材料和试剂

1. 1,000 µl 吸头（Tarsons，目录号：521020）
2. 机架式过滤器吸头，1,000 µl（Tarsons，目录号：528104）
3. 200 µl 吸头（Tarsons，目录号：521014）
4. 机架式过滤器吸头，200 µl（Tarsons，目录号：528106）
5. 10 µl 吸头（Tarsons，目录号：521000）
6. 机架式过滤器吸头，10 µl（Tarsons，目录号：528100）
7. 0.22 µm 过滤装置（Corning，目录号：431118）
8. 5 L 烧瓶 (Borosil)
9. 50 ml离心管（Tarsons，目录号：500041）
10. 1.5 ml 微量离心管（Tarsons，目录号：500010）
11. 平底96孔细胞培养板（Corning，目录号：CLS3599-100EA）
12. Amicon浓缩器（默克，目录号：UFC903024）
13. RMA/s 细胞 (NCCS, Pune)
14. 6-8 周龄雄性和雌性 C57BL/6 小鼠（Jackson Laboratories，目录号：000664）
15. H-2K b和 β2m 质粒构建体（Xu等人，2016 年）（哈佛大学波士顿儿童医院 Hidde L. Ploegh 实验室赠送的礼物）
16. 肽（GL Biochem，上海）
17. 二甲基亚砜，DMSO（Serva，目录号：20385.01）
18. D-（+）-无水葡萄糖，Hi-AR TM /ACS（Himedia，目录号：GRM077-500G）
19. 氨苄西林钠盐（Himedia，目录号：MB104-5G）
20. 异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷，IPTG（BR Biochem Life Sciences，目录号：BC0168-100G）
21. 溶菌酶（Himedia，目录号：MB098-5G）
22. DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：11284932001）
23. 氯化镁，MgCl 2 （默克，目录号：105833）
24. 乙二胺四乙酸，EDTA（默克，目录号：324503）
25. 叠氮化钠（默克，目录号：8223350100）
26. Tris-盐酸盐，Tris-HCl（Himedia，目录号：GRM1218-5KG）
27. 蔗糖（Duchefa Biochemie，目录号：S0809.1000）
28. 二硫硫醇，DTT（Himedia，目录号：RM525-5G）
29. Triton X-100（Serva，目录号：37240.01）
30. 吐温 20（Himedia，目录号：MB067-100ML）
31. 氯化钠，NaCl（Himedia，目录号：MB023-500G）
32. 氢氧化钠，NaOH（Himedia，目录号：MB095-500G）
33. 磷酸氢二钠，Na 2 HPO 4 （Himedia，目录号：GRM3960-500G）
34. 磷酸二氢钾，KH 2 PO 4 （Himedia，目录号：GRM1188：500G）
35. 氯化钾，KCl（默克，目录号：1049330500）
36. 尿素（Himedia，目录号：MB032-5KG）
37. L-精氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5006）
38. 氧化谷胱甘肽（Himedia，目录号：RM550-500MG）
39. 还原型谷胱甘肽（Himedia，目录号：RM234-5G）
40. 盐酸胍（Serva，目录号：39558.02）
41. 乙酸钠，C 2 H 3 NaO 2 （Himedia，目录号：MB048-500G）
42. 氯化铵，NH 4 Cl（默克，目录号：1011450500）
43. 碳酸氢钠，NaHCO 3 （Serva，目录号：30180.02）
44. 聚甲基磺酰氟，PMSF（Serva，目录号：32395.04）
45. 4-硝基苯磷酸二钠盐六水合物（Sigma-Aldrich，目录号：71768-25G）
46. 碘化丙啶，PI（BD biosciences，目录号：556463）
47. Luria Bertani肉汤，LB肉汤，Miller（Himedia，目录号：M1245-1KG）
LB 培养基肉汤成分包括：
a. 胰蛋白胨
b. 酵母抽提物
c. 氯化钠
48. BirA 生物素-蛋白质连接酶标准反应试剂盒（Avidity）
套件组件包括：
a. d-生物素 (500 µM)
b. 生物素连接酶 BirA 酶（1 毫克/毫升）
c. 溶液 A（bicine 缓冲液：0.5 M bicine，pH 8.3）
d. 溶液 B（ATP 生物素：100 mM ATP、100 mM MgOAc、200 µM 生物素）
49. 纯化的链霉亲和素（ThermoFisher，目录号：SNN1001）
50. APC缀合的链霉亲和素（Biolegend，目录号：405207）
51. RPMI（Gibco，目录号：31800-022）
52. 胎牛血清，FBS（Gibco，目录号：26140-079）
53. 青霉素-链霉素（Gibco，目录号：10378-016）
54. 抗小鼠 FITC-H-2K b抗体（BD Pharmingen，克隆：AF6-88.5，目录号：562002）
55. 山羊中产生的抗小鼠 IgG（全分子）-碱性磷酸酶抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A9316-1ML）
56. 抗小鼠 CD8 抗体（克隆 53-6.7，BD Bioscience）
57. 弗氏佐剂，完整（Sigma-Aldrich，目录号：F5881-10ml）
58. 弗氏佐剂，不完全（Sigma-Aldrich，目录号：F5506-10ml）
59. PPRV 疫苗株 Sungri/96
60. 库存解决方案（见配方）
61. LB培养基肉汤（见食谱）
62. 磷酸盐缓冲盐水，1× PBS（见食谱）
63. PBS-T（见食谱）
64. FACS 缓冲液（见配方）
65. 重悬缓冲液（见配方）
66. 裂解缓冲液（见配方）
67. 用 Triton 洗涤缓冲液（见配方）
68. 不含 Triton 的洗涤缓冲液（见配方）
69. 尿素缓冲液（见配方）
70. 重折叠缓冲液（见配方）
71. 胍溶液（见配方）
72. 凝胶过滤缓冲液（见配方）
73. 红细胞（RBC）裂解缓冲液（见配方）

设备

1. 血清学和微量移液器 (Eppendorf Research Plus)
2. 分光光度计（GeneQant，型号：80-2130-00）
3. 高压釜（ALP，型号：CL-40MDP）
4. 带摇床的培养箱（TBOY 5000I INCUB SHKER，目录号：980473）
5. Sonicator（Sonics & Materials INC.，型号：VCX750）
6. 离心机（Eppendorf，型号：AG 5810 R 和 5401）
7. 带冷室（HiPrep 16/60，Sephacryl S200 HR）的凝胶过滤装置（AKTA）
8. UV 室（Genetix，型号：GX-2082-6111）
9. BD Accuri C6 流式细胞仪（BD Biosciences）
10. SDS 凝胶装置（Bio Rad Mini-PROTEAN Tetra System）
11. Eon ELISA 酶标仪（BioTek Instruments, Inc.）
12. LSE Vortex Mixer（Corning，目录号：6776）
13. 实验室搅拌器/热板（Corning，目录号：6798-420D）
14. 磁棒（Tarsons，目录号：4117）

软件

1. UCSF嵌合体版本1.13（https://www.cgl.ucsf.edu/chimera）（佩特森等人，2004;陈等人，2015年）
2. HPEPDOCK在线对接工具（http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hpepdock/）（周等人。，2018）
3. NCBI，PDB，Uniprot登录蛋白质数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ; https://www.rcsb.org/ ; https://www.uniprot.org/）
4. 免疫表位数据库和分析资源 (IDEB) 和 IDEB-AR (Zhang, 2013)
5. FlowJo vX (Becton Dickinson and company)
6. GraphPad Prism v8.4.3（加利福尼亚州圣地亚哥）
7. 微软办公 2016

程序

A. 使用生物信息学工具预测 PPRV 的免疫原性表位（图 1）
1. 从国家生物技术信息中心（NCBI）、蛋白质数据库（PDB）、UniProt、蛋白质结构分类（SCOP）和CATH：蛋白质结构分类数据库等各种数据库中获取不同PPRV蛋白质的氨基酸序列。这可以通过在相应数据库中按名称搜索蛋白质并以 Fasta 格式下载所需序列来完成。例如，通过选择NCBI的蛋白质数据库获得PPRV的H蛋白序列，输入查询为'PPRV H protein'。然后选择具有 609 个氨基酸的命中，H 蛋白的假定完整氨基酸序列，并以 Fasta 格式复制序列。
2. 使用开放访问免疫表位数据库 (IEDB) 或 IDEB 在线数据库插入病毒蛋白序列作为查询 (Vita等人, 2015 和 2019)。
3. 自定义小鼠 I 类 MHC 分子 (H-2K b )的肽长度，并预测免疫原性表位。
4. 根据与H-2K b的结合亲和力对预测的表位进行Bin ，并选择百分位等级<2且IC 50值低于50 nM的表位，这些表位被认为是高亲和力结合剂。
5. 使用 IEDB-AR（IEDB 的一个伴随站点，为分析预测的 T 细胞表位提供多种选择）验证高亲和力结合剂，并根据天然存在的免疫原性肽的一般特征（如 9mer、FAPGNYPAL）进一步审查它们SEV 与 H-2K b复合。
6. 选择排名最高的 9mers（因为它们是最自然发生的高亲和力 I 类 MHC 限制性可访问表位）并仔细检查它们是否存在疏水性羧基末端残基。
7. 根据亲和力分数对所选肽段进行排序，获得具有游离 N 和 C 末端、纯度高 (95-98%) 的商业合成肽。进一步使用它们进行实验分析。

B. 肽与 I 类 MHC 分子的分子对接以确定结合亲和力（图 3）
1. 使用 H-2K b （在 PDB 文件中）对高亲和力表位进行分子对接，使用它们的单个序列作为 HPEPDOCK 在线服务器工具（例如，用于使用 H-2K b对 PPRV 表位建模的文件 1S7Q 进行同源建模的输入）蛋白质）（Zhou et al ., 2018）。
2. 服务器预测并生成对接结构的集合。分析 H-2K b和肽的对接结构的能量参数。根据与 H2-K b具有相似长度的已知表位（例如，SEV 核蛋白衍生肽，9mers 的 FAPGNYPAL 和鸡卵清蛋白肽，8mers 的 SIINFEKL）设置截止值以选择肽。选择能量参数低于或等于标准表位的对接结构。
3. 根据以下参数进一步审查选定的对接结构：
a. SEV-9肽的N端深深嵌入H2-K b ，而C端由H-2K b表面附近的盐桥固定。
b. SEV-9 肽的残基 4 或 5 凸出凹槽，不通过范德华力与 H-2K b相互作用。
c. 肽末端与 H-2K b 的极性相互作用稳定 SEV-9 肽。
d. 残基 5 或 6 作为最有可能的一级锚定残基，而位置 8 或 9 的氨基酸可能充当 SEV-9 肽中的二级锚定。
e. 所有参数都以表格形式记录，以选择最稳定的对接结构。
4. 对所有停靠的结构重复步骤 B3。
5. 从每个高亲和力表位中选择最稳定的对接结构，并比较它们的对接分数，即对接能量和步骤 B3c 中描述的其他参数。绘制直线曲线或条形图，根据免疫原性和稳定 H-2K b对表位进行排序。
6. 使用 UCSF 嵌合体工具和绑定分析工具可视化选定的停靠结构。评估 I 类 MHC 的稳定性并找到 I 类 MHC 分子与预测表位之间的联系。
7. 根据步骤 B3 中描述的参数识别锚点。
8. 使用嵌合体控制台中可用的预设选项对对接结构进行成像。对所有结构和功能区视图使用相同的配色方案以获得更好的可视化效果。

C. H-2K b异源三聚体四聚体的生成（图 4 和 5）
为了产生可溶性 H-2K b / 肽复合物，在大肠杆菌中过表达 H-2K b重链和 β2m 作为重组蛋白，并在高浓度条件配体 FAPG(Anp)YPAL 存在下重新折叠单体。重链序列发生突变以去除胞质和跨膜区域，并在 H-2K b重链的 C 端用生物素受体肽序列表达，用于位点特异性标记（Garboczi等，1992；Sehrawat等人，2012 年；Pichugin等人，2018 年）。这些短序列可以使用 BirA 以特定于位点的方式在赖氨酸 (K) 残基处轻松生物素化。然后，抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白的四个生物素结合位点产生 H-2K b / 肽复合物的四聚体。要将这些复合物用于流式细胞术，可以使用不同的荧光染料偶联的市售亲和素/链霉亲和素。简而言之，使用以下过程。
1. 从包涵体中表达和纯化重组蛋白（H-2K b和 β2m）。
H-2K b和 β2m 的重组蛋白从从大肠杆菌诱导培养物中收集的包涵体中纯化出来。
a. 在 2 L 烧瓶中准备 6 升 (L) LB 培养基，每个烧瓶有 1 L 培养基。对这些烧瓶进行高压灭菌，在室温 (RT) 冷却后，向每个烧瓶中加入 10 毫升无菌 40% 葡萄糖溶液和 10 克氨苄青霉素。
b. 取 20 µl 细菌原液，用 6 ml LB 培养基稀释；然后，在每个烧瓶中加入 1 ml 细菌发酵剂。
c. 将其置于 37°C 的摇床培养箱中约 8-10 小时，直到 OD 600达到 0.8。建议在测量 OD 600后进行间歇采样，以捕获对数期生长的细菌。
d. 从每个烧瓶中收集 1 ml 样品用于表达控制。
e. 当 OD 600达到 0.8 时，将 1 ml 新鲜制备的IPTG溶液（PBS 中 100 mg/ml，1 mM）添加到各个烧瓶中。
f. 在摇床培养箱中 37°C 孵育 3 小时。
g. 在冰上冷却培养物 15-20 分钟。
h. 通过在 4°C 下以 11,000 × g离心10 分钟将1 L 培养物沉淀，从而收获细菌培养物。
i. 将沉淀重悬在 13 ml 重悬缓冲液中，然后转移到50 ml 离心管中。
j. 使用冰上的声波器（20% 振幅 15 秒关闭/15 秒开启脉冲，共 30 个周期）将悬浮缓冲液中的细菌悬浮液均质化。
k. 添加 100 µl 溶菌酶（原液 50 mg/ml）、250 µl DNase I（原液 2 mg/ml）和 50 µl MgCl 2 （原液 0.5 M）。
l. 彻底涡旋并加入 12.5 ml 裂解缓冲液，然后短暂涡旋。
m. 在室温下孵育直至粘度降低，然后加入 350 µl Na·来自 0.5 M 库存的 EDTA。
n. 将管子放入液氮中冷冻和解冻混合物，然后将其转移到 37°C 的水浴中 30 分钟。添加 200 µl MgCl 2并等待粘度降低。然后加入 350 µl Na EDTA 并从现在开始将其置于冰上。
o. 将溶液在4°C 下以 11,000 × g沉淀20 分钟，然后弃去上清液。
p. 用 Triton X100将沉淀重悬在 10 ml洗涤缓冲液中，并在超声仪中再次匀浆。
q. 将溶液在4°C 下以 11,000 × g沉淀20 分钟，然后弃去上清液。
r. 在不含 Triton X100 的 10 ml 洗涤缓冲液中重悬沉淀，并使用超声波仪进行匀浆。
s. 将混合物在4°C下以 11,000 × g沉淀20 分钟，然后弃去上清液。
t. 收集沉淀并将其溶解在 5 ml 8 M 尿素中；确定蛋白质浓度。
u. 在单独的小瓶中分装 1 ml，并储存在 -80°C 以备将来使用。
2. 用光可裂解肽重新折叠 H-2K b单体。
a. 在 3 个小瓶中制备 H2-K b ，每瓶 6.2 毫克（最终浓度 3 µM）和 β2m 4.4 毫克（最终浓度 6 µM）。所有制剂均用胍溶液稀释至 500 µl。
b. 在冰上的 500 毫升玻璃烧瓶中冷却 200 毫升重折叠缓冲液，并加入 2 毫升 PMSF（原液 100 mM）。
c. 在重折叠缓冲液中溶解 12 毫克可光裂解的 H-2K b限制性肽（在 DMSO 中储存 10 毫克/毫升）。
d. 将 1 瓶 β2m 逐滴注入复性溶液，同时在旋转搅拌器上的磁棒的帮助下连续剧烈搅拌，以进行快速有效的稀释。
e. 将 1 瓶纯化的 H-2K b重链直接逐滴注入重折叠溶液。
f. 将烧瓶在 4°C 下放置 8 小时，在冷室中缓慢搅拌溶液。
g. 重复步骤 C2d 到 C2g 三次。
h. 在第三次注射 β2m 和 H-2K b 后，让烧瓶缓慢搅拌 24 小时。
i. 溶液完全重折叠后，使用浓缩器将蛋白质浓缩至 1 ml。
j. 将 AKTA 中的浓缩蛋白质加载到 S200 柱上进行凝胶过滤。
k. 收集 12% 还原 SDS-PAGE 显示的重折叠峰的不同部分。将显示 ~35 kDa 和 13 kDa 的两个不同条带的级分合并并浓缩至 1 ml（图 5）。
3. H-2K b /肽复合物的体外生物素化。
在体外作为生物素化试剂盒（亲合力）提到生物素化被严格完成。
a. 将 100 µl 溶液 A 和 100 µl 溶液 B 添加到 700 µl 纯化的 H-2K b复合物。
b. 向溶液中加入 100 µl d-生物素和 10 µl BirA 酶，并在室温下孵育混合物过夜。
c. 通过使用 AKTA 在 S200 凝胶过滤柱上运行样品来纯化生物素化的 H-2K b /肽复合物。
d. 收集所有生物素化的部分并将合并的体积浓缩到 1 ml 或更少。
e. 检查生物素化 H-2K b / 肽复合物的浓度，并以较小的体积进行储存。
f. 对于长期储存，添加甘油至终浓度为 16%，在 1.5 ml 微量离心管中分装 50 µl，并将它们储存在 -80℃ 用于实验用途和四聚。

D. 使用无细胞分析的肽-MHC 结合分析（图 6）
1. 取一个 ELISA 板，用 50 µl 链霉亲和素在 PBS 中以 2 µg/ml 的浓度包被，并在 4°C 下孵育过夜。
2. 第二天，用 200 µl PBST 清洗板以去除未结合的链霉亲和素。
3. 用 200 µl 3% BSA 的 PBS 封闭这些孔，并在室温下孵育 2 小时。
4. 取出封闭缓冲液并用 200 µl PBST 洗涤（3 次）。
5. 将 50 µl含有光裂解肽的生物素化 H-2K b单体 (1 µg/ml) 添加到链霉亲和素包被的孔中，并在室温下孵育 1 小时。
6. 去除未结合的单体并用 200 µl PBST（3 次）洗涤。
7. 将确定的肽添加到不同的孔中，以及阳性对照肽（在这种情况下，我们使用了 SIINFEKL）。适当地标记井。
8. 将此板暴露在具有高波长 UV 365辐射的腔室中 30 分钟，以实现 UV 可裂解配体与相应肽的置换。
9. 用 200 µl PBST 再次清洗这些孔（3 次）。
10. 向所有孔中加入 50 µl 小鼠抗β2 微球蛋白抗体，室温放置 1 小时。
11. 用 200 µl PBST 再次清洗这些孔（3 次）。
12. 加入 50 µl 与碱性磷酸酶偶联的抗小鼠 IgG 抗体，并在室温下孵育 30 分钟。
13. 用 200 µl PBST 再次清洗这些孔（3 次）。
14. 向孔中加入 200 µl 对硝基苯酚磷酸酯 (1 mg/ml)，等待由于显色产物的形成而显色。
15. 一旦颜色出现并且肉眼可见，用 50 µl 1M NaOH 停止反应，并在读板器中测量 405 nm 处的吸光度。
16. 读取读数并确定与 H-2K b结合的最佳肽。

E. 使用 RMA/S 细胞系稳定 MHC I 的细胞表面（图 7）
RMA/S 细胞在抗原加工方面存在缺陷，因为 TAP 分子中的突变使肽能够转运到 ER 以加载到新合成的 I 类 MHC 分子上。RMA/S 细胞显示较低水平的空 I 类 MHC 分子，可以有效地装载外源肽（Schumacher等人，1990 年；Esquivel等人，1992 年）。通过胞饮作用或吞噬作用进入的肽也可以通过液泡途径有效地加载到空的 I 类 MHC 分子上。因此，在不存在或存在外源肽的情况下，RMA/s 细胞对 I 类 MHC 分子的差异展示可用于测量肽诱导的此类分子的稳定性。为了研究 RMA/S 细胞上的 MHC 稳定性，使用以下程序。
1. 复活 RMA/s 细胞并将它们培养在 RPMI 培养基中，并在 37°C 下在含有 5% CO 2的加湿培养箱中添加 10% FBS 。三代传代后使用 RMA/S 细胞研究 I 类 MHC 分子的稳定性。
2. 取 2 × 10 5细胞在 200 µl 无血清 RPMI 培养基中，并将这些细胞在 37°C 下在 5% CO 2的加湿培养箱中饥饿 3 小时。
3. 在无血清 RPMI 中对肽进行不同的稀释（例如 6.25、12.5、25、50 和 100 µg/ml）。
4. 3 小时后，用 200 µl 预热的无血清 RPMI 清洗这些细胞，并将 200 µl 制备的肽稀释液添加到相应的孔中。
5. 将这些细胞在 37°C 的加湿培养箱中再培养 7-8 小时，并辅以 5% CO 2 。
6. 在室温下以 300 x g离心细胞并丢弃上清液。
7. 添加 200 µl FACS 缓冲液并重悬这些细胞。
8. 在室温下以 300 x g离心细胞并丢弃上清液。
9. 添加 50 µl FACS 缓冲液并重悬这些细胞。
10. 以1:200 的比例稀释 H-2K b抗体，每孔加入 50 µl，并在室温下避光孵育 20 分钟。保留三个用于染色控制的孔（仅H-2K b、仅 PI 和未染色）。
11. 加入 200 µl FACS 缓冲液，并在室温下以 300 × g离心5 分钟。重复此步骤 3 次，并在 100 µl FACS 缓冲液中重悬细胞。
12. 在 FACS 缓冲液中以 2 µg/ml 的浓度制备 PI，并向所有孔中加入 100 µl，除了不需要 PI 的染色对照。
13. 立即在流式细胞仪中获取细胞，并使用 FlowJo 软件分析结果。

F. 条件配体的紫外置换产生荧光 H-2K b四聚体
1. 取 50 µl 浓缩的生物素化 H-2K b单体 (>250 µg/ml)，在冰上的 96 孔板上用光裂解肽重新折叠，并用凝胶过滤缓冲液稀释至 100 µl。
2. 将 5 µl 特定肽添加到每个含有紫外线可裂解配体单体的孔中。
3. 在冰上的紫外线室中将这些板暴露于紫外线辐射 (365 nm) 中 30 分钟。板与紫外线灯的距离应为 2-5 厘米。
4. 将板在4°C 下以 3,000 × g离心5 分钟，并在微量离心管中从板上收集 80 µl 交换的样品。
5. 在 19 µl 肽交换单体中加入 1 µl 链霉亲和素-APC 偶联物，用于单体的四聚化；在冰上孵育 2 小时。
6. 通过与抗 CD8 抗体共染色，收集四聚体并使用它们来识别肽特异性 CD8 + T 细胞。

G. 在 PPRV (Sunguri) 感染的小鼠中检测肽特异性 CD8 + T 细胞（图 8）
1. 将 C57BL/6 WT 小鼠分为两组，每笼至少三只动物。
2. 用高剂量的 PPRV (5 × 10 6 pfu)腹膜内感染一个笼子的小鼠。另一个笼子里的动物将作为对照。
3. 7 天后，用相似剂量的 PPRV 病毒感染相同的小鼠，以进一步扩大 PPRV 特定细胞的频率。
4. 从两组的每只小鼠身上收集血液并对它们进行染色以识别血液中的肽特异性 CD8 + T 细胞。
5. 制备 PerCP Cy5.5 共轭抗小鼠 CD8 抗体（1:200 稀释）和肽特异性 H-2K b链霉亲和素-APC 四聚体（1:100 稀释）的混合物。
6. 将 5 µl 鸡尾酒转移到新标记的微量离心管中。保留一些管用于染色控制（例如，CD8 控制、H-2K b-四聚体控制和未染色样品）。
7. 将每只小鼠的 25 µl 血液加入各自的管中，轻轻涡旋混合。
8. 在黑暗中在冰上孵育管 30 分钟。
9. 向所有管中加入 220 µl RBC 裂解缓冲液，轻轻涡旋，等待 RBC 裂解。
10. 5 分钟后，加入 PBS 并轻轻混合。
11. 使用流式细胞仪立即获取染色细胞，并分析肽特异性 CD8 + T 细胞。
H. 在 PPRV 肽免疫小鼠中检测肽特异性 CD8 + T 细胞
1. 将 600 µl 完全弗氏佐剂放入 1.5 ml 微量离心管中，加入 6 µl 肽（原液浓度 10 mg/ml）。
2. 大量涡旋管并在 1 ml 结核菌素注射器中收集肽乳液。通过将一小滴乳液倒入冷水中来检查乳液的质量。如果乳液良好，如完整的液滴所示，则继续注射鼠标。如果不好，将乳液保持另一轮剧烈涡旋。
3. 在每只 C57BL/6 WT 小鼠皮下注射 50 µl 乳液，并等待至少 15 天。保持另外三只老鼠没有任何注射作为控制。
4. 在不完全弗氏佐剂中制备与步骤 1 相同体积的新鲜肽乳液, 并皮下注射先前免疫的小鼠。
5. 在第二次注射后至少 3 天收集这些小鼠的血样。收集的血液用于检测肽特异性 CD8 + T 细胞。
6. 制备 PerCP Cy5.5 共轭抗小鼠 CD8 抗体（1:200 稀释）和肽特异性 H-2K b链霉亲和素-APC 四聚体（1:100 稀释）的混合物。
7. 将 5 µl 抗体混合物放入新鲜标记的微量离心管中，并保留一些管用于染色控制（例如，抗 CD8 控制、H-2K b-四聚体控制和未染色样品）。
8. 将每只小鼠的 25 µl 血液加入各自的管中，轻轻涡旋混合。
9. 在黑暗中在冰上孵育管 30 分钟。
10. 向所有管中加入 220 µl RBC 裂解缓冲液，轻轻涡旋，等待 RBC 裂解。
11. 5 分钟后，加入 PBS 并轻轻混合。
12. 使用流式细胞仪立即获取染色细胞，并分析肽特异性 CD8 + T 细胞。

数据分析

A. 病毒肽的生物信息学预测
从 NCBI 数据库收集 FASTA 格式的氨基酸序列后，使用 IEDB 分析资源鉴定免疫原性肽。从这个在线服务器工具预测了大约 80 种肽。进一步检查这些肽的高亲和力结合剂。高亲和力结合剂的 IC 50值超过 500 nM。为了预测这些高百分位等级肽的结合亲和力，进行了分子对接分析。当与 H-2K b蛋白对接时，这些肽暴露在 HPEPDOCK 在线服务器上以获得肽构象。FAPGNYPAL 被用作正参考以检查对接算法的有效性。我们确定了 12 个免疫原性表位，满足所有参数的高对接评分（图 3A-3B）。这些预测的 PPRV 不同蛋白质的免疫原性肽可能具有诱导小鼠 CD8 T 细胞反应的潜力。最好的肽是根据其对接分数选择的，以在 MHC I 上保持稳定性。简要讨论了使用 HPEPDOCK 在线服务器工具进行生物信息学分析的预测肽的示例（图 3C-3D）。

图 3. 预测的 I 类 MHC 肽与 H-2K b 的分子对接分析。
免疫原性预测肽的对接分数列在表格 (A) 中，并使用条形图 (B) 由对接分数的负值表示。显示了具有 H-2K b蛋白的预测肽的对接图像(C)。表中列出了与 H-2K b相互作用的肽中各个残基的不同参数和分数(D)。Sharma等人报道了所有结构。(2021)。

B. H-2K b /肽四聚体的产生
为了产生单体 H-2K b复合物，纯化的 H-2K b和 β2m 蛋白在高浓度 H-2K b限制性肽的存在下重新折叠。我们使用光裂解肽 (FAPG[Anp]YPAL) 来生成单体复合物，并将它们生物素化以制造多聚体。图 4 显示了单体重折叠及其四聚化的一般方案。通过暴露于 365 nm 紫外线波长，可以轻松地将这种光裂解肽与任何设计的 H-2K b限制性肽交换。显示了重折叠单体的凝胶过滤色谱图（图 5）。显示对应于 ~35 kDa 和 13 kDa 的两个不同多肽带的泳道对应于重折叠单体的单位。

图 4. 示意图显示了重新折叠的异源三聚体 H-2K b单体的产生，该单体由肽、β2m 和 I 类 MHC (H-2K b ) 的重链组成。
A. 改进型 H-2K b 的示意图。B. 描述了生成 I 类 MHC 四聚体的不同步骤。然后使用试剂盒将单体生物素化。使用荧光亲和素/链霉亲和素将生物素化单体四聚化。

图 5.使用条件配体重新折叠 H-2K b单体。
A. 显示重折叠 H-2K b单体洗脱曲线的色谱图。使用 12% SDA-PAGE (B) 解析标记为 A、B 和 C 的级分。组分 B 中H-2K b重链 (≈35 kDa) 和 β2m (≈13 kDa) 的存在表明重折叠单体。

C. 通过脱细胞方法进行肽/MHC I结合测定
使用光裂解肽产生的纯化单体用于选择在紫外线诱导条件配体置换后稳定板结合的 I 类 MHC 单体中表现最佳的 PPRV 肽。肽交换后稳定的单体会保留复合物中的 β2m 单元，这可以使用间接 ELISA 的抗 β2m 抗体轻松检测；传入肽缺乏结合会分解复合物，导致 β2m 检测丢失（图 6A）。将所有肽的 ELISA 读数与结合 H-2K b的已知肽 (SIINFEKL) 的读数进行比较，并绘制为相对于 SIINFEKL 肽的相对倍数变化（图 6）。

图 6. 确定肽诱导 MHC 稳定性的无细胞分析。
A. 描述在暴露于 UV 365后，肽与 H-2K b单体与条件配体的结合的示意图。B.酒吧图描述PPRV的不同肽的与H-2K的结合亲和力的倍数变化值b以下相比，阳性对照肽（SIINFEKL）UV交换。该数据来自 Sharma等人。(2021)。仅显示了高评分肽。

D. 通过细胞方法稳定 I 类 MHC
为了研究不同 PPRV 肽对 I 类 MHC 的稳定性，我们使用了 TAP 缺陷型 RMA/S 细胞系。RMA/S 细胞在其细胞表面表达非常低水平的 I 类 MHC I 分子。由于小肽可以被这些细胞内化，并在尚未充分描述的亚细胞区室中加载到 I 类 MHC 分子上，这些亚细胞区室也包含在细胞内进行运输的 I 类 MHC，以形成稳定的 I 类 MHC 复合物。然后肽复合的 I 类 MHC 分子在细胞表面表达，它们的表达水平与肽结合的效率直接相关。外源添加的肽与 I 类 MHC 的结合也可能发生在细胞表面。PPRV 肽外源添加到 RMA/S 细胞中，使用与荧光染料偶联的抗小鼠 H-2K b抗体测量 MHC I 分子的表达，并使用流式细胞仪进行检测（图 7）。

图 7. 流式细胞分析以量化 H-2K b阳性 RMA/s 细胞。
A.使用 SSC 和 FSC 绘图门控的总细胞的表示。分析门控细胞的碘化丙啶 (PI) 染色，测量 PI 阴性活细胞以对 H-2K b阳性染色进行评分。B. 代表性的流动直方图显示了高、中和低亲和力结合 PPRV 肽的 H-2K b阳性细胞的百分比。SIINFEKL 肽用作 MHC 稳定化的阳性对照。未添加肽的细胞或具有已知肽 (SIINFEKL) 的细胞分别用作阴性和阳性对照。该数据是从 Sharma等人复制的。(2021)。

E. 使用生成的 H-2K b四聚体检测肽特异性 CD8 + T 细胞
H-2K b /肽单体的四聚化过程包括用生物素对 H-2K b进行生物素化，并在一段时间内添加链霉亲和素或亲和素。链霉亲和素中的四个生物素结合位点产生 H-2K b / 肽四聚体。为了使用四聚体检测肽特异性 CD8 + T 细胞，单体与荧光染料共轭链霉亲和素分子四聚。来自 PPRV 感染小鼠和 PPRV 肽免疫小鼠的血样用抗小鼠 CD8 抗体和 H-2K b四聚体-APC 染色。肽特异性 CD8 + T 细胞的分析如图 8 所示，其中双阳性细胞被设门以显示 PPRV 特异性细胞的频率。

图 8. 肽特异性 CD8 + T 细胞的流式细胞术分析。
A. 首先使用 SSC 和 FSC 图分析 PBMC，并对淋巴细胞进行门控。然后使用双指数 FACS 图分析门控群体的 Y 轴上的四聚体-APC 和 X 轴上的 CD8-PerCP Cy5.5。双阳性细胞（CD8 +四聚体+ ）被门控以列举 PPRV 肽特异性 CD8 + T 细胞。B. 代表性 FACS 图显示了使用不同 -PPRV 肽 [AILTFLFLL (AIL)、FMYLFLLGV (FMV)、FSAGAYPLL (FSL) IGLVRDFGL (IGL)、UV 交换过程产生的四聚体染色后PPRV 特异性 CD8 + T 细胞的频率，分别]。未交换的四聚体作为 PPRV 特异性细胞的阴性对照。该数据是从 Sharma等人复制的。(2021)。

笔记

1. 对接分数基于对接肽与 I 类 MHC 分子的相互作用次数。在所需站点进行更多交互会导致对接分数较高（在图 2 中以负值表示）。因此，对接分数越高，对接越好。进一步的审查是根据程序 B 部分中给出的附加参数手动完成的。
2. 常规实验使用非过滤吸头，但细胞培养实验使用过滤吸头。
3. 在 IPTG 诱导细菌中重组蛋白的过程中，适当检查 OD 600 。如果 OD 600超过 0.8，则不要进行诱导。
4. 在从包涵体中纯化重组蛋白之前，通过 SDS-PAGE 解析未诱导和诱导的样品，检查重组蛋白的诱导质量。
5. 在制作用于免疫的肽乳液时，通过在冰冷的水表面加入一小滴来确保正确合成。良好的乳液制剂可在较长时间内提供完整的液滴。
6. 所描述的协议可用于识别源自病原体、癌症或导致自身免疫疾病的抗原的任何抗原的免疫原性表位。

食谱

1. 库存解决方案
a. 溶菌酶
dH 2 O 中50 mg/ml并储存在 -20°C
b. DNA酶I
2 mg/ml 50% 甘油和 75 mM NaCl
c. 氯化镁2
0.5 M 在 dH 2 O 中并储存在 RT
d. Na·EDTA
0.5 M 溶于 50 mM Tris-HCl，pH 8.0 并在室温下储存
e. 叠氮化钠
30% 在 PBS 中并储存在 RT
f. 100 毫米 PMSF
174.2 mg 溶于 10 ml 2-丙醇并在室温下储存
g. 1M氢氧化钠
小心地将 1 克 NaOH 溶解在 25 毫升蒸馏水 (dH 2 O) 中。
2. LB 培养基肉汤 (1 L)
胰蛋白胨10 克
酵母提取物 5 克
氯化钠 10 克
用 dH 2 O将体积补到 1 L。
3. 磷酸盐缓冲盐水，1 × PBS（用于 1 L，pH 7.2-7.4）
137 毫米氯化钠8 克
2.7 毫米氯化钾 0.2 克
10 mM Na 2 HPO 4 1.44 克
1.8 mM KH 2 PO 4 0.24 克
加入 800 ml dH 2 O 并调节 pH 值 7.2-7.4，最后用 dH 2 O补足至 1 L
4. PBS-T
0.05% Tween-20 in PBS（500 µl Tween in 1 L 1x PBS）
5. 流式细胞仪缓冲液
PBS 中的 2% FBS（100 ml 1× PBS 中的 2 ml FBS）
6. 重悬缓冲液（500 ml，pH 8.0）
50 mM Tris-HCl 3.94 克
25% 蔗糖125 克
1 mM Na·EDTA 186 毫克
0.01% 叠氮化钠1.6 毫升（来自 30% 的库存）
10 毫米 DTT 770 毫克
1 mM PMSF 2 ml（来自 100 mM 库存）
用 dH 2 O补足至 500 ml
7. 裂解缓冲液（500 毫升，pH 8.0）
50 mM Tris-HCl 3.94 克
1% 海卫 X-100 5 毫升
100 毫米氯化钠2.92 克
0.1% 叠氮化钠1.6 毫升（来自 30% 的库存）
10 毫米 DTT 770 毫克
用 dH 2 O补足至 500 ml
8. 用 Triton 洗涤缓冲液（500 毫升，pH 8.0）
50 mM Tris-HCl 3.94 克
0.5% 海卫 X-100 2.5 毫升
100 毫米氯化钠2.93 克
1mM Na·EDTA 186 毫克
0.1% 叠氮化钠1.6 毫升（来自 30% 的库存）
1 毫米 DTT 77 毫克
用 dH 2 O补足至 500 ml
9. 不含 Triton 的洗涤缓冲液（500 ml，pH 8.0）
50 mM Tris-HCl 3.94 克
100 毫米氯化钠2.93 克
1mM Na·EDTA 186 毫克
0.1% 叠氮化钠1.6 毫升（来自 30% 的库存）
1 毫米 DTT 77 毫克
用 dH 2 O补足至 500 ml
10. 尿素缓冲液（500毫升）
8 M 尿素240.24 克
10 mM Na·EDTA 1.86 克
0.1 毫米 DTT 7.7 克
用 dH 2 O补足至 500 ml
11. 重折叠缓冲液（250 ml，pH 8.0）
100 mM Tris-HCl 3.925 克
400 mM L-精氨酸-HCl 21 克
2 mM Na·EDTA 1 ml（来自 0.5 M 库存）
0.5 mM 氧化物。谷胱甘肽76.5 毫克
5 mM 红色。谷胱甘肽3.75 克
用 dH 2 O补足至 250 ml
12. 胍溶液（100 ml，pH 4.2）
3 M 盐酸胍28.7 克
10 mM 醋酸钠82 毫克
10 mM Na·EDTA 2 ml（来自 0.5 M 库存）
补足至 100 毫升
13. 凝胶过滤缓冲液（500 ml，pH 8.0）
20 mM Tris-HCl 1.57 克
50 毫米氯化钠1.46 克
用 dH 2 O 定容至 500 ml，过滤和脱气
14. 红细胞 (RBC) 裂解缓冲液（500 毫升）
155 mM NH 4 Cl 4.14 克
12 毫米碳酸氢钠3 528 毫克
0.1 mM EDTA 100 μl（来自 0.5 M 库存）
用 dH 2 O补足至 500 ml

致谢

该协议主要用于 Sharma等人的研究文章。(2021)。作者要感谢 Sharma等人的所有作者。(2021)和印度科学教育研究所 Mohali 和 ICAR (NASF/ABA-6021/2017-2018 为 SS 提供资金。作者要感谢 Hidde L Ploegh 教授提供 H-2K b和β 2m质粒构建体。我们还要感谢 SS 实验室的 Surbhi Dahiya 和 Dhaneshwar Kumar 在文章准备过程中提供的帮助。

利益争夺

作者没有任何竞争利益。

伦理

所有实验中使用的动物实验均严格按照由印度科学教育与研究莫哈利研究所动物伦理委员会 (IAEC) 批准的方案 (IISERM/SAFE/PRT/2018/014) 进行。动物实验控制和监督委员会 (CPCSEA) 的支持。

参考

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