材料和试剂

1. 固体硼硅酸盐玻璃棒，直径 1 mm（Sutter Instruments，目录号：BR-100-10）

2. 35 mm玻璃底培养皿（Cellvis，目录号：D35-20-1.5N或D35C4-20-1.5N）

3. 火焰抛光巴斯德移液器

4. 橡皮泥

5. 深孔培养皿，100 × 15 mm（Fisherbrand，目录号：FB0875712）

6. 20 ml 带盖玻璃闪烁瓶

7. 1.5 毫升翻盖管

8. 钨针（例如，Roboz，目录号：RS-6063）

9. 斑马鱼幼虫

10. Tricaine（Sigma，目录号 E10521）。在室温下储存

11. 1 M Tris 溶液，pH 9（固体 Tris：Fisher BioReagents，目录号：BP153-1）

12. 低熔点琼脂糖（Invitrogen，目录号：16520050）。在室温下储存

13. E3 中等。在室温下储存（见食谱）

设备

1. 胚胎操作工具：

安装在支架（Fine Science Tools，目录号：26018-17）中的弯曲销机械手（Fine Science Tools，目录号：26007-03）和小刮刀机械手（Fine Science Tools，目录号：26007-05）

2. 手术刀手柄和刀片（#11-刀片）

3. 拔针器（Sutter Instruments，型号：P-87）

4. 通常用于解剖的立体显微镜（我们使用的是蔡司 Stemi 508）

5. 用于更高分辨率成像的倒置显微镜（我们已经在 Nikon Ti2 和 Leica DM6000B 上尝试了该协议）

6. 用于 1.5 ml 试管的加热块，保持在 38℃

7. 安装在倒置显微镜附近的摆臂灯（Dazor Lighting Technology，目录号：6134）

程序

A. 准备玻璃针

我们发现使用固体硼硅酸盐玻璃棒取得了成功，它在强度和柔韧性之间取得了平衡。我们还尝试使用蚀刻的钨针（例如，Roboz，目录号：RS-6063），但我们发现尖端非常脆弱，在撕裂过程中很容易在培养皿的玻璃底面上折断，而玻璃针却很灵活因此没有那么容易破裂。

使用不同的拔针器重现精确的针尖形状将具有挑战性；我们在拔针器上优化的参数可以作为起点，在下面分享。太短的针在与玻璃底面接触时容易折断而不是弯曲；太长太细的针太灵活，不能有效地撕裂尾翼。与任何显微操作程序一样，始终需要反复试验以优化您的精确设置。

1. 通过推出两个“蠕虫”造型粘土，可以在平行线中放入培养皿中，为针头准备一个储存容器（图 1A）。可以轻轻地将针头压入这些蠕虫中以固定到位以进行存储。

图 1. 撕裂针和持针器示例。

(A) 用粘土“蠕虫”在培养皿中制作的持针器以固定针头，例如用于撕裂的针头。(B) 不同长度针尖的放大视图。通过按指示调整压力设置获得不同长度的针，使协议步骤 A3 中的所有其他参数保持相同。从上到下：太短（压700）、刚好（压500）、太长（压400）。标尺显示比例；单个蜱间隔 0.5 毫米。

2. 在您的拔针器上设置拔针程序。由于长丝特性、局部湿度和许多其他因素的差异，精确的拉针参数不容易在机器之间重现。萨特仪器已经产生了一系列的与实际的建议有用的教程视频上拉针，例如，https://youtu.be/s4Os3FIDYxc。作为一个粗略的起点，我们在安装有 3 × 3 毫米盒状灯丝和斜坡校准值 665 的 Sutter Instruments P-87 拔针器（火焰棕色型）上拔针，使用以下参数：加热 665（设置为斜坡值）；拉55；速度 60；时间 250; 压力 500. 针在一次拉动中形成，至少需要 10 秒的加热时间 ——比典型显微注射针的拉力更长。图 1B 显示了一个好的针头，以及针尖太长或太短的针头的例子。然而，对针有用性的真正考验是它在撕裂过程中的表现：如果它太容易弯曲，难以撕裂组织，那么它就太长了，而如果针尖很脆并且在定位时很容易折断裂伤，它可能太短了。

3. 将硼硅棒插入拔针器中，并按照拔针器的说明进行拉拔。取出针头并将它们放入针头储存容器中。

4. 针头不会在拔针时所用灯丝的热量之外进行消毒，并且可以重复使用数周，或者直到组织碎片粘在针头上，或者溶液中含有溶解性差的药物，例如可能会吸附到玻璃上的 blebbistatin。通常，针在此时间范围内停止使用。

B. 在 E3 培养基中制备低熔点琼脂糖

1. 准备 60 倍的 E3 储备溶液（参见配方）。

2. 用反渗透水（RO 水）将 E3 稀释至 1 倍，并加入低熔点琼脂糖至 1.2% w/v 的浓度。选择 1.2% 的浓度是为了在安装过程中容忍一些稀释，同时保持足够的刚度。我们经常使用高达 2% 的琼脂糖浓度，并具有类似的功效。

3. 微波 E3-琼脂糖混合物直至完全溶解，使用低至中等功率以防止沸腾。

4. 分成约 6-7 毫升的等分试样（我们使用 20 毫升带螺旋盖的玻璃闪烁瓶，但也可以使用其他可微波的容器），可在 4°C 下储存数月。

5. 在实验之前，使用几秒钟的短脉冲在微波中重新熔化等分试样，并轻轻摇晃直到琼脂糖明显溶解。注意，小瓶会变得很热！

6. 吸取 720 µl 这种培养基到 1.5 ml 试管中，并将试管保持在 38-40°C 以防止琼脂糖凝固。这些工作小瓶最多可以使用 1 周，之后管顶部附近的琼脂糖开始聚合。请注意，38°C 是斑马鱼幼虫的高温。根据我们的经验，琼脂糖从加热块中取出后会迅速冷却，浸入时对斑马鱼幼虫的压力很小。如果您的实验需要考虑升高的温度，您可以使用较低的温度，这将缩短在琼脂糖凝固之前安装幼虫的可用时间。我们还没有尝试过使用较低的温度。

C. 处理斑马鱼幼虫

受精后 30-120 小时 (hpf) 的斑马鱼已成功使用该协议受伤。

1. 根据标准程序 (Westerfield, 2007) 和您所在机构的比较医学部门或其他负责研究动物福利的办公室的指导，维护斑马鱼种群。

2. 在胚胎受精前的下午，将 1-2 条繁殖年龄（至少 3 个月大，取决于饲养条件）的雄性斑马鱼和 1-3 条雌性斑马鱼放入产卵池中。第二天早上，斑马鱼设施中的灯亮起后，鱼就会产卵。

3. 产卵后将成虫送回它们的住所。将产卵水倒入网状过滤器中，然后用系统水将鸡蛋冲洗到培养皿中，从而收集受精卵。

4. 将胚胎分成多个系统水培养皿，每个深孔培养皿的密度不超过 60 个胚胎，或每个常规培养皿的胚胎密度不超过 50 个。在每天结束时检查胚胎，包括受精日，以去除死胚胎并防止真菌生长。将胚胎转移到新鲜的系统水中有助于最大程度地减少微生物生长。也可以添加像亚甲蓝这样的抗真菌剂，但这些药剂也会经常染色幼虫表皮内的细胞类型，这对于下游成像来说可能是不可取的。

5. 根据您的规格筛选胚胎以获得所需的遗传表型（例如，荧光标记）。

D. 安装幼虫

对于本文中的大部分工作，我们选择了在琼脂糖中安装的快速灵活的程序，然后从琼脂糖中切出一个窗口，以便使用微针进入尾鳍。或者，像 zWEDGI 这样的设备可用于固定幼虫，同时尾巴保持自由（Huemer等人，2017a 和 2017b）。这些装置有助于将幼虫一致地安装在正确的位置，并且还允许独立控制幼虫前侧和后侧的培养基成分，但需要更多的时间投入到前期组装中。之前已经发布了使用这些设备的详细协议（Huemer等，2017b）。请参阅视频 1 以演示本节中描述的技术。

视频 1. 斑马鱼幼虫的安装和撕裂演示。

1. 如果幼虫仍在它们的绒毛膜中，将幼虫脱毛并让它们拉直几分钟。然后，用火抛光的玻璃巴斯德吸管将它们转移到含有 E3 + 三卡因的培养皿中。允许几分钟来麻醉幼虫，这可以通过移液器的轻喷或用弯曲的销操纵器轻敲来确认。

2. 在幼虫被麻醉时，将 30 µl 25×三卡因溶液添加到 E3 + 低熔点琼脂糖等分试样的一侧，轻轻轻弹以混合，同时尽量减少气泡。用毡尖笔标记该等分试样，并在一天结束时将其扔掉。

3. 在巴斯德吸管中收集麻醉幼虫, 并将它们转移到标记的琼脂糖管的盖子中。快速工作，小心地去除鱼身上多余的液体，然后盖上盖子，倒置管子，将幼虫悬浮在琼脂糖中。将管子正面朝上翻转并检查所有幼虫是否都在琼脂糖中，而不是粘在墙上或仍在瓶盖中 - 可能需要摇动管子以使幼虫进入琼脂糖的主溶液中。

4. 使用巴斯德移液器和移液管将约 500 µl 溶液收集到 35 毫米玻璃底培养皿的孔中，收集幼虫和琼脂糖。使用弯曲的销操纵器以图 2A 所示的方向定位和安装鱼，如下所述：将尾鳍放置在盘子中心附近以提供最大的操纵空间，并将幼虫安装在其右侧，以便尾鳍与培养皿的玻璃底部共面；这需要练习和耐心。使用弯曲的销操纵器的侧面轻轻按压卵黄囊和卵黄延伸部上的幼虫，使其在琼脂中移动。避免用弯针操纵器的尖端接触幼虫，这会损坏幼虫。也尽量避免直接接触尖端尾翼，防止成像前不慎损坏。卵黄囊的大尺寸往往会导致幼虫相对于玻璃表面倾斜，因此必须经常刺激幼虫并重新定向，直到琼脂糖开始凝固，大约在放入培养皿后几分钟，具体取决于环境温度。当表面发生变形时，您可以看出琼脂糖开始凝固。我们通常一次安装 4 只幼虫以确保一致的安装，尽管一开始一次只能尝试一两个，随着练习，可以同时安装更多的幼虫。成功安装在与玻璃底部平行的平面上的幼虫将需要较小的成像体积，因此导致较低的光毒性和用于数据存储的较少计算机内存。

5. 一旦琼脂糖开始凝固，再等几分钟使其完全凝固（表现为不透明的外观），然后将其覆盖在 E3 + 三卡因溶液或其他感兴趣的溶液中。

6. 使用 #11 手术刀刀片, 在幼虫的尾鳍周围切一个窗口, 如图 2B-2D 所示。选择这种刀片是为了清楚地看到尖端，以避免无意中损坏幼虫。

a. 使用刀片的尖端，将其拖过琼脂糖，在幼虫的树干上方垂直于前后轴的琼脂糖进行全层切割（图 2B）。这个切口应该位于尾鳍和蛋黄延伸部分之间的中间位置，但可以比这更靠后；如果切口距离幼虫太远，那么血流的泵送会引起尾鳍的周期性运动，从而在成像过程中导致运动伪影。必须小心不要伤害幼虫：小心地将刀片向上提起并越过每只幼虫，尽可能靠近幼虫，然后向下接触另一侧的玻璃底面。

b. 接下来做一个平行于幼虫后部的切口。

c. 最后在两侧平行于幼虫的前后轴进行两次切割, 与其他切割相结合, 从尾鳍周围完全切出一个矩形的琼脂糖。

d. 使用小铲子操纵器，将铲子插入树干上方切口中的两个幼虫之间，然后轻轻地将琼脂糖从尾鳍上撬出盘子（图 2C）。如果琼脂糖浓度足够高，整个块应该均匀地出来（图 2D）。有时，此过程将琼脂糖分解成小块，应将其完全去除，以避免在受伤过程中干扰针头。

e. 使用弯曲的销机械手，在尾鳍周围跟踪以检查是否有残留的琼脂糖：如果去除了所有琼脂糖，则四处跟踪不应导致尾鳍移动，而残留的琼脂糖会抓住尾鳍并使其弯曲。通常在尾鳍周围追踪也将有助于完全去除残留的琼脂糖。

图 2. 安装和受伤的幼虫示意图。

（A）四幼虫被描绘在下面安装一个合适的方向。即以蓝色阴影幼虫的部分被嵌在琼脂糖。窗口的位置的琼脂糖由围绕尾翼非阴影矩形表示被切出。受伤过程的不同阶段中示出。从上至下：未受伤的; 用2个平行撕裂伤，如在（肯纳德和塞里奥特，2020）受伤; 根据以45°角向前后轴与撕裂伤订正方法受伤（这项工作中，见正文）; 裂伤后立刻受伤尾翼。撕裂的位置用虚线表示。（BD）步骤一步说明切出琼脂糖窗口。（B）删节以琼脂糖使用由数字1-4所示的顺序的手术刀。在第一切口，手术刀围绕幼虫提升以避免切割它。（C）使用小刮勺操纵器，琼脂糖的块从围绕幼虫除去。（d）琼脂糖的块被完全从培养皿移除并丢弃。请注意块将有草皮在它以前由幼虫占据。

E. 撕裂伤

这也是一个灵活的程序，可以通过多种方式完成：首先，在显微镜上受伤允许在受伤前后立即对相同的幼虫进行成像，这是在受伤后第一分钟左右观察事件所必需的。通过实践，这可以手动快速且可重复地完成。最后，样品可以在立体显微镜上手动受伤，然后移动到共焦进行成像。这种方法的优点是增加了立体显微镜提供的可见性和控制，代价是在受伤后的最初几分钟内错过了事件。

或者，也可以使用显微操纵器将针固定在适当的位置，以减少控制（取决于您的显微操纵器控制器的复杂程度）和增加设置和对准时间为代价，为针提供更大的稳定性。该协议深入讨论了手动伤人策略，并简要介绍了微操作器伤人的一些注意事项。请参阅视频 1，了解立体显微镜下的伤口演示。

1. 在立体显微镜下手动撕裂

a. 拿一根针，像握笔一样握住它；您的中指以及另一只手的手指可用于进一步稳定。当针头尽可能接近垂直向上和向下时，撕裂的效果似乎是最好的，而不用手指挡住幼虫的视线。

b. 用针将幼虫刺入脊索末端背侧或腹侧的位置，然后向后拖动针头，撕裂尾鳍（图 2A）。

在随后的调查中，我们发现在 XY 平面中以 ~45° 角拉针，按照放线菌的方向，产生更清洁的伤口，从幼虫到幼虫更有可能保持一致，并且不太可能撕裂尾鳍中的一大块（图 2A）。

c. 在脊索另一侧的一个位置重复此撕裂，以便尾鳍上有两个撕裂，它们关于背/腹轴理想对称。

d. 幼虫现在已准备好对伤口反应进行成像或其他下游分析。

注意：此过程也可用于培养皿中未安装（麻醉）的幼虫，以获得更高的吞吐量。在这种情况下，用您的非惯用手握住弯曲的销操纵器，将工具的尖端放在幼虫上方（背面）并降低它，直到它牢固地将幼虫固定在蛋黄后面的盘子底部囊。用惯用的手握住针头，按描述缠绕幼虫；受伤过程将向后拉扯幼虫，这将被机械手工具抵抗。通过实践，这可以在短短几秒钟内完成，并允许在短时间内伤害培养皿中的许多未安装的幼虫。

2. 在倒置显微镜下手动撕裂

这个过程是在倒置的范围内完成的，以便于访问；它已在 Leica DM6000B 和 Nikon Ti2 上成功实践。使用较低放大倍率的镜头，此过程更容易，尽管它已成功且常规地应用于高达 60 倍的放大倍率。强烈建议以 10 倍的速度练习直到舒服为止。

a. 如果需要，在受伤前获取尾鳍的一些图像，然后停止或暂停获取伤人的图像。确保在接下来的步骤中选择光路中的目镜而不是相机。

注意：如果使用共聚焦，请确保您的激光已关闭或您的激光安全联锁功能正常，以防止您的眼睛无意中暴露在通过目镜的直射激光中。

b. 将透射光转台移出光路，提供更多操作空间；为了提供光线，摆臂支架上的外部灯可以在光路中移动到位（如果需要，可以放在转塔的某些部分）。使用这种光源具有像低 NA 聚光镜一样照亮样品的额外优势，它为伤口提供比通常用于采集的景深更大的景深。

c. 用一只手在拇指和食指和中指之间握住一根针。将手臂移到样品上，将针定位在光路中，注意不要用手指挡住光路。将另一只手从样品的另一侧伸入，您可以使用其他手指进一步稳定针，并将手放在显微镜主体的稳定部分上。确保您的手没有紧张感，以免手指过度晃动。

i. 根据光学设置，将针从样品的前面或后面带入可能会有所帮助。

ii. 通常，针需要以一定角度定位，以防止您的手挡住光路。然而，当针尽可能接近垂直时，组织穿刺和损伤的有效性似乎更大。

d. 小心地将针对准焦点。首先用肉眼观察针头相对于样品的位置，确保您将其握在靠近幼虫的位置，然后小心地重新定位您的身体以通过目镜观察，而您的手不要移动太多。逐渐降低针头朝向样品，轻轻地在视野范围内来回摆动针头，以提供针头何时进入焦点的视觉提示。通常将光路内针杆上方的位置居中而不是针尖是有帮助的；当针降低到焦点时，您不太可能错过整个轴，而尖端定位的小错误可能会导致您将针移出视野，或意外过早刺穿幼虫。另一方面，如果您将注意力集中在轴上太远的点上，则可能会冒着将针放得太远而折断针尖的风险。

e. 一旦针尖在焦点和视野中，继续如上所述撕裂尾鳍（“在立体显微镜下手动受伤”）。与立体显微镜相比，这种设置中的手震颤更明显，并且需要练习以与立体显微镜下提供的相同程度的控制进行穿刺。通常大部分时间都花在将针定位“足够近”（考虑到手部颤抖的程度），然后转向该位置并刺穿尾鳍，无论接下来会发生什么。在实践中，我们发现伤口愈合后的许多有趣事件对伤口几何形状的变化是稳健的。

f. 撕裂后，将灯摆出光路，更换透射光转台，将光路切换回相机而不是目镜，并恢复图像采集。

g. 在此过程中，尾鳍的移动在此过程中比在整个幼虫嵌入琼脂糖的典型斑马鱼成像中是一个更大的问题。特别是在更高的放大倍数下，幼虫可能在受伤前相对于其位置发生了移动（X、Y 和 Z）。在前几帧中尤其如此，因为尾鳍在受伤过程中被拉动后会“放松”回到原来的位置。受伤后可能需要重新聚焦样品。如果可能，在采集过程中在 Z 中设置比必要更大的体积以适应此类样品移动可能是有益的。额外的图像配准方法也可以帮助纠正这种事后运动（Kennard 和 Theriot，2020）。

3. 用显微操作器伤口

也可以将针置于显微操作器中进行上述程序。这种方法将大大减少由于手颤引起的不精确。但是，显微操作器需要练习和小心才能在成像之前正确对准光路，并且会为实验增加很多额外的设置时间。显微操作器还提供了在样品交换过程中意外折断针头的额外机会，这需要使用新针头重新调整设置。此外，大多数显微操纵器都是为小而精确的运动而设计的，而不是为刺穿和撕裂尾翼所需的较大、有力的运动。虽然显微操作器可以精确定位，但它们并不能保证精确的伤口定位，因为尾鳍非常灵活并且在撕裂过程中被拉扯时不会保持原位。我们发现上述手动程序更适合我们的实验需要。

尽管有这些警告，如果需要使用显微机械手进行撕裂，我们在初步试验中发现，3 轴液压操纵杆式机械手控制器 (Narishige MO-202U) 提供足够的自由度和运动范围，直观控制可实现有效撕裂，尽管更大的运动范围将是理想的。

数据分析

撕裂方案的灵活性使其能够与各种不同的检测相结合，每种检测都有不同的分析。例如，可以比较不同治疗对基底表皮细胞对撕裂的反应的影响（参见 Kennard 和 Theriot，2020 年此类分析的示例，包括统计细节）。其他分析将根据所需的测定或终点而有所不同。对于显微成像目的，每个幼虫通常被认为是一个独立的生物复制品。

由于撕裂所固有的伤口几何形状的可变性，还没有建立正式的标准来根据伤口的形状排除幼虫。偶尔——尤其是当研究人员仍在改进他们的撕裂技术时——针的滑动可能会导致无意中的极端伤口，从而对脊索、肌肉或尾鳍更前方的其他组织造成严重损伤。在这些情况下，伤口反应可能比通常在撕裂伤期间观察到的要严重得多，因此从进一步分析中排除此类重复可能是值得的（见 Kennard 和 Theriot，2020 年典型反应的例子）。这种极端损伤并不常见，因此尚未建立定义此类极端伤口的标准。一种可能的迹象是，在撕裂后用明场显微镜观察时，材料（例如血细胞）似乎正在从尾鳍中泄漏出来。此处概述的撕裂协议不应损害血管化组织，因此出血表明伤口比预期的要严重，因此应将这种特殊的复制排除在进一步分析之外。

笔记

1. 可变伤口几何形状的优点和局限性

虽然通过实践裂伤可以产生一致的结果，但与其他方法相比，这种技术会导致更多可变的伤口几何形状，例如手术刀伤口或激光伤口（参见图 3，了解撕裂后伤口几何形状的代表性样本）。根据我们的经验，我们发现这可能是一个优势，因为如果伤口位置控制得太精确，例如前后发育模式的生物学差异会导致伤口反应的系统偏差，这取决于伤口的位置。参见 Lopez-Baez等人，2018 年图 1 补充件 1e)。我们发现，尽管伤口几何形状不同，但不紧邻撕裂伤（约 20-300 µm）的细胞的反应在很大程度上是一致的（Kennard 和 Theriot，2020）。因此，我们相信裂伤非常适合询问这些更远距离的细胞的行为。

由撕裂引起的可变伤口几何形状的一个主要限制是伤口愈合进展更难测量。简单的圆形伤口通常用于伤口愈合研究，因为伤口愈合的进展可以很容易地通过伤口大小作为原始伤口大小的一部分来衡量（Abreu-Blanco等人，2012 年；Gault等人，2014 年））。相比之下，从单个图像中看不到撕裂伤是否闭合或仍在愈合。相反，动态指标（例如细胞速度与伤口距离和受伤后时间的函数关系）可以表明伤口愈合过程是否仍在进行中（Kennard 和 Theriot，2020 年）。

图 3. 裂伤后伤口几何形状的可变性证明。

(A) 裂伤后立即显示 9 只代表性幼虫的尾鳍。幼虫是 3dpf，在热休克诱导型启动子 ( hsp90:myl9-mApple )下表达与 mApple 融合的肌球蛋白轻链激酶（Lou等，2015）。显示的是使用 20 × NA 0.95 水浸物镜（尼康）在旋转圆盘共聚焦上获得的 z 堆栈的最大强度投影。为了引起对伤口几何形状特别显着变化的注意，每个幼虫下方显示了两个幼虫的伤口几何图形，表明撕裂尾鳍如何导致干净的撕裂 (C) 或去除一大块尾鳍 (B)。

2. 潜在问题

最常见的故障模式之一是，由于施加在针头上的压力太大，针头的尖端会撞到玻璃底面。这可能会导致在您的采集过程中玻璃碎片留在视野中，可能会掩盖感兴趣的事件。如果没有多少尖端折断，人们可能会想继续使用针头。然而，我们发现这些较钝的针更容易再次折断，因为针尖的剩余部分比折断的部分更厚更脆，并且随着每次断裂，针尖变得更大，刺穿组织的能力降低，产生干净的眼泪。我们建议手头有几根备用针，这样人们就可以快速将断针放入锐器箱中，并继续使用新针。

3. 可能应用于再生研究

我们对这项技术的主要兴趣是观察伤口愈合后一小时内发生的快速迁移性伤口反应，为此该程序的简单性和灵活性是有利的。我们还没有正式调查这种伤人技术是否也可以用于研究数小时或数天的再生。原则上支持这种可能性，我们观察到超过 100 只撕裂的野生型幼虫都能够在一周内再生出完整的尾鳍（未发表的观察结果）。观察撕裂伤的复杂几何形状如何重组以重新形成完整的尾鳍会很有趣。尚未评估的一项技术挑战是琼脂糖窗口技术（步骤 D）对于超过几个小时的成像的适用性。如果需要长期成像，专用的成像室，如 zWEDGI 设备可能更合适（Huemer等人，2017a 和 2017b）。

食谱

1. E3 培养基（E3 + 三卡因）

a. E3（1x 浓度：5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl ₂、0.33 mM MgSO ₄）根据引用的方案制备为 60x 储备液，无需高压灭菌或添加亚甲蓝（冷泉港， 2011）。它在室温下保持数周。

b. 通过将三卡因溶解在水中并加入 2% (v/v) 的 1 M Tris，pH 9，制备 25x 三卡因储备溶液（4 mg/ml 储备浓度）。滴定额外的 Tris 溶液使溶液达到最终 pH 值为 7。该储备溶液已过日期并在冰箱中储存长达 6 个月。

c. 在成像当天，通过用 MilliQ 水将 60x E3 和 25x tricaine 原液稀释至 1x，新鲜制备 1x E3 + tricaine（称为 E3 + tricaine）溶液。在每天结束时丢弃该溶液。

致谢

ASK 和 ECL 得到了 NIGMS 培训补助金 (T32GM008294) 的支持。ECL 也得到了 NSF GRFP (DGE-1656518) 的支持。JAT 感谢霍华德休斯医学研究所和华盛顿研究基金会的支持。

该协议源自之前的出版物：Kennard and Theriot, 2020 (DOI: 10.7554/eLife.62386)。

利益争夺

作者声明他们没有竞争利益。

伦理

斑马鱼的工作得到了华盛顿大学机构动物护理和使用委员会的批准，协议编号为 4427-01。

参考

1. Abreu-Blanco, MT, Verboon, JM, Liu, R., Watts, JJ 和 Parkhurst, SM (2012)。果蝇胚胎使用细胞突起和肌动球蛋白钱包串的组合闭合上皮伤口。J Cell Sci 125（4）：5984-5997。

2. Briona, LK 和 Dorsky, RI (2014)。幼虫斑马鱼的脊髓横断。J Vis Exp (87)：e51479。

3. Datta, R.、Wong, A.、Camarata, T.、Tamanna, F.、Ilahi, I. 和 Vasilyev, A.（2017 年）。用于模拟发育斑马鱼急性肾损伤的精确细胞消融方法。 J Vis Exp (124)：e55606。

4. 冷泉港。(2011)。E3 培养基（用于斑马鱼胚胎）。Cold Spring Harb Protoc pdb.rec066449。

5. Enyedi, B.、Jelcic, M. 和 Niethammer, P.（2016 年）。细胞核作为组织损伤引起的炎症的机械传感器。 单元格165(5)：1160-1170。

6. Franco, JJ, Atieh, Y., Bryan, CD, Kwan, KM 和 Eisenhoffer, GT (2019)。细胞拥挤影响挤压和增殖以促进上皮组织修复。 分子生物学细胞30(16)：1890-1899。

7. Gault, WJ、Enyedi, B. 和 Niethammer, P. (2014)。渗透监测通过核苷酸释放介导快速伤口闭合。J Cell Biol 207(6): 767-782。

8. Huemer, K.、Squirrell, JM、Swader, R.、LeBert, DC、Huttenlocher, A. 和 Eliceiri, KW (2017a)。zWEDGI：用于成像活斑马鱼幼虫的伤口和诱捕装置。斑马鱼14（1）：42-50。

9. Huemer, K.、Squirrell, JM、Swader, R.、Pelkey, K.、LeBert, DC、Huttenlocher, A. 和 Eliceiri, KW (2017b)。用于改进斑马鱼幼虫实验操作的长期实时成像装置。 J Vis Exp (128)：e56340。

10. Kennard, AS 和 Theriot, JA (2020)。与渗透压无关的电线索引导对斑马鱼表皮损伤的快速反应。Elife 9：e62386。

11. Lopez-Baez, JC, Simpson, DJ, L, LLF, Zeng, Z., Brunsdon, H., Salzano, A., Brombin, A., Wyatt, C., Rybski, W., Huitema, LFA, Dale, RM等。(2018)。Wilms 肿瘤 1b 定义了与脊索修复相关的伤口特异性鞘细胞亚群。 Elife 7：e30657。

12. Lou, SS, Diz-Munoz, A., Weiner, OD, Fletcher, DA 和 Theriot, JA (2015)。肌球蛋白轻链激酶独立于膜张力或 Rho 激酶调节细胞极化。 J Cell Biol 209(2): 275-288。

13. Mateus, R., Pereira, T., Sousa, S., de Lima, JE, Pascoal, S., Saude, L. 和 Jacinto, A. (2012)。斑马鱼鳍折叠再生的体内细胞和组织动力学。PLoS 一7(12)：e51766。

14. Miskolci, V., Squirrell, J., Rindy, J., Vincent, W., Sauer, JD, Gibson, A., Eliceiri, KW 和 Huttenlocher, A. (2019)。对斑马鱼幼虫复杂尾鳍损伤的不同炎症和伤口愈合反应。Elife 8：e45976。

15. Vogel, A. 和 Venugopalan, V. (2003)。生物组织的脉冲激光消融机制。化学修订版103(2)：577-644。

16. Westerfield, M. (2007)。斑马鱼书，第 5 版：斑马鱼实验室使用指南 ( Danio rerio )。（第 5 版）。俄勒冈大学出版社，尤金，俄勒冈州。

17. Yoo, SK, Freisinger, CM, LeBert, DC 和 Huttenlocher, A. (2012)。早期氧化还原、Src 家族激酶和钙信号整合了斑马鱼的伤口反应和组织再生。J Cell Biol 199(2): 225-234。

18. Zeng, Z., Lopez-Baez, JC, Lleras-Forero, L., Brunsdon, H., Wyatt, C., Rybski, W., Hastie, ND, Schulte-Merker, S. 和 Patton, EE (2018) . 刺激斑马鱼幼虫转录反应的脊索损伤分析。生物方案8(23)：e3100。