材料和试剂

按蚊饲养和感染
1. Whatman 纸（Whatman ® ，3MM CHR 纸，目录号：3030-917）
2. 棉垫
3. 培养皿（Gosselin TM ，目录号：BP93B-101，直径：90 mm，高度：14.2 mm）
4. 移液管（COPAN Diagnostics，3 ml，目录号：200CS01）
5. 透明塑料杯
6. 纸杯
7. 网队
8. 弹力带
9. 载玻片（Fisherbrand TM ，目录号：12-544-2）
10. 盖玻片（Menzel TM ，20 mm × 20 mm，目录号：BB02000200A153MNZ0）
11. 肝素管（Beckton Dickinson，目录号：367886）
12. 来自柬埔寨Pursat省的蚊子Anopheles dirus (St Laurent et al ., 2015)
13. TetraBits 全鱼食 (Tetra ® )
14. 4-氨基苯甲酸（PABA；Sigma-Aldrich，目录号：100536-1KG）
15. Nutroplex ® （多种维生素，Unilab Inc.）
16. 二溴荧光素二钠盐（Mercurochrome，Sigma-Aldrich，目录号：M7011-25G）
17. 人 AB 血清（美国州际血库公司）
18. 蔗糖（多米诺纯蔗糖，UPC 049200045503）
19. 20% 蔗糖和多种维生素溶液，4°C 保存（见食谱）

剂量反应药板制备
1. 小体积 384 深孔聚苯乙烯微孔板TM ，无菌，（Greiner Bio-One，目录号：784261）
2. 用于 PCR 和冷藏的铝箔，无菌（VWR ® ，目录号：60941-076）
3. 过滤的移液器吸头，无菌（Thermo Scientific TM ，Finntip TM ，目录号：94052060）
4. AP96 P50 吸头，无菌（Beckman Coulter，Biomek ® ，目录号：A21582）
5. DMSO，无菌（Tocris Bioscience TM ，目录号：3176/100ML）
6. 测试化合物在 DMSO 中稀释至 50 mM，每种最小体积为 15 μl
7. 尼日利亚菌素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：N7143），在 DMSO 中稀释至 200 μM

肝细胞接种培养
1. 250 ml 真空过滤系统（MilliporeSigma TM ，Stericup TM ，目录号：S2VPU02RE）
2. 9×9英寸无绒布（Electron Microscopy Sciences，目录号：100488-446），高压灭菌
3. 一次性试剂储液器，无菌，50 ml（Biotang Inc.，Accuraci*，目录号：90105）
4. 384 孔，I 型胶原蛋白处理，平底微孔板（Greiner Bio-One TM ，CellCoat TM ，目录号：781956）
5. 245 mm Square BioAssay Dish（Corning TM ，目录号：431111）
6. 细胞培养/培养皿（Thermo Scientific TM ，Nunc TM ，目录号：150288）
7. 1.5 ml Eppendorf 管（Eppendorf TM ，目录号：022431021）
8. 50 ml 锥形离心管（Corning TM ，Falcon，目录号：352070）
9. 细胞培养级水，无菌（Corning TM ，目录号：25055CV）
10. InVitroGRO TM CP 培养基（BioIVT，目录号：Z99029）
11. 青霉素-链霉素-新霉素（PSN）抗生素混合物，100×（Gibco TM ，目录号：1560055）。分装并在 -20°C 下冷冻
12. 庆大霉素，10 mg/ml（Gibco TM ，目录号：1570072）
13. 台盼蓝细胞活力试剂，0.4% w/v（Corning TM ，目录号：25900CI）
14. 完全肝细胞培养基（CM），250毫升（见食谱）

子孢子感染
1. 载玻片（Fisherbrand TM ，目录号：12-544-2），用纸巾包裹并高压灭菌
2. 细胞培养/培养皿（Thermo Scientific TM ，Nunc TM ，目录号：150288）
3. 6 孔板，无菌（Corning TM ，Costar TM ，目录号：3516）
4. 带管的一次性 Pellet Pestel（Fisherbrand TM ，目录号：12-141-368），打开并通过高压灭菌器消毒
5. 1.5 ml Eppendorf 管（Eppendorf TM ，目录号：022431021），高压灭菌
6. 用 70% 乙醇水溶液喷雾瓶
7. PBS，无菌（Gibco TM ，目录号：10010023）
8. 青霉素-链霉素-新霉素（PSN）抗生素混合物，100×（Gibco TM ，目录号：1560055），等分并在 -20°C 下冷冻
9. RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX TM ，不含碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Gibco TM ，目录号：61870-036）
10. 用于清洗蚊子的 PSN-PBS 混合物，5 毫升（参见食谱）

复合处理
1. OmniTray TM单孔板（Thermo Scientific TM ，Nunc TM ，目录号：264728）
2. Pin tool Clean Solution（V&P Scientific Inc.，目录号：VP 110）
3. 细胞培养级水，无菌（Corning TM ，目录号：25055CV）
4. DMSO（Fisher BioReagents TM ，目录号：BP231-100）
5. 70% 乙醇水溶液
6. 甲醇（Fisher，目录号：S25426）
7. Lintfree Blot Paper（V&P Scientific Inc.，目录号：VP522100）
8. 1-氨基苯并三唑（Caymen Chemical，目录号：15252），在细胞培养级水中稀释至 100 mM，无菌（Corning TM ，目录号：25055CV），过滤除菌，等分，并在 -20°C 下储存（参见配方）
9. 含 ABT 的完整肝细胞培养基（CM），250 毫升（参见食谱）

免疫荧光 (IF) 检测和高内涵成像 (HCI)
1. 用于 PCR 和冷藏的铝箔，无菌（VWR ® ，目录号：60941-076）
2. 微孔板密封膜（Axygen TM ，目录号：PCRSP）
3. PBS，无菌（Gibco TM ，目录号：10010023）
4. 多聚甲醛，16% w/v 水溶液，不含甲醇（Alfa Aesar TM ，目录号：433689L）
5. 牛血清白蛋白（BSA，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP1600-100）
6. Triton TM X-100（Acros Organics TM ，目录号：327372500）
7. 重组小鼠抗 UIS4（Noah Sather，Seattle Children's Research）（Schafer等人，2018 年）
8. IgG（H+L）高度交叉吸附山羊抗小鼠 Alexa Fluor ® ，488（Invtrogen TM ，目录号：A11029）
9. Hoechst 33342 三盐酸盐，三水合物-FluoroPure TM级（Invitrogen TM ，目录号：H21492）
10. 4% PFA 固定缓冲液，40 毫升（见配方）
11. IF 染色稀释缓冲液，1% w/v BSA，0.3% v/v Triton X-100，50 ml（见配方）
12. 初级 IF 染色剂（rPvUIS4），25 毫升（见配方）
13. 二级 IF 染色剂（Alexa Fluor 488），25 ml（参见配方）
14. Hoechst 染色剂，25 毫升（见配方）

设备

按蚊饲养和感染
1. 解剖钳（Fine Science Tools Inc.，Dumont #5-Fine）
2. 实验室托盘，聚丙烯，可高压灭菌（Labbox，目录号：TRYP-001-001。H × L × W：75 mm × 375 mm × 300 mm 和 TRYP-002-001 H × L × W：75 mm × 450 mm × 350 毫米）
3. 离心机 5702R（Eppendorf ® ，目录号：5703000322）
4. 水夹套玻璃迷你进料器（Glastechniek Peter Coelen BV，荷兰，直径 15 毫米）（图 2A 和 2B）
5. 用于连接迷你进料器的硅胶管（Labbox，目录号：SILT-008-005，内部直径：8 mm）（图 2A 和 2B）
6. 加热循环器（Huber，参考：KISS 202C）
7. 定制的笼子（30 × 30 × 30 厘米和 20 × 20 × 20 厘米），上面覆盖着网
8. 与 Parafilm 膜（Hemotek，目录号：SP6W1-1）一起使用的Hemotek 膜进料系统（Hemotek ®）
9. InsectaVac 真空动力吸虫器（BioQuip Products，目录号：2809B）
10. 立体显微镜 Leica S6E
11. 显微镜 Leica DM1000LED

剂量反应药板制备
1. 血细胞计数器（SKC，Inc.，C-Chip TM ，目录号：DHCN015）
2. 带有 Drierite TM干燥剂（Sigma-Aldrich，目录号：737828）的药物干燥器（Bel-Art，Dry-Keeper TM ，目录号：H420560001/EMD ）
3. F2 16 通道移液器，1-10 μl（Thermo Scientific TM ，Finnpipette TM ，目录号：4662080）
4. F2 16 通道移液器，5-50 μl（Thermo Scientific TM ，Finnpipette TM ，目录号：4662090）
5. Biomek 4000 自动液体处理器（Beckman Coulter），带有 MP200 8 通道移液器工具、储液器支架（Beckman Coulter，目录号：372795）和 40 ml 无菌储液器（Beckman Coulter，目录号：372790）

肝细胞接种培养
1. 带 10 ×物镜的倒置光学显微镜
2. 37°C 细胞培养箱，含 5% CO 2
3. 能够旋转管和微量滴定板的台式离心机
4. 水浴设置为37°C
5. 铝制旋转支架，通过 CNC 加工定制（参见图 4C 中的设计）

子孢子感染
1. 血细胞计数器（SKC，Inc.，C-Chip TM ，目录号：DHCN015）
2. 带 10 ×物镜的倒置光学显微镜
3. 带直尖头的镊子，4.25 英寸（Excelta，目录号：3C-SA-PI）
4. 微型解剖针的持针器（Roboz，目录号：RS-6063）配有钨解剖针，0.25 毫米，超细（Roboz，目录号：RS-6064）
5. 装有细碎冰的冰桶

复合处理
1. 定制的浮动 384 孔针工具，20 nl 槽针，直径 0.457 毫米，长 50.8 毫米，外露针长 17 毫米（V&P Scientific, Inc.，目录号：FP1S20），手动使用套件（V&P Scientific, Inc） .，目录号：BGPK），带扩展坞（V&P Scientific Inc.，目录号：VP 550A）
2. 用于注册浮动销多印迹复制器的对齐夹具（V&P Scientific, Inc. 目录号：VP 381N），此处称为“文库复印机”
3. 重型印迹站（V&P Scientific Inc.，目录号：VP 540DB）

高内涵成像免疫荧光检测
1. Lionheart FX 自动显微镜 (Biotek ® )，配备 FITC 和 DAPI LED 立方体以及匹配的滤光片组、激光自动对焦立方体和 4 ×物镜

软件

Gen5 酶标仪和成像仪软件（Biotek ® , www.biotek.com）
CDD Vault（协作药物发现，https://www.collaborativedrug.com/）

程序

按蚊饲养

用放置在笼子顶部的 Hemotek 装置每 4 天给雌性蚊子喂血。为女性提供持续获得 10% 蔗糖溶液的机会。喂食后两天，将含有潮湿棉花层的培养皿插入笼中，上面覆盖着一张 Whatman 纸盘。第二天早上，取回放置在 Whatman 纸上的鸡蛋（图 2C）。将装有鸡蛋的 Whatman 纸放入装有水的实验室托盘中。
孵化后，每天用磨碎的锦鲤鱼饲料随意喂养幼虫。每两天换一次幼虫水，每隔一天清洗一次剩余的食物。在第一次转移时计数幼虫，小实验室托盘中的幼虫密度为 150 只，大型实验室托盘中的幼虫密度为 300 只。
每天早上收集蛹，使用底部 0.5 厘米切掉的移液管；这是为了确保有足够大的孔开口，以避免损坏蛹（图 2D）。将蛹转移到透明塑料杯中（最多 100 只蛹/杯）。加水至杯顶以下 2 厘米处。把杯子放在笼子里。
出苗后 3 天，用 20% 蔗糖和多种维生素溶液喂养蚊子。在第 4 天，将其更改为 5% 蔗糖溶液。在第 4 天晚上去除糖。在第 5 天，使用真空抽吸器将女性转移到纸杯上，纸杯上覆盖着由松紧带固定的网（图 2D）。将杯子放在黑暗中。在第 7 天之前，雌性可以使用传染性血粉。在第 5 天和第 6 天，如果雌性没有被用于传染性血粉，则在晚上在化妆棉上提供 5% 的糖溶液 1 小时。

图 2. 蚊子饲养和感染。

A. 使用水套微型进料器的膜进料装置的侧视图。B. 带有保存血液的封口膜的水套微型喂食器的底视图。C. 带有蚊卵的 Whatman 纸（一只雌性An. dirus蚊子被包括在尺寸范围内）。D. 单个An。按蚊蛹。E. 一个带有网状盖子的纸杯，用于在出苗后第 5 天盛放雌性。F. 在感染血粉后 7 天解剖后，蚊子中肠用 PBS 中的 1% 汞色素染色，在 10 倍物镜下放大成像。箭头显示卵囊。G. 带有从An 中收获的间日疟原虫子孢子的血细胞计数器。感染后第 16 天的dirus唾液腺，在放大倍数下使用 20 倍物镜成像。白框是 0.1 毫米 × 0.1 毫米，箭头表示三个示例子孢子。

按蚊感染

在知情同意后，通过在肝素管中静脉穿刺从有症状的患者身上收集间日疟原虫感染的血液分离物。在所有操作过程中，将血液保持在 37°C。
在 37°C 下以 1,300 × g离心血液5 分钟。
取出患者血浆并用热灭活（56°C 30 分钟）初始人类 AB 血清代替，以避免传播阻断免疫（Bousema等人，2012 年）。混合红细胞和血清。使用泵和水浴将 450 µl 这种混合物移入保持在 37°C 的水套微型进料器中（图 2A 和 2B）。
允许女性暴饮 1 小时。
将雌性从杯子转移到笼子里。一旦进入笼子，喂食和未喂食的雌性就可以通过吸血雌性变大变暗的腹部在视觉上进行分类（使用吸虫器）。移除所有未进食的雌性。在 26°C 和 80% 湿度的标准昆虫条件下饲养雌性，加入 10% 蔗糖 + 0.05% PABA 溶液直至解剖。
在感染后血餐的第 6 天，解剖 10 只女性的中肠，并在立体显微镜下收集 1% 红汞溶液中的中肠（视频 1）。

视频 1. An 的目视视图。dirus中肠解剖以计数卵囊。

将中肠安装在盖玻片下，并以 10-20 倍放大率计算卵囊数（图 2F）。
对于阳性饲料（即，第 6 天有卵囊的雌性），在喂食后第 14 天和第 16 天之间对 10 只雌性进行唾液腺解剖试验。解剖中肠以评估卵囊开口和唾液腺，以确定子孢子负载（参见程序 E、图 2G 和视频 2、图 3）。

视频 2. An 的目视视图。dirus唾液腺解剖以获得子孢子。

剂量反应药板制备
1. 以下说明用于从 50 mM 最高剂量生成包含 14 种测试化合物的源药物板，其中包含 12 点稀释系列 (1:3)，每个浓度有重复的孔。按 384 孔板的行绘制所有化合物，包括从 200 μM 稀释的 DMSO 载体（阴性）对照和尼日利亚菌素（阳性）对照。根据需要标记药物板（表 S1）。
2. 化合物供应商可以将药物以粉末或液体形式发送，可以单独装瓶，也可以放在微量滴定板中。如果是粉末，则在无菌 DMSO 中制备 10 mM 或 50 mM 的储备溶液；50 mM 库存是限制最终工作溶液中 DMSO 总量的理想选择，并提供足够的药物来检测活性，尽管该化合物可能会被肝脏代谢灭活。
  1. 分子式重量 (FW) 是碱和盐（如果有）的总分子量。如果化合物具有盐成分，请使用 FW，而不是碱的分子量。
  2. 10 mM 储备液：100,000 × (mg/FW) = μl DMSO 添加以制备 10 mM 溶液。
  3. 50 mM 储备液：20,000 × (mg/FW) = μl DMSO 添加以制备 50 mM 溶液。
  4. 例如，伯氨喹可作为具有455.34g/mol的分子式重量的伯氨喹二磷酸盐商购获得。从含有 10 mg 二磷酸伯氨喹粉末的小瓶开始，可以通过向小瓶中添加 2,196 µl DMSO 来制备 10 mM 储备液，或者通过向小瓶中添加 439 μl DMSO 来制备 50 mM 储备液。
3. 将 15 µl 50 mM 原液添加到第 1 列和第 13 列的相应行中。
4. 将板移入 Biomek 4000 的罩子中。将 10 ml 无菌 DMSO 添加到储液器支架中的高压灭菌的四分之一储液器中。使用 MP200 头和稀释系列功能，以 10 µl/s 的速度混合 5 µl 源柱 5 倍，没有任何气隙或吹出（以减少气泡形成）。然后吸取并吸出 5 µl 到第二根色谱柱，并按上述方式混合 8 次。重复稀释系列直到第 12 列，然后停止并更换吸头。将此模式应用于稀释系列的复制井（第 13-24 列），以及尚未被 8 通道头稀释的化合物的替代行（视频 3）。

视频 3. 使用 Biomek 4000 在 384 孔微量滴定板中进行稀释系列。

用无菌箔密封盖住稀释的板，并以 100 x g旋转1 分钟以去除气泡（图 3A）。板在 -80°C 下储存并在干冰上运输。

肝细胞接种培养
1. 在从受感染的蚊子中解剖唾液腺以进行子孢子感染前 2 天进行肝细胞接种。
2. 制备 250 ml 完整的肝细胞培养基（CM，参见下面的配方，如果需要更多培养基，请放大体积），标记 384 孔测定板，将水浴加热至 37°C，获取血细胞计数器，并为种子做好准备将必要的试剂转移到试管中。播种过程中速度很重要，因此所有材料必须在解冻前准备好。
3. 使用 16 通道移液器和培养基储液器，向每个孔中加入 20 µl CP 培养基以预先润湿检测板。确保液体在每个孔的底部（而不是在侧面）；如果需要，在坚硬的表面上轻轻敲击检测板，以确保所有液体都停留在孔的底部。
4. 在继续之前，确定要解冻的肝细胞冷冻管数量。BioIVT 的原代人肝细胞通常包括每瓶 6 × 10 6 -10 × 10 6 个活细胞，每个板需要 6.25 × 10 6 -8.5 × 10 6 个细胞（有关更多信息，请参见上面的肝细胞批次选择部分）。然后，将 (#小瓶) × 4 ml CM 添加到 50 ml 锥形离心管中。
5. 向 Eppendorf 管中加入 50 µl 台盼蓝。
6. 按照适当的安全预防措施，从液氮储存中获取冷冻管。轻轻拧开每根管子的盖子，排出里面可能存在的氮气，从而防止可能的冷冻管爆炸。立即在水浴中解冻 120 秒，不要将小瓶开口浸入水中，也不要旋转。120 秒后，小瓶内会暂时出现冰条。盖上盖子并用 70% 乙醇快速冲洗小瓶以进行无菌操作，然后用干净的抹布擦干小瓶。将小瓶移入无菌区域（即II 类生物安全柜-BSC）并取下小瓶盖。特别使用带有 1 ml 吸头的 1 ml 移液器，慢慢取出解冻的小瓶内容物并转移到 50 ml 带有 CM 的锥形管中。不要混合冷冻管内容物。解冻后，从所有小瓶中收集冷冻管内容物，从 50 毫升收集锥中取出 1 毫升 CM，用于冲洗和收集小瓶中的所有剩余材料（现在应该完全解冻）。50 毫升试管的体积现在应为 (# 小瓶) × 5 毫升。
7. 旋转 50 ml 锥形管以混合 50 µl CM 中的肝细胞并将其转移到带有台盼蓝的 Eppendorf 管中。缓慢混合三次，然后将 10 µl 混合物转移到血细胞计数器中。对所有四个 4 × 4 象限中的活细胞进行计数，并使用以下方法计算细胞浓度：

和活细胞数量使用：

生存力应高于 75%。使用 CM，将浓度调整为：

例如，假设目标种子密度为每孔 18,000 个活细胞，并使用来自单个冷冻管的7.5 × 10 6 个活细胞进行解冻，将浓度调整为每微升 900 个细胞

使用 10 或 25 ml 血清移液管充分混合并转移到试剂容器中。使用 16 通道移液器每孔转移 20 µl 细胞混合物。

笔记：

重要说明 1：不要在 16 通道移液器上使用吹出功能。这将导致气泡并降低种子准确性
重要说明 2：肝细胞在培养基中快速沉降。在停止并使用 10 ml 血清移液管重新混合肝细胞悬浮液之前，只接种 1 个板，然后继续下一个板；如果需要，可以更频繁地混合。

为防止蒸发造成的边缘效应，准备一个带有 4 个小培养皿和 10 毫升水的生物测定皿，如图 3B 所示。将平板置于 37°C 和 5% CO 2的细胞培养箱中。在感染子孢子之前不要更换培养基。
在感染当天，将所有要感染的检测板倒置到 BSC 中的铝旋转支架中（图 3C），然后将它们放入带有微量滴定板支架的离心机中，以 40 × g的速度旋转1 分钟，以最小加速度至删除所有媒体。将板和铝制旋转支架转移到 BSC，并使用无菌无绒布清洁板顶部。使用培养基水库和 16 通道移液器，每孔加回 20 µl CM。（额外的 20 µl CM 将作为感染程序的一部分添加）。

图 3. 药物板制备、测定板孵育和旋转支架。

A. 使用 Biomek 4000 进行连续稀释后的示例药物板。 B. 将检测板储存在具有四个小培养皿的检测盘中，以保持湿度并防止在细胞培养箱中孵育期间的边缘效应。当平板在培养箱、显微镜和生物安全柜之间移动时，化验盘还有助于防止引入污染微生物。白色箭头表示培养皿中的水，黄色箭头表示检测板。C. 用于去除用过的介质的定制铝制旋转支架的设计示意图，值为 mm。该设计已上传至 NIH 3D Print Exchange ( https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-015808 )。

子孢子感染
1. 在安全的节肢动物收容设施 2 级 (ACL2) 中进行解剖设置
  1. 在台式冰桶中获取碎冰。
  2. 在 6 孔板的左上孔中加入 5 ml PSN-PBS 溶液，在中顶孔中加入 5 ml 70% 乙醇，在右顶孔中加入 5 ml PBS。
  3. 通过将 10 ml PBS 添加到 15 ml 锥形管中来构成解剖缓冲液。
  4. 通过向Eppendorf 管中加入 100 µl RPMI（不含 NaHCO 3 ）来构成收集缓冲液。
  5. 将 6 孔板、解剖缓冲液和收集缓冲液放在冰上。
  6. 获取培养皿并放置在冰桶旁边。
  7. 在高压灭菌的载玻片上放置几个 20 µl 解剖缓冲液；解剖每只蚊子需要一个水坑。一次只制作一张载玻片。
2. 通过网盖喷洒 70% 乙醇来固定蚊子，确保所有蚊子都被固定，然后取下盖子。使用镊子，快速但小心地将所有蚊子移动到培养皿中，然后将所有蚊子移动到冰上的 PSN-PBS 中。不要让蚊子在乙醇中休息超过 2 分钟，因为这会使蚊子脱水并降低子孢子的活力。

笔记：

安全注意事项：确保所有蚊子都用乙醇固定。乙醇不会立即杀死蚊子。将蚊子视为传染媒介，直到解剖后。切勿在 ACL2 房间外打开杯子。
安全注意事项：从杯子中取出所有蚊子，并在解剖之前、期间和之后计算所有蚊子。
安全注意事项：当蚊子没有杯子时，人员不应进出 ACL2 房间。
安全注意事项：使用培养皿和 6 孔板上的盖子将蚊子包围起来，以进一步确保没有蚊子可以逃脱。
技术说明：将蚊子放在冰上的 PSN-PBS 缓冲液中，以保持子孢子的活力。
技术说明：一旦用乙醇喷洒蚊子，在 60 分钟内完成解剖步骤；设置一个计时器。过长的解剖时间会降低子孢子的生存能力。

使用镊子，通过它们的长鼻挑选单个蚊子，并将每个蚊子拖过 6 孔板的中间（70% 乙醇）和右侧（PBS）顶孔，确保让它们在每个孔中浸泡 1-2 秒。通过抓住长鼻将蚊子拉过液体将极大地帮助解剖，因为腿和翅膀会被液体向前运动扫回。乙醇步骤是最重要的，因为乙醇涂层将有助于释放蚊子表面的静电和表面张力。将蚊子完全浸泡在洗涤的乙醇部分。确保以相同的方向（即，仅从左到右）将蚊子拉过洗涤物，以确保翅膀和腿远离头部。将每只洗过的蚊子放入载玻片上的单独 PBS 水坑中（图 4A-4E 和视频 4）。
（解剖器可能是右手或左手，以下是右手拿着镊子和左手拿着解剖针）。长鼻朝右，右手握住镊子，左手握住针头。用镊子夹住头部，同时用针几乎水平地平行于载玻片固定胸部。然后，同时将头部向右拉，同时用针压住胸部。通过练习，腺体会在适当的压低和拉力下从胸腔中脱落——用于压低胸腔的压力量是关键：压力过大会导致胸腔穿孔，压力不足导致当头部处于胸腔时，腺体仍留在胸腔内。拉开了。在继续使用镊子固定头部的同时，通过用针钩住腺体来收集腺体，并使用旋转运动将它们放在冰上的收集缓冲区中，因为腺体可能会粘在针上。对每只蚊子重复此操作（视频 2）。

笔记：

技术说明：不要在解剖缓冲液周围翻找缺失的腺体；这增加了每个蚊子的时间并增加了下游微生物污染的机会。
技术说明：每个解剖载玻片可以设置 6 到 10 只蚊子。处理的蚊子总数取决于解剖器的数量和解剖速度。一旦确定了每个解剖器的清洁度，就可以在解剖器之间汇集唾液腺。

视频 4. 在唾液腺解剖之前将蚊子清洗并放置在载玻片上。

将收集管以 1,000 × g离心2 分钟。腺体会粘在 Eppendorf 的侧面，需要离心以沉淀腺体。
将带有腺体的收集缓冲液保持在冰上，然后移至 BSC。使用匹配的杵（通过高压灭菌器消毒）通过将杵对着 Eppendorf 管底部旋转 10 次来压碎腺体。在收集管中加入 100 µl RPMI（不含 NaHCO 3 ）以在去除过程中冲洗研杵。使用 100 µl 吸头上下吹打 100 次，进一步压碎和混合腺体和子孢子。
获得一个新的 Eppendorf 管并填充 18 µl PBS。在该管中，混合 2 µl 压碎的腺体和子孢子，按 1:10 稀释。将 10 µl 稀释液转移到血细胞计数器并在两个 4 × 4 象限中计数子孢子。使用以下方法计算净子孢子：

和子孢子数量通过使用：

通常在每个检测孔中接种 15,000 到 20,000 个子孢子；因此，每个平板需要6.4 × 10 6 -8.5 × 10 6个子孢子。一次解剖 300 只蚊子通常会产生 15 × 10 6 -35 × 10 6个子孢子，因此一次解剖可以接种 2 到 6 个板。确定有多少检测板可以被感染并放置：

进入一个水库。在收集缓冲液中加入所有子孢子，使用 200 µl CM 清洗收集管。用血清移液管将整个体积至少混合 10 倍，以确保子孢子悬浮均匀。使用 16 通道移液器，向每个孔中加入 20 µl 接种物。

将每个接种的测定板以 200 × g旋转5 分钟，然后将测定板放回培养箱中的生物测定皿中。不要在感染日晚些时候更换培养基。
在感染后的第二天、在每个治疗日添加化合物之前以及在特定检测版本指示的日期（图 1A）中执行介质更换。要更换介质，请将一个板倒置到 BSC 中的铝旋转支架中（图 3C），然后将其放入带有微量滴定板支架的离心机中，以 40 × g的速度以最小加速度旋转1 分钟以去除所有介质。将板和铝制旋转支架转移到 BSC，并使用无菌无绒布清洁板顶部。使用培养基水库和 16 通道移液器，每孔加回 40 µl CM。

复合处理
1. 通过离心（200 × g 10 分钟）解冻药物板，以确保化合物溶液在孔的底部，并且在解冻时不会交叉污染相邻的孔。
2. 所有检测版本都包括在处理前更换培养基。将测定板倒置到 BSC 中的铝旋转支架中（图 3C），然后放入带有微量滴定板支架的离心机中，以 40 x g旋转1 分钟，以最小加速度去除所有介质。将板和铝制旋转支架转移到 BSC，并使用无菌无绒布清洁板顶部。使用培养基水库和 16 通道移液器，每孔加回 40 µl CM（每板 17 ml）。对于包括 ABT 处理的检测版本，用 ABT 培养基代替 CM 替换培养基。
3. 在 BSC 中设置 pin 工具项。放置 5 个多功能托盘和 5 个印迹托盘。用 32 毫升无菌水和 8 毫升 V&P 清洁溶液填充第一个多功能托盘。用 45 毫升无菌水填充第二个托盘。用 50 毫升甲醇填充第三个托盘。用 20 毫升无菌水和 20 毫升 DMSO 填充第四个托盘。用 45 毫升 70% 乙醇填充第五个托盘（图 5）。
4. 通过在第一个托盘（V&P 清洁溶液）中浸入针三次，然后进行印迹，执行早上的 pintool 清洗。重复浸渍和印迹。在第二个托盘（水）和第三个托盘（甲醇）中执行并重复一次三次浸渍和印迹清洗。然而，在最后一次甲醇浸渍后，将销钉工具放在其支架中而不是吸干，因为这将对销钉进行消毒（图 4 和视频 5）。

图 4. 唾液腺解剖概述。

A. 指定用于解剖的蚊子被转移到用网布覆盖的塑料杯中，然后移入解剖室。B. 在冰上的 6 孔板中制备蚊子洗涤缓冲液。C. 首先用 70% 乙醇喷洒蚊子，然后将其转移到 PBS 中含有抗生素（青霉素、链霉素和新霉素）的 6 孔板的第一个孔中，准备用于解剖。然后在 70% 乙醇中洗涤单个蚊子并在 PBS 中冲洗。E. 将洗过的蚊子朝同一方向放置在无菌载玻片上。视频 4 演示了如何清洗蚊子。F. 在立体显微镜下观察载玻片。在冰上用 RPMI 将腺体解剖到 Eppendorf 管中（左上角的蓝色框）。G. 使用解剖针（右手）和镊子（左手）的解剖器。视频 2 演示了如何解剖唾液腺。

视频 5. 清洗 Pin 工具并将化合物转移到检测板中的方法。

放置药物板和化验板，取下盖子，并在两者上放置文库复印机。将针在药物板中浸三次，然后转移到检测板上。让别针在化验板上休息 30 秒（图 5）。
如果在同一天处理多个板，请执行板间 pintool 清洗（图 5）。在第四个托盘（水和 DMSO）、第五个托盘（乙醇）、第一个托盘（V&P 清洁溶液）、第二个托盘（水）和第三个托盘（甲醇）中执行和重复三次浸渍和印迹清洗。然后进行处理浸渍和转移（步骤 F5）。
处理完所有盘子后，执行晚上的 pintool 清洗（图 5）。在第四个托盘（水和 DMSO）、第五个托盘（乙醇）、第一个托盘（V&P 清洁溶液）、第二个托盘（水）和第三个托盘（甲醇）中执行并重复三次浸渍和印迹清洗。

图 5. 销工具清洗和化合物转移。

晨洗步骤用于准备针工具以进行治疗。处理后，清洗和清洁销工具。在给定的一天处理完最后一个板后，工具在存放过夜之前再次清洗和清洁。

免疫荧光检测 (IF) 和高内涵成像 (HCI)
1. 在所用检测版本的特定终点日，通过将检测板倒置到 BSC 中的铝旋转支架中来去除培养基（图 3C），然后将其放入带有微量滴定板支架的离心机中，并以 40 × g 的速度旋转1 分钟以最小的加速度移除所有介质。将板和铝制旋转支架转移到 BSC，并使用无菌无绒布清洁板顶部。使用储液器和 16 通道移液器进行以下 IF 步骤。
2. 将板移入化学通风橱中，每孔加入 20 µl 4% PFA 固定液（每板 8.5 ml），室温孵育 1 小时。
3. 去除固定溶液并通过添加和去除每孔 40 µl PBS 洗涤两次。
4. 将 40 µl 初级 IF 染色剂 (rPvUIS4) 添加到每个孔中（每板 17 ml），用箔密封盖住，并在 4°C 下放置过夜
5. 通过添加和去除每孔 40 微升水（每板净 51 毫升），去除主要污渍并洗涤三次。可以通过 16 通道移液器或将板轻弹到水槽中来完成去除。
6. 将 40 µl 二级 IF 染色剂 (Alexa Fluor 488) 添加到每个孔中（每板 17 ml），用箔纸密封，并在 4°C 下放置过夜
7. 通过添加和去除每孔 40 微升水（每板净 51 毫升），去除二次染色并洗涤三次。可以通过 16 通道移液器或将板轻弹到水槽中来完成去除。
8. 在室温下向每孔（每板 17 毫升）中加入 40 µl Hoechst 染色剂，持续 1 小时。
9. 去除 Hoechst 污渍并通过添加和去除每孔 40 µl 水（每板净 34 ml）洗涤两次。可以通过 16 通道移液器或将板轻弹到水槽中来完成去除。
10. 用箔密封盖住板并继续使用 HCl，或在 HCl 之前储存在 4°C。
11. 使用 4×、10× 或 20× 物镜对板进行成像。对于 Lionheart FX，使用 4 倍物镜以每孔 4 个视野捕获整个孔。使用 DAPI 作为配准通道的 Gen5 中作为图像处理模块提供的标准拼接算法，在分析之前拼接图像。

量化高内涵成像数据

注意：此步骤使用带有 Gen5 分析软件的 Lionheart FX 进行演示。可以在其他 HCI 系统上开发类似的工作流程。

强度值会因运行而异；在执行分析之前修改值。
选择带有寄生虫的孔（即不是有效剂量的活性化合物）来修改分析。打开分析设置窗口。
查看蓝色通道，使用光标估计平均核信号强度。还可以将鼠标悬停在背景上以了解背景强度。取原子核和背景强度之间的差异，并将此数字用作您的主要掩码值。例如，如果原子核强度为 26,000，背景为 6,000，则主遮罩使用值 20,000。使用 8-20 µm 的尺寸截止（图 6）。

图 6. 设置肝细胞核的主掩码。

使用亚群分析进一步细化主掩码结果。包括一个最小峰值以避免计数碎片；核通常比碎片具有更亮的峰值强度。其他亚群参数包括圆度（例如，>0.33）和平均信号（例如，>17,000）（图 7）。

图 7. 设置肝细胞核的亚群参数。

要量化催眠体，请打开绿色通道并创建新分析。使用光标估计最暗的休眠体的强度。对于主掩码，使用仍然突出所有休眠体的可能的最高值。使用 5-15 µm 的尺寸截止（图 8）。

图 8. 为休眠体设置主掩码。

使用亚群分析进一步细化催眠主掩码结果。包括最大平均值以忽略明亮的人工制品。其他亚群参数包括面积（例如>28 和 <100）、圆度（例如>0.4）、平均信号（例如>21,000 和 <45,000）和峰值信号（例如>25,000）（图 9）。

图 9. 设置休眠体的亚群参数。

要量化裂殖体，请打开绿色通道并创建新分析。使用光标估计最暗的裂殖体的强度。对于主遮罩，使用仍能突出所有裂殖体的尽可能高的值。井边缘往往更亮；避免在井边缘突出显示非特定对象。使用 15-150 µm 的尺寸截止值（图 10）。

图 10. 为裂殖体设置主要掩膜。

使用亚群分析进一步细化裂殖体初级掩膜结果。包括最大平均值以忽略明亮的人工制品。其他亚群参数包括面积（例如>150 和 <10,000）、圆度（例如>0.11）、平均信号（例如>10,000 和 <30,000）和峰值信号（例如>19,000）（图 11）。

图 11. 为裂殖体设置亚群参数。

关于休眠体和裂殖体种群之间界限的说明：这两个种群在 8 天和 12 天的实验（v1、v2、v3）中可能不会完全分离，但在我们的 20 天实验 (v4) 中，我们确实注意到休眠体是 28- 100 µm 2 (图 12)。

图 12. 肝脏阶段寄生虫大小直方图和形式分类。

红色框表示顶部图表的缩放区域。红色和蓝色点代表来自两个不同独立实验的寄生虫。休眠体为 28-100 µm 2 ，但在 100-150 µm 2之间发现了少量非常大的休眠体（或可能重新激活裂殖体）。

执行分析后，执行导出以获得每口井的细胞核数量、每口井的休眠体数量、每口井的裂殖体数量以及每口井的净裂殖体增长（以 µm 2 为单位）（例如，参见表 S2））。继续进行数据标准化和曲线拟合。

数据分析

技术和独立复制：原始 v1 检测仅包括具有 8 点稀释系列的单孔，用于剂量反应检测（Roth等人，2018 年）。所有测试化合物至少测定一次以将每种化合物表征为无活性或活性。然后将活性化合物重新铺板并至少再测定一次以获得第二个独立实验以确认活性和效力。v2 和 v3 检测包括用于剂量反应检测的扩展 12 点稀释系列（Maher等人，2021 年）和每个浓度的重复孔，以产生更准确的剂量反应曲线。所有测试化合物至少测定一次以将每种化合物表征为无活性或活性。然后将活性化合物重新铺板并至少再测定一次以获得第二个独立实验以确认活性和效力。v4 检测包括每个浓度的一式两份、一式三份或四份孔，并且对一起铺板的每个化合物集合进行至少三个独立实验。

对照：对照孔用于标准化数据。最初的 v1 是在发现离子载体在该测定形式中具有活性之前开发的；因此，没有可用的阳性（休眠体杀灭）对照。休眠体抑制被测量为阴性 (DMSO) 对照孔的减少。值得注意的是，我们发现使用未感染的孔作为阳性对照（代替对感染孔的有效治疗）人为地增加了信噪比，因为没有死亡或垂死的寄生虫，也没有死亡的寄生虫碎片，这会导致高背景信号，在未感染的孔中产生。v2、v3 和 v4 检测是在发现莫能菌素杀死间日疟原虫休眠体后开发的；因此，这些检测版本都包括离子载体阳性对照。莫能菌素是第一个使用的此类离子载体，但无论使用何种宿主肝细胞，尼日利亚菌素都更有效且更稳定（Maher等，2021）。因此，在 CDD Vault 中，通过以下公式计算每个孔中寄生虫生长的抑制：

曲线拟合和异常值去除：曲线拟合设置在 CDD Vault 的用户界面中进行管理。曲线拟合被限制在-10% 到 20% 之间的最小抑制、最大抑制≥50% 和斜率 ≥0.0，所有曲线都没有表现出超过 50% 抑制的点被视为“无效”。

当存在明显的技术错误时（即边缘效应或用户错误，肝细胞或子孢子被意外添加到列中），但因为我们注意到未清除细胞毒性浓度高于有效浓度的休眠子，异常值被删除（Posfai等人，2020 年；Maher等人，2021 年），如图 13 所示，在毒性条件下也会去除异常值。对于作为细胞毒性量度的细胞核计数，计算CC 20而不是 CC 50 ，因为大多数化合物没有表现出完整的细胞毒性剂量反应曲线，肝细胞核减少 >50%。

图 13. 示例剂量反应曲线和毒性点标记。

Nigericin 是一种离子载体对照物，针对裂殖体和休眠体的活性产生 S 形剂量反应曲线，但对细胞核不产生活性。一个示例测试化合物对裂殖体和休眠体产生 sigmoidal 剂量反应曲线，但在最高 1-2 个剂量时也是有毒的。这些点从休眠体剂量反应曲线中删除，以实现更好的曲线拟合。

笔记

该协议已开发用于管理在检测工作流程中的各个点注意到的可变性和不可预测性。例如，没有两个人类肝细胞供体是相同的，永生化人类肝细胞几乎不像原代肝细胞那样支持疟原虫感染（Roth等，2018）。同样，我们预计每个间日疟原虫分离株的确切遗传组成不同；在疟原虫蚊子阶段进行基因重组后，这些分离株可能由克隆种群、混合种群或由兄弟姐妹或半兄弟姐妹组成的群体组成。此外，我们注意到不同合成批次的化合物表现出不同的效力。尽管存在这些自然混杂的变量，我们还是针对多种人类和寄生虫背景测试了多批活性化合物，发现活性是一致的，根据上述确切变量，效力会发生一些变化。还必须管理技术可变性：每种蚊子感染产生不同数量的卵囊和子孢子；因此，要解冻的小瓶和要感染的测定板的滑动刻度用于管理可用的生物材料。虽然我们始终用 15,000-20,000 个子孢子感染井，但目前没有方法可以预测从接种物中衍生出多少肝脏阶段的寄生虫。图 14 显示了单次解剖产生的子孢子数量的变异性和特定接种物后形成的肝脏阶段寄生虫。

图 14. 子孢子产生、基于接种物的感染率和井井感染率的证明变异性。

A. 示例数据显示从 100-300 只蚊子的个体解剖中收获的子孢子。指示了启动 1、2、3、4、5 或 6 个检测板所需的子孢子目标数量。B. 示例数据显示在特定接种量后形成的肝脏阶段 (LS) 寄生虫的平均数量之间存在弱相关性（线性回归，Y = 0.006701 * X + 16.54，R 2 = 0.07）。C. 示例数据显示了每口井的平均休眠体数与特定板的 Z' 因子之间的相关性。每口井大约 50 个休眠体足以产生正 Z' 因子。

食谱

20% 蔗糖和多种维生素溶液（4°C 保存）

10 克蔗糖

500毫升纯净水

20滴Nutroplex ®

完全肝细胞培养基 (CM) (250 ml)

250 μl 庆大霉素（1:1,000 稀释）

2.5 ml PSN 溶液（1:100 稀释）

用 CP 培养基填充至 250 毫升并过滤除菌。

最多保存 7 天，在 4°C 下储存。

ABT 原液

将 37.3 ml 细胞培养级水加入 500 mg 1-氨基苯并三唑，制成 100 mM 原液。

过滤除菌，分装到无菌 Eppendorf 管中，-20°C 保存。

含 ABT 的完整肝细胞培养基 (CM)（250 毫升）

250 μl 庆大霉素（1:1,000 稀释）

2.5 ml PSN 溶液（1:100 稀释）

250 μl 100 mM ABT 库存（1:1,000 稀释）

用 CP 培养基填充至 250 毫升并过滤除菌。

最多保存 7 天，在 4°C 下储存。

用于清洗蚊子的 PSN-PBS 混合物（5 毫升）

将 500 μl 100×PSN 溶液添加到 4.5 ml PBS（1:10 稀释）中。

4% PFA 固定缓冲液（40 毫升）

将 10 ml 16% 多聚甲醛添加到 30 ml PBS（1:4 稀释）中。

在 4°C 下储存长达 1 个月。

IF 染色稀释缓冲液（1% w/v BSA，0.3% v/v Triton X-100，50 ml）

将 150 μl Triton X-100 添加到 50 ml 锥形管中。

向锥形管中加入 500 mg BSA。

加入 PBS 至 50 ml，摇动混合 1 小时。

在 4°C 下储存长达 1 个月。

初级 IF 染色剂 (rPvUIS4)，25 毫升

将 1 μl rPvUIS4 与 25 ml IF 稀释缓冲液（1:25,000 稀释）*混合。

* 1:10,000 稀释可能效果更好，具体取决于应用

需要时新鲜。

二级 IF 染色剂（Alexa Fluor 488）（25 毫升）

将 25 μl Alexa Fluor 488 与 25 ml IF 稀释缓冲液（1:1,000 稀释）混合。

需要时新鲜。

Hoechst 染色剂（25 毫升）

将 25 μl 10 mg/ml Hoechst 33342 与 25 ml PBS 混合（1:1,000 稀释，10 μg/ml 终浓度）。

需要时新鲜。

致谢

我们感谢柬埔寨东北部的疟疾患者参与这项研究。来自药物研究的 HCI 数据部分由佐治亚大学的生物医学显微镜核心产生，并得到佐治亚研究联盟的支持。资金由比尔和梅琳达·盖茨基金会（OPP1023601 至 DEK）和疟疾药物风险投资公司（RD/2017/0042 至 BW 和 AV，RD/16/1082 和 RD/15/0022 至 SPM 和 DEK）提供。该协议反映了许多同事的贡献，包括在我们的原始 v1 分析（Roth等人，2018 年；Posfai等人，2020 年）和 v2 分析（Maher等人，2021 年）报告中撰写的那些人。表 S1改编自 Maher等人。(2021) 并在知识共享 4.0 许可下复制 ( http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ )。

利益争夺

作者没有要声明的竞争利益。

伦理

人类受试者方案经柬埔寨国家健康研究伦理委员会批准。该方案符合关于涉及人类受试者的医学研究的伦理原则的赫尔辛基宣言（2002 版），并且所有志愿者都获得了知情书面同意。

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