材料和试剂
1. Eppendorf 管 (SARSTEDT)
2. 移液器吸头 10 µl (Sartorius)
3. 移液器吸头 200 µl (Sartorius)
4. 移液器吸头 1,000 µl (Sartorius)
5. 移液器套件（SARSTEDT，Nümbrecht）
6. Falcon 管 50 ml（DARSTEDT AG and CO.KG，目录号：9042211）
7. 光度计比色皿（Ratiolabs，目录号：2712120）
8. 玻璃烧杯（肖特杜兰）
9. 一次性乙烯基手套（Semper 防护）
10. 镜头清洁擦拭纸（Thorlabs, Inc.）
11. 乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：STBJ2652）
12. HCl（VWR 化学品 25% 溶液，目录号：20257-296）
13. 丙酮˃99.5%（Sigma-Aldrich，目录号：STBJ1946）
14. KOH（Roth，目录号：6751.1）
15. HEPES（Roth，目录号：9105.2）
16. 氯化镁（MgCl 2 ）（VWR Chemicals，目录号：25108.295）
17. 氯化钙（CaCl 2 ）（Roth，目录号：5239.1）
18. 氯化钾（KCl）（Aplicem，目录号：7447.40.7）
19. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：STB117768）
20. Bradford 试剂（Bio-Rad，目录号：500-00069）
21. BSI 缓冲液（见配方）

设备

1. Caramba Druckluftspray，用于通过气压清洁电子设备（Böttcher AG，德国）
2. 头灯（劲量）
3. 样品标记笔（STAEDTLER 永久性记号笔）
4. 冻干剂（Alpha 1-2 LD plus，Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH，目录号：101521）
5. Vortex（Vortex Genie 2）（Sigma-Aldrich，目录号：Z258423-1EA）
6. Sonicator (Bandelin Sonorex)
7. -20°C 冷冻机（利勃海尔）
8. 光度计（Food ALYT OMNILAB ，目录号：122197）
9. 工具箱（纽波特）
10. 微流控芯片（Micronit-Vanderbilt）
11. 反向散射仪器，根据 Bornhop等人构建。（2007 年和 2016 年）和 Kammer等人。(2018)。

软件
1. 标准 FFT 程序 9.0 Alphas LV82 simple with save frames
2. BSI SCSR 分析程序-2012（美国范德比尔特大学博恩霍普实验室）

程序
A. 设备设置和组件的示意图
BSI 系统由微流控芯片、HeNe 激光器、反射镜和 CCD 相机组成。这些组件的位置和连接如图 2 所示。每个组件的位置及其与其他组件的距离对于 BSI 设置至关重要，允许记录源自蛋白质-蛋白质或蛋白质-配体相互作用的信号。固定位置用红色框表示。重要的是将这些位置的组件保持在适当的距离，而蓝色框的位置是可选的，可以灵活调整。

图 2. BSI 仪器设置的示意图结构。
红色和蓝色框分别代表固定和灵活位置的每个设备组件的位置。编号对应于下面列出的设备组件。

图 2 和图 3 所示的组件：
1.工作台为24×36英寸。
2.激光
3.激光离开电缆的点
4.芯片座
5.镜子和支架
6.抽吸装置
7. CCD相机
8.激光电源
9.温度控制器
10 、抽吸装置真空泵
11a. 开关A开启激光
11b. 控制芯片内通道开闭的开关B

图 3. BSI 仪器的实际设置照片，在其确切位置显示各种组件。
黄色数字表示设置位置，如图 2 所示。图 3 显示了 BSI 仪器的实际设置，显示了每个组件的准确位置和距离。

B. 设备准备
1. 为了开始样品测量，设备组装和准备很重要，应该非常准确地完成，以避免任何不是源自生物分子相互作用的错误信号。
2. 在开始实验前至少三个小时打开激光。在这三个小时内，要么准备设备，要么准备样品。建议在进行实际实验前一天准备设备。如果可能，还应在前一天准备样品。
3. 芯片座对温度敏感，可以选择实验温度。打开温度设备，通常设置为 25°C。温度达到 25°C 需要几分钟时间（如图 4 所示）。

图 4. 温度控制器。
温度控制器用于设置微流控芯片的温度。实验可以在任何所需的温度下进行。

4. 芯片清洗：BSI 芯片是一种特殊的微流体装置，包含五个流道（图 5）。芯片清洁至关重要，因为激光束直接照射芯片表面并反射回镜子。高浓度的碱性或酸性溶液（1 M KOH 或 1 M HCl）可用于清洁芯片。建议一次只使用几微升这些溶液，然后使用 70% 乙醇并用过量的水清洗。切勿裸手接触芯片，始终使用手套握住芯片，并使用镜头清洁纸巾擦拭和擦拭芯片。
图 5. BSI 芯片。
清洁后显示芯片。它有五个流通池，每个流通池都可用于测量。

5. 芯片干燥：有两种方法可以干燥清洁后的芯片：手动，用一张纸向芯片表面吹一些空气（不要从嘴里吹气。抽吸装置可以吸出流道内多余的水），或使用商用干燥机（例如，来自 Caramba 的 Druckluftspray）。
6. 芯片干燥后，将芯片放入芯片架内。极其小心地将芯片固定在芯片座内。芯片固定有两个阶段（图 6A）。在初始阶段，将芯片放入支架内并拧紧金属螺钉。其次，使用塑料制成的特殊小螺钉来固定芯片本身，因此它不会移动。激光束应直接指向选定的流通池。为此，您可以使用图 6B 中所示的调整螺钉来调整激光信号。
图 6.微流控芯片设备设置。
(A) 将芯片固定在支架内。先固定银色螺丝，再固定红色塑料螺丝。当它们直接接触芯片时要格外小心。(B) 芯片支架，指示用于激光定位的芯片和调整螺钉的放置位置。

7. 将芯片固定在芯片支架中后，立即将流动池连接到抽吸真空泵。一根小型塑料电缆连接到抽吸真空泵，可以使用调节开关打开/关闭，标记为 11b（如图 2 和图 3 所示）。一根红色的小管（图 7）直接放置在您选择的流动槽之一的开口内。牢固地固定它。取一个装满水的 10 µl 移液器，将移液器吸头放在流通池的开口内。检查移液器中的水是否被连接的真空管吸出。如果没有，请调整位置和/或尝试其他频道，直到它工作为止。对于成功的 BSI 设置而言，将流通池连接到真空泵可能是最具挑战性的任务。因此，在这一步中，细心和耐心是最重要的。图 7 显示了流通池与真空泵的成功连接。
图 7. 真空泵与微流控芯片设备的连接。
连接管显示与芯片内部芯片流通池的连接。

8. 通过调整连接电缆到芯片中流动池的位置来保持泵压力。有时泵从流动池中吸入样品的速度非常快，有时太慢。通过轻轻尝试找到平衡的压力。
9. 要设置信号，请使用用于制备样品的缓冲液填充流动槽。对于信号测量，激光束射到反射镜上（图 8 中的黄色箭头）并直接反射到流通池（图 8 中的黄色箭头），然后反射回反射镜，最后反射到 CCD 相机（红色箭头）在图 8）。加载到流动池中的蛋白质样品中发生的分子相互作用会影响激光束的反射角。CCD 摄像机监测到的信号以条纹图案的形式显示出来，并由 BSI 软件进一步处理。条纹图案的示例如图 9 所示。
图 8. 激光路径指示。
激光源是手指指向的地方。激光束（用黄色箭头表示）照射到镜子（白色圆形器件）上，在那里被反射并照射到芯片上。反射回镜子后（红色显示的路径）。它最终到达 CCD 相机，在这张图片中它被一张纸覆盖。

图 9. CCD 相机的条纹图案。
红点代表条纹图案，显示在 CCD 相机上。

10. 条纹图案读出：BSI 软件用于读出条纹图案，条纹图案随生物分子相互作用引起的流动池中反射条件的变化而变化。可以检测到纳摩尔蛋白质浓度的信号差异。
11. 条纹的选择：条纹以振荡峰的形式表示（图 10），并手动选择所需的峰。每个峰对应于条纹图案中的一个点。选择条纹时应考虑以下几个方面。
a. 峰值的幅度应该可能相等，并且幅度较小（小于 2000 强度单位，图 10，上半部分）的峰值应从进一步处理中排除。合适的高对比度峰具有锐利的边缘、高斯形状、等距且噪声较小（Bornhop等人，2016 年）。强度应该相等（参见图 10 中的边缘选择，上半部分）。
b. 如果可能，应选择五个峰，这些峰将代表测量期间的数据点。
12. 图 10 中间的黑色窗口表示傅立叶变换。按照图 10 中的红色、绿色和白色通道（显示在中间）设置边距。
图 10. 控制信号测量所需的软件快照。
信号测量通过记录软件进行控制。这里显示了三个黑色窗口。从上方的黑色窗口中，我们选择代表条纹图案的峰值。底部黑色窗口中的图像显示了直接的相变（由图像左侧的红色箭头表示），这将在蛋白质-蛋白质相互作用期间发生变化。该相变信号也以数字显示，可以在“比率”下方的图像右侧看到，并表示为“相位”。

13. 理想情况下，比率值应 >2.5 和 <3.8，并且比率中的两个值应该几乎相同。
14. 底部窗口用于确定相位变化。可以观察到相变信号中的一些波动。最小可能的变化应该在 0.01 的范围内。相变以 Rad 为单位报告。图 11 显示了信号记录分步协议的流程图。
图 11. 显示信号记录的单个步骤的流程图。
该图是图 10 的分步表示，以示意方式显示信号记录步骤。在步骤1中，选择红线和黄线之间的条纹。第 2 步是傅立叶变换。步骤 3 表示直接从信号和仪器设置控制的比率调整。第 4 步是相位选择。最后一步是最终的相变测量。

C. 样品制备（图 12）
1. Recoverin 和 GRK1 的表达和纯化按照 Abbas（Abbas等，2019）进行。
2. 使用冻干的野生型恢复蛋白、与 GST 融合的 GRK1（前 25 个氨基酸）的 N 端，并且仅使用 GST 作为阴性对照。测量样品的蛋白质浓度（例如，Bradford，1976）。有关使用 Bradford 方法进行蛋白质定量的一般技巧，请参阅 Abbas 和 Koch (2020)。
3. 用增加的恢复浓度（例如从 0 μM 到 30 μM）制备样品，并添加特定量的 GST 融合蛋白（3 到 4 μM）。将每个样品的总体积保持在 100 到 150 µl 之间。对于背景控制，仅使用 GST 并以相同方式制备样品。图 12 显示了样品制备策略。
图 12. 显示使用 BSI 进行蛋白质-蛋白质相互作用研究的实验设计的方案。
预先准备用于背景（参考）对照的蛋白质和用于阳性结合信号的蛋白质样品。在本示例中，参考对照测量是使用恢复素和 GST（GRK1 融合构建体的融合部分）进行的。阳性结合信号（样品信号）将源自恢复素与 GST-NRK25（以绿色显示）的相互作用。从样品信号中减去背景控制信号（参考）后，所得样品值（以 mRad 为单位）的相位变化被绘制为增加恢复素浓度的函数。

D. 记录信号
1. 从清洁工作台开始，并确保在进行实验时在 BSI 附近放置一个超声波仪。
2. 在暗室中进行测量（图 13），因为光的存在会扭曲激光信号并影响其稳定性。将样品加载到流动槽上时使用头灯。随身携带四套 10 µl 移液器和一盒装满 10 µl 移液器吸头的盒子。将所有移液器设置为 10 µl。
3. 从阴性对照或参考样品测量开始以节省一些时间。将吸头装满的移液器放入流通池的开口；由于泵压力，它将开始直接从移液器吸头吸取样品，而不会释放它。由于样品将从流通池中通过，请使用开关控制 b 快速关闭从流通池流出的气流。通过这样做，除非使用开关控件 11b（图 2 和 3）再次打开流通池，否则样品将留在流通池内。装载样品时将控制开关 11b 保持在左手。
4. 由于微流体装置直接位于镜子下方，镜子被放置以将激光束反射到 CCD 相机，避免通过使其与移液管接触来改变镜子的位置。
5. 加载样品后，记录信号 30 秒。在两者之间，选择第二个移液器并用阳性对照恢复样本和 GST-NRK25 融合蛋白填充。按下控制开关 11b，这将打开流通池。已经在里面的样品会立即被吸走。现在以相同的方式加载新样本并记录信号。
6. 每个样品应在单个实验中测量五次（技术重复），同时测量阳性对照样品的五次和阴性对照样品的五次。至少应测量三个生物学重复。
7. 由于您使用相同的流通池测量两个样品（此处为恢复和对照），因此清洁两者之间的流通池很重要。为方便起见，可以遵循以下顺序。
a. 加载参考样本并进行测量。
b. 使用用于制备样品的相同缓冲液清洁流动池。
c. 加载恢复样品并测量。
d. 用 10 µl 70% 或 100% 乙醇洗涤一次。
e. 用双蒸水洗五次。
f. 用您的样品缓冲液平衡通道两次。
g. 从参考样品重新开始（从 a 到 g 重复）。

图 13. 执行实验时 BSI 系统的概述。
激光束指向镜子，将光束反射到芯片支架中的芯片上（有关设置的不同视图，请参见图 8）。开关 B 控制芯片中通道的打开和关闭。CCD 相机中显示了条纹图案。

数据分析

打开数据分析程序，点击“打开文件”。程序文件如图14 所示。加载GRK1 和recoverin 的文件。该测量旨在记录来自增加浓度的恢复蛋白和固定浓度的 GST-N-GRK25 的混合物的信号。可以从任何点进行数据分析。数据分析程序具有三个黑色窗口（1、2 和 3），可以显示记录的信号。图 14 显示了窗口 2 和 3 中加载的文件。需要放大显示才能看到记录的信号。为此，我们有两个黄色和红色光标，如窗口 1 和窗口 2 所示。放大信号的一种简单方法是设置 x 轴和 y 轴值，如下图窗口 1 所示。一旦您看到参考和样本测量记录的信号（四次，图 15 中的窗口 2），将黄色光标置于信号左侧，将红色光标置于信号右侧。这将显示点数、算术平均值和标准偏差的值（图 15 中窗口 3 的左侧）。符合良好信号条件的最小点数应为 800。单击“创建新表”按钮（上一行），设置行数和列数，然后单击“绘图平均值”按钮（右侧下一个）到图 15 中的窗口 3）。此操作会将值带到表中。通过执行这些步骤，将提取所有记录信号的值。

图 14. 数据分析。
使用数据分析软件分析数据，如上所示。加载数据，它出现在窗口 2 和 3 中。

图 15. 数据提取。
数据被提取并绘制在软件窗口底部的表格中。在下一步中，从样本信号中减去参考信号的值。

参见下面的例子：
参考：2.00031
样品：2.01134
样品 – 参考 = 0.01103 Rad
将此值转换为 mRad
0.01103 * 1000 = 11.03 毫拉德
计算所有 9 个记录浓度的该值，并使用 Sigma Plot 13 绘制 mRad 信号作为恢复素浓度增加的函数。如果在恢复素浓度为零时检测到较小的 mRad 信号，请在绘制数据之前从所有数据点中减去该值。在本实验中，我们产生了平衡解离常数 K D = 5.1 ± 1.9 µM（图 16）。其他人和我们之前进行的类似实验（Sulmann等人，2017 年；Abbas等人，2019 年）分别报告了4.72 μM ± 0.72 μM 和4.2 ± 1.9 μM 的K D值。先前的研究和本贡献中的当前研究均采用了相同的 recoveryin 和 GRK1 构建体（GST 的融合蛋白和 GRK1 的第一个 N 端 25 个氨基酸，参见背景），但样本来自不同的生物制剂。ķ d在较低的微摩尔范围内的值是一致的与半最大抑制的（IC值50 ）GRK1的由恢复蛋白（Gorodovikova等人，1994; Klenchin等人，1995），这是光响应期间生理过程恢复（见背景）。苏尔曼等人。(2017) 进一步测试了在钙存在和不存在的情况下，恢复素和 GST-GRK1 融合蛋白的结合过程，显示缺乏结合，当钙不存在时（图 1，Sulmann等人，2017）。

图 16. recoveryin 和 GRK1 的相互作用。
的交互数据被绘制为增加的浓度的函数恢复蛋白在μM。提取了表观解离常数 (K D = 5.1 ± 1.9 µM) 。

笔记
1. 切勿在不戴手套的情况下接触微流控芯片设备。
2. 完成实验后，将微流控芯片装置存放在 100% HPLC 级乙醇中。
3. 始终在暗室中进行实验。没有直射光会干扰 HeNe 激光器。
4. 在开始实验前至少 3 小时打开 HeNe 激光器。这将有助于创建稳定的信号。
5. 使用头灯将样品加载到微流控芯片中。

食谱
1. BSI缓冲器
20 mM HEPES-KOH (pH 7.5)
100 毫米氯化钠
1 毫米氯化镁2
400 µM 氯化钙2
致谢

我们感谢德国学术交流计划 (DAAD) 和 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG，授权号 GRK1885) 的财政支持。该协议是从以前的工作（Sulmann等人，2017 年；Abbas等人，2019 年）中修改而来的。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

根据类别 S1 中的安全规定，对重组蛋白进行了实验。

参考
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2. Abbas, S.、Marino, V.、Dell'Orco, D. 和 Koch, KW（2019 年）。视紫红质激酶 GRK1 和 Recoverin 的分子识别通过切换分子内和分子间静电相互作用进行调节。生物化学58（43）：4374-4385。
3. Ames, JB, Levay, K., Wingard, JN, Lusin, JD 和 Slepak, VZ (2006)。恢复蛋白钙诱导的视紫质激酶抑制的结构基础。J Biol Chem 281(48): 37237-37245。
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