% 将细胞稀释至 2 × 10 5 /ml。
将 100 µl 稀释细胞（每孔2 × 10 4 ）接种到平坦的白底 96 孔板中，并在 37°C、5% CO 2下孵育过夜。
从细胞中取出培养基并用相当于 10 6 -10 7 个相对光单位 (RLU) 的SARS-CoV-2 或 SARS-CoV 假颗粒或相同稀释度的无 GP 对照感染，并在 37°C 下孵育 48 小时， 5% CO 2 。
从孔中取出培养基，加入 50 µl Bright-Glo TM 以1:1 稀释的无血清、无酚红 DMEM。将板在黑暗中孵育 5 分钟，然后在 GloMax Multi+ 检测系统上在发光协议下读取 0.5 秒积分。
导出 USB 闪存驱动器上生成的 CSV 文件，以便使用 Microsoft Excel 进行分析，并在 GraphPad Prism 上绘制数据。

使用 SARS-CoV-2 和 SARS-CoV 假型病毒颗粒的中和试验
在设置中和测定之前，将 HEK293T 细胞以每孔7.5 × 10 5的密度接种在6 孔板中，总共 3 ml 的 DMEM-10%。在 37°C、5% CO 2下孵育过夜。
确保铺板细胞的汇合度为 60-80%，以确保最佳转染效率。在无菌 1.5 ml Eppendorf 管中，每孔加入 200 µl Opti-MEM 和 500 ng 人 ACE2 质粒进行转染。使用前将 Tran IT -X2 转染试剂置于室温，每 1 µg DNA 加入 2 µl 直接加入管中，轻轻轻弹管混合。在室温下孵育 20 分钟。
在预镀细胞的每孔中逐滴加入 200 µl 转染混合物，并在 37°C、5% CO 2下孵育过夜。
通过稀释血清/单克隆抗体 (mAb)/抑制剂，考虑要使用的稀释系列和添加假颗粒后的最终体积来设置中和测定。例如，以 1:10 稀释开始使用 2 倍稀释系列滴定的血清需要每孔 10 µl 血清在 100 µl 无血清 DMEM 中。这同样适用于已知浓度的 mAb 或抑制剂。
将 100 µl 稀释的血清/mAb/抑制剂一式三份添加到平底白底 96 孔板的顶行。向所有剩余的孔中加入 50 µl 无血清培养基。从顶行中取出 50 µl 并向下滴定板 2 倍，每次滴定前充分混合。不要滴定到底行。这整行将用作未处理的对照。
解冻一份 SARS-CoV 或 SARS-CoV-2 假颗粒并在无血清 DMEM 中稀释，相当于 ~10 6 RLU，每孔加入 50 µl，包括未处理的对照。在 37°C、5% CO 2下孵育 1 小时。
从与人ACE2转染6孔板中取出介质。加入1ml的DMEM-10％每孔和收获转染的细胞。HEK293T细胞具有低粘附，所以脱落板容易; 因此，移液液体的力应足以收获细胞（参见B4上文）。转移到50ml隼和稀细胞2×10 5 / ml的DMEM-10％。
将 100 µl 稀释细胞（每孔2 × 10 4 ）接种到每个含有假颗粒和未处理对照的血清/mAb/抑制剂的孔中。在 37°C、5% CO 2下孵育 48 小时。
从孔中取出培养基，加入 50 µl Bright-Glo TM 以1:1 稀释的无血清、无酚红 DMEM。将板在黑暗中孵育 5 分钟，然后在 GloMax Multi+ 检测系统上在发光协议下读取 0.5 秒积分。
导出 USB 闪存驱动器上生成的 CSV 文件，以便使用 Microsoft Excel 进行分析，并在 GraphPad Prism 上绘制数据。

数据分析

检测 SARS-CoV-2 和 SARS-CoV 假颗粒感染性
在制备一批假颗粒后，可以通过在已转染以表达 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的假型附着蛋白（Spike）的宿主受体（ACE2）的靶细胞上滴定它们来测试它们的感染性。未稀释的假型病毒（“1”）在 96 孔板中用 DMEM-10% 滴定 10 倍，一式三份（“10”、“100”、“1,000”等）（图 1A ）。
测量伪粒子的荧光素酶信号将生成一个 CSV 文件，该文件可以导出到 USB 闪存驱动器上并在 Microsoft Excel 上进行分析。然后可以将这些结果绘制在 GraphPad Prism 上以显示平均值± 每个伪粒子的 SD。
无 GP 阴性对照用作背景荧光素酶信号的指示，并且只有在每个相应稀释度中高于此值的值才应被视为被测试假颗粒的真实荧光素酶信号（图 1B，黑线）。通常，无 GP 和假型病毒之间的最小 ~2 log 动态范围和 10 5.5和 10 7.5 RLU之间的 RLU 信号（图 1B，阴影区域）足以用于后续检测。滴定系列也将有助于确定伪粒子的最低可用稀释度，以仍然获得高于背景的有意义的荧光素酶值。值得注意的是：以下要讨论的数据仅用于说明目的。
例如，在考虑为 SARS-CoV 获得的荧光素酶值时，尽管这些值高于最高稀释度的无 GP 对照，但两者之间的差异仅为 ~1 log，这超出了我们的使用标准（图 1B，蓝色行）。滴定假颗粒时，荧光素酶值在 1:10 稀释时也很快下降到可操作范围的下限以下，并在 1:1000 稀释时与无 GP 对照相同，使得该制剂的滴度为不适合用于后续分析的 SARS-CoV 假颗粒（图 1B ）。
相比之下，为 SARS-CoV-2 获得的荧光素酶信号比无 GP 控制的背景高约 2 log，并且 1:10 的假颗粒稀释度将在可用于后续分析的可用范围内，在1:100 稀释（图 1B，橙色线）。
VSV-G 假颗粒是检测中的阳性对照，其中观察到的荧光素酶值应高于 10 7 RLU（图 1B，绿线）。

图 1. 检测 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 假颗粒的传染性。（A）对于SARS-CoV的和SARS-CoV的-2赝滴定，10倍上清的系列稀释液用于感染HEK293T细胞中瞬时表达，其为白色平底96孔板的人ACE2受体。实验中还包括阴性（无 GP）和阳性（VSV-G）对照。每个条件一式三份进行测试。（B）感染后两天，信号的萤光素酶值被测量并绘制为平均值±SD。无GP控制指示背景的，并且只有高于此值赝粒子应被视为真正的感染性，在病毒的每种稀释液匹配。用于随后的中和测定和受体的使用屏幕上使用假颗粒的应显示没有GP和假型病毒之间〜2个log的动态范围和10的工作范围之间落入5.5至10 7.5 （阴影区）。

使用 SARS-CoV-2 和 SARS-CoV 假型病毒颗粒进行 ACE2 受体使用筛选
用一式三份设置的 SARS-CoV 或 SARS-CoV-2 假颗粒感染表达各种 ACE2 受体的细胞会产生荧光素酶信号，这些信号可以相互绘制（平均值±标准差）以描绘原始值。这些数据还给出了不同病毒受体趋向性的总体趋势（图 2A ）。
例如，水牛和山羊ACE2很好地允许SARS-CoV和SARS-CoV-2假颗粒进入，而小棕蝙蝠ACE2则不太明显。果子狸 ACE2 可以观察到病毒之间的差异，它允许 SARS-CoV 比 SARS-CoV-2 更有效地进入（图 2A ）。这些实验应在三个不同的场合至少进行三次，并显示具有代表性的数据。ACE2 受体的一个子集显示在图 2A 中，但在 Conceicao等人的补充图 3A 和 3C 中可以找到更深入、更广泛的分析。(2020)。
在此屏幕中设置了两个阴性对照。第一个是空载体对照 (pDISPLAY)，以确保测量的任何信号仅来自 ACE2 受体的过度表达。第二个是用无 GP 控制假颗粒制剂感染细胞，以确保荧光素酶信号可归因于假型病毒并为背景提供基线（图 2A ）。
然后可以使用原始荧光素酶信号来确定非同源宿主 ACE2 受体（水牛、果子狸、山羊、小棕蝠）与已知或同源宿主受体（在本例中为人类 ACE2）的相对使用。在不同天进行的三个独立实验的平均百分比用于获得这些值。人 ACE2 的荧光素酶值设置为 100%，然后未知宿主受体和阴性对照的荧光素酶值表示为相对于人 ACE2 的百分比。
这些结果也可以显示为热图，使用颜色梯度来显示受体使用的不同趋势。例如，人类 ACE2 (100%) 设置为绿色。低于此值的表达从绿色变为红色，表明与人类 ACE2 相比，ACE2 的使用较差。高于 100% 的值显示为深绿色，表明 ACE2 的使用量等于或大于人类 ACE2（图 2B ）。ACE2 受体的一个子集显示在图 2B 中，但更深入、更广泛的分析可以在 Conceicao等人的图 2A中找到。(2020)。
通过在xy散点图上绘制每种病毒相互之间的百分比值，计算 Pearson 相关系数，并绘制图，可以进行进一步分析以比较不同物种 ACE2 在 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 之间的受体趋向性拟合 95% 置信区间的线性回归线（数据未显示）。这种分析的一个例子也可以在 Conceicao等人的补充图 5 中找到。(2020)。

图 2. 使用 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 假颗粒的 ACE2 受体使用筛选。在我们的研究中，假颗粒被用作活病毒的替代物，以评估 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 与不同种类的 ACE2 受体的受体趋向性。使用伪粒子来评估 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 尖峰糖蛋白对来自不同物种的 ACE2 受体的使用，并表示为(A)原始荧光素酶信号值或(B)相对于人类 ACE2 的百分比。对于带有空载体对照（无 GP）或用空载体代替 ACE2 受体（pDISPLAY）进行模拟转染的假颗粒，包括阴性对照。数据表示为一式三份值的平均值 ± SD，每个实验在三个不同的场合进行 3 次，并显示了代表性数据。

使用 SARS-CoV-2 和 SARS-CoV 假型病毒颗粒的中和试验
使用假型病毒的中和试验是使用活病毒的低生物封闭性替代方法，并且可以以相对高通量的方式进行。这些中和分析可以在 mAb、血清或任何其他具有抑制病毒进入潜力的药物或抑制剂上进行。此处讨论的数据仅用于说明目的。
已知浓度的抑制剂（单克隆抗体/血清/药物）可以在 96 孔板中滴定三次，以确定对 SARS-CoV-2 进入的抑制程度。这是通过取未处理对照的平均值并表达与此相关的感兴趣 mAb 的每个单独复制的 RLU 值来完成的。然后可以将这些绘制为平均值±SD，并且应至少重复三次，并显示代表性数据：

（mAb 的 RLU 个体重复/未处理的 RLU 平均值）× 100

50% (IC50) 的抑制浓度应与未处理的、无 mAb 对照 (100%) 一起在图表上标明。低于此 IC50 线的值表示 S 介导的进入抑制，这可以在每个浓度下计算。例如，mAb2 能够以 100 µg/ml 的浓度抑制 SARS-CoV-2 S 进入约 80%（未处理的 20%）。在所有测试浓度下获得的 mAb2 值均低于 IC50 值，因此需要测试较低浓度以确定抑制极限。相比之下，mAb3 在 100 µg/ml 时抑制 SARS-CoV-2 S 进入约 90%，但在 12.5 µg/ml 时，抑制现在高于 IC50 阈值（图 3A ）。
与 mAb1 一样，也可能存在不抑制 SARS-CoV-2 S 的 mAb 示例。当未观察到进入抑制时，可能会看到略高于 100% 阈值的增加。导致这种增加的机制仍然未知并正在调查中，但就本分析而言，mAb 不能中和 SARS-CoV-2 S 的结论就足够了（图 3A ）。此类分析的示例可以在 Thakur等人中找到。(2021)。
在确定具有抗 SARS-CoV-2 S 抗体的个体的病毒进入抑制作用时，无论是自然感染还是疫苗接种后，通常都会计算中和抗体滴度以计算 SARS-CoV-2 S 中和的水平。最简单的计算方法是计算未处理对照的平均 RLU 并确定 IC50 值，即无血清对照的 50%。然后将中和滴度计算为稀释度的倒数，在该稀释度下，所有重复孔中无血清荧光素酶值的抑制率为 50%。然后可以将这些滴度制表或绘制在对数刻度上。
例如，血清样品 1 的滴度为 256，血清样品 3 的滴度为 512，表明 IC50 分别在 1:256 和 1:512 的稀释度下计算。由此可以得出的结论是，血清样本 3 能够比血清样本 1 更有效地中和 SARS-CoV-2 S 介导的进入，因此具有更高的抗体滴度（图 3B ）。
对于血清样本 4，该值已绘制为 1,024，这是该测定的检测上限 (ULoD)。这意味着该样品能够在所有孔和测试的最低稀释度下抑制 50% 的荧光素酶信号。该血清必须用更广泛的稀释系列重新滴定，以确定中和滴度。对于血清样品 2，稀释范围内的所有孔均未产生可记录的 IC50。因此，中和滴度被绘制为低于检测下限 (LLoD) 的任意值，在这种情况下为 40，但由于真实滴度未知，将报告为 <40（图 3B ）。使用此方法的 IC50 中和滴度的示例可以在 Thakur等人的图 4F 中找到。(2021) 以及 Graham等人的图 2D 和 2E 。(2020)。

图 3. 使用 SARS-CoV-2 假颗粒的中和试验。SARS-CoV-2 Spike 中和试验是在(A)单克隆抗体 (mAb)存在下进行的，以相对于未处理对照或(B)血清样本的百分比表示，数据表示为中和滴度。在加入表达人 ACE2 的 HEK293T 细胞之前，将 SARS-CoV-2 假颗粒与 mAb 或血清孵育 1 小时。通过计算荧光素酶信号 (IC50) 降低 50% 时的浓度 (mAb) 或稀释度 (血清) 来确定对 SARS-CoV-2 Spike 介导的病毒进入的抑制。数据代表一式三份值的平均值 ± SD，每个实验在三个不同的场合进行 3 次，并显示了代表性数据。

笔记

程序 A，步骤 11 提到了在用于后续测定之前对假颗粒制剂进行离心以去除细胞碎片。其他协议需要在储存前使用 0.45 µm 过滤器进一步过滤伪粒子。这一步不在我们的实验室中进行，因为我们观察到过滤后传染性降低。
制造商通常建议转染的最佳汇合度为 60-80%。因此，可能需要根据所用细胞的特性改变接种密度。例如，如果使用的细胞类型较大（例如，BHK-21 细胞比 HEK293T 细胞大）或具有高倍增率，我们建议从较低的接种密度开始。另一方面，如果细胞较小，或生长速度较慢，并且难以达到汇合（例如，Calu3 细胞），或者确实是悬浮细胞，您可能需要从较高的接种密度开始。在这两种情况下，我们建议测试不同的播种密度，以找到任何给定实验的最佳值。
图 4显示了感染前 HEK293T 细胞的最佳融合度 (60-80%) 的示例。细胞应均匀分布在整个孔中（即，在一个区域内没有结块或聚集），在单层中有明显的间隙（图 4A ）。HEK293T 细胞的细胞形态在汇合处应显示为扁平和多边形，这表明对塑料的粘附（图 4B ）。

图 4.明场图像说明 HEK293T 细胞的 60-80% 最佳汇合度。HEK293T 细胞以 7.5 × 10 5接种在6 孔培养皿中，含有 3ml DMEM-10%。第二天，细胞应在 60-80% 之间汇合，以获得最佳转染。(A)在 4 倍放大率下约 80% 汇合的 HEK293T 示例，细胞均匀分布在孔和可见间隙中。(B) HEK293T 细胞的高倍放大 (10 倍)，其中细胞在转染前应呈现明亮、平坦和多边形。

在各个步骤中用于转染的 DNA 浓度已经过优化以用于这些分析。重要的是，任何使用的质粒都经过优化以解决载体平台和密码子优化的可变性。
在无 GP 控制中有时可以看到更高的信号（在 10 4 -10 5 RLU 范围内），这可能是非特异性摄取“秃头”假颗粒或来自生产细胞的碎片的结果。为了减少这种背景信号，应注意确保生产细胞不会在低汇合处转染，因为这会导致细胞病变效应 (CPE) 的发展。
此处进行的所有实验均仅使用过表达的 ACE2 进行。S2 蛋白裂解为 S2' 所需的丝氨酸蛋白酶 TMPRSS2 的共表达可以促进病毒和细胞膜的融合以及 Spike 蛋白的裂解（Hoffmann等，2020）。TMPRSS2 未包含在我们的宿主范围测定中，因为我们想专门检查不同 ACE2 的影响——实际上，TMPRSS2 的过度表达导致 ACE2 限制被掩盖（Conceicao等，2020）。
其他公式可用于确定 IC50 值，产生不同的滴度。如果在整个分析过程中使用相同的方法并且所使用的方法得到完整描述，则这是可以接受的。用于计算中和滴度的其他公式包括 (1) 在XY图上绘制数据以插入中和值后，在 GraphPad Prism 上使用非线性回归分析工具(2) 插入感染性点使用固定公式将无血清对照样品的值降低到 50%（Logan等人，2016 年），并且 (3) 确定在所有重复孔中看到完全中和的最高稀释度，并考虑其他孔显示中和。然后通过将这些值输入 Spearman Karber 公式来计算中和（Lambe等人，2021 年）。
中和滴度并不总是需要记录为 IC50 值。可以根据给定测定中预期的中和水平选择其他截止点，并提供更严格的中和量度（例如，80%中和，IC80）。
不同 ACE2 受体的表面表达可能不同，这可能会影响 Spike-ACE2 相互作用的水平，从而导致对结果的误解。因此，重要的是研究和标准化所用 ACE2 受体的细胞表面表达。本文描述和使用的哺乳动物 ACE2 受体在 C 端带有 HA 标签，这允许通过流式细胞术检测表面表达。此外，通过蛋白质印迹评估蛋白质表达（Conceicao等，2020）。

食谱

DMEM-10%
补充有 10% FBS、1% 青霉素/链霉素 10,000 U/ ml和 1% 100 mM 丙酮酸钠的DMEM ，在 37 °C和 5% CO 2下培养。
1 mg/ml PEI 工作溶液
称量粘性液体以获得 50 毫克/毫升的水（例如，0.42 克 PEI + 8.4 毫升水）并转移到无菌的 50 毫升 Falcon。
将 Falcon 放入设置为 50°C 的水浴中，并使用 1 ml 移液器轻轻上下移液直至完全溶解。
用水稀释至 1 mg/ml（例如，取 0.5 ml 的 50 mg/ml 原液并加入 24.5 ml 水）
当前状态下的解决方案将是非常基本的。使用稀盐酸将 pH 值调节至 7。
通过 0.22 µm 过滤器过滤并分装到 1.5 ml Eppendorf 管中。
使用时可在 -20°C 下长期储存，在 4°C 下最多可保存 1 个月。

致谢

这项工作得到了 Dalan Bailey 的以下资助：英国研究与创新 (UKRI, https://www.ukri.org/ ) 医学研究委员会 (MRC) 新研究者研究资助 (MR/P021735/1)，UKRI生物技术和生物科学研究委员会 (UKRI - BBSRC, https://www.ukri.org/ ) 项目拨款（BB/R019843/1 和 BB/T008784/1，学生资助）和研究所战略计划拨款 (ISPG)皮尔布莱特研究所（BBS/E/I/00007034、BBS/E/I/00007030 和 BBS/E/I/00007039）。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
我们要感谢本文描述的协议源自的研究论文，其中包括：“SARS-CoV-2 Spike 蛋白对哺乳动物 ACE2 蛋白具有广泛的趋向性”（Conceicao等人，2020 年），“微融合抑制测试：量化病毒介导的细胞-细胞融合的抗体中和作用”（Thakur等人，2021 年）和“用复制缺陷型病毒载体 COVID-19 候选疫苗进行初步加强疫苗接种的免疫原性评估ChAdOx1 nCoV-19”（格雷厄姆等人，2020 年）。
我们还要感谢以下人员在建立 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 假型系统方面提供的帮助：Ed Wright（萨塞克斯大学病毒假型部门）、Nigel Temperton（肯特大学病毒假型部门）、Brian Willett（格拉斯哥大学病毒研究中心）、Emma Bentley 和 Giada Mattiuzzo（国家生物标准与控制研究所）和 Michael Letko（国家过敏和传染病研究所）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

Bertram, S., Glowacka, I., Blazejewska, P., Soilleux, E., Allen, P., Danisch, S., Steffen, I., Choi, SY, Park, Y., Schneider, H., Schughart , K. 和 Pohlmann, S. (2010)。TMPRSS2 和 TMPRSS4 促进流感病毒在 Caco-2 细胞中不依赖胰蛋白酶的传播。J Virol 84(19)：10016-10025。
Conceicao, C., Thakur, N., Human, S., Kelly, JT, Logan, L., Bialy, D., Bhat, S., Stevenson-Leggett, P., Zagrajek, AK, Hollinghurst, P.,等。(2020)。SARS-CoV-2 Spike 蛋白对哺乳动物 ACE2 蛋白具有广泛的趋向性。PLoS 生物学18(12)：e3001016。
DePolo, NJ, Reed, JD, Sheridan, PL, Townsend, K., Sauter, SL, Jolly, DJ 和 Dubensky, TW, Jr. (2000)。在人细胞中产生的 VSV-G 假型慢病毒载体颗粒被人血清灭活。Mol Ther 2(3)：218-222。
Ferrara, F. 和 Temperton, N. (2018)。假型中和分析：从实验室工作台到数据分析。方法协议1(1): 8。
Graham, SP, McLean, RK, Spencer, AJ, Belij-Rammerstorfer, S., Wright, D., Ulaszewska, M., Edwards, JC, Hayes, JWP, Martini, V., Thakur, N.等。(2020)。用复制缺陷型病毒载体 COVID-19 候选疫苗 ChAdOx1 nCoV-19 评估初免疫苗接种的免疫原性。NPJ 疫苗5(1)：69。
Grehan, K.、Ferrara, F. 和 Temperton, N. (2015)。一种生产表达病毒假型的 MERS-CoV 尖峰的优化方法。方法 X 2：379-384。
Hoffmann, M., Kleine-Weber, H., Schroeder, S., Kruger, N., Herrler, T., Erichsen, S., Schiergens, TS, Herrler, G., Wu, NH, Nitsche, A., Muller, MA、Drosten, C. 和 Pohlmann, S.（2020 年）。SARS-CoV-2 细胞进入取决于 ACE2 和 TMPRSS2，并被临床证明的蛋白酶抑制剂阻断。单元格181(2)：271-280 e278。
Hsu, M.、Zhang, J.、Flint, M.、Logvinoff, C.、Cheng-Mayer, C.、Rice, CM 和 McKeating, JA (2003)。丙型肝炎病毒糖蛋白介导假型逆转录病毒颗粒的 pH 依赖性细胞进入。Proc Natl Acad Sci USA 100(12): 7271-7276。
Lambe, T., Spencer, AJ, Thomas, KM, Gooch, KE, Thomas, S., White, AD, Humphries, HE, Wright, D., Belij-Rammerstorfer, S., Thakur, N., et al 。(2021)。ChAdOx1 nCoV-19 在恒河猴和雪貂挑战模型中对 SARS-CoV-2 的保护作用。公共生物学4（1）：915。
Logan, N., McMonagle, E., Drew, AA, Takahashi, E., McDonald, M., Baron, MD, Gilbert, M., Cleaveland, S., Haydon, DT, Hosie, MJ 和 Willett, BJ ( 2016）。有效生成携带麻疹病毒糖蛋白的水泡性口炎病毒 (VSV) 假型及其在量化病毒中和抗体中的用途。疫苗34(6)：814-822。
Negrete, OA, Levroney, EL, Aguilar, HC, Bertolotti-Ciarlet, A., Nazarian, R., Tajyar, S. 和 Lee, B. (2005)。EphrinB2 是尼帕病毒（一种紧急的致命副粘病毒）的进入受体。自然436（7049）：401-405。
Salvador, B.、Zhou, Y.、Michault, A.、Muench, MO 和 Simmons, G. (2009)。基孔肯雅病毒假型病毒的表征：鉴定难治细胞系并证明由 E1 糖蛋白突变介导的细胞趋向性差异。病毒学393(1)：33-41。
Sharkey, CM, North, CL, Kuhn, RJ 和 Sanders, DA (2001)。罗斯河病毒糖蛋白假型逆转录病毒和用于其生产的稳定细胞系。J Virol 75(6)：2653-2659。
Simmons, G., Reeves, JD, Grogan, CC, Vandenberghe, LH, Baribaud, F., Whitbeck, JC, Burke, E., Buchmeier, MJ, Soilleux, EJ, Riley, JL, et al。(2003)。DC-SIGN 和 DC-SIGNR 结合埃博拉糖蛋白并增强巨噬细胞和内皮细胞的感染。病毒学305(1)：115-123。
Takada, A., Robison, C., Goto, H., Sanchez, A., Murti, KG, Whitt, MA 和 Kawaoka, Y. (1997)。埃博拉病毒糖蛋白功能分析系统。Proc Natl Acad Sci USA 94(26): 14764-14769。
Thakur, N., Conceicao, C., Isaacs, A., Human, S., Modhiran, N., McLean, RK, Pedrera, M., Tan, TK, Rijal, P., Townsend, A., Taylor, G., Young, PR, Watterson, D., Chappell, KJ, Graham, SP 和 Bailey, D. (2021)。微融合抑制测试：量化病毒介导的细胞 - 细胞融合的抗体中和作用。J Gen Virol 102(1)。
Wool-Lewis, RJ 和 Bates, P. (1998)。使用假型病毒表征埃博拉病毒进入：识别受体缺陷细胞系。J Virol 72(4)：3155-3160。
Zufferey, R.、Nagy, D.、Mandel, RJ、Naldini, L. 和 Trono, D. (1997)。倍增减毒慢病毒载体实现了体内有效的基因传递。Nat Biotechnol 15(9): 871-875。

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