材料和试剂

6孔板中，平底（Corning公司®的Costar，目录号：CLS3516）
96孔板，平底（Corning公司®的Costar，目录号：CLS3595）
移液器吸头
血清移液管
2.0 ml 低温小瓶（Corning ® ，目录号：430659）
2.0 ml Sarstedt 管（Sarstedt，目录号：72.693.005）
5 ml Sarstedt管（Sarstedt，目录号：60.9921.532）
30 ml Sarstedt 管（Sarstedt，目录号：60.9922.216）
8 条 Sarstedt PCR 管（Sarstedt，目录号：72.991.002）
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 —— 高葡萄糖（Millipore Sigma，目录号：D5671）
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - 高葡萄糖，无谷氨酰胺，无酚红（Thermo Fisher Scientific，目录号：31053028）
L-谷氨酰胺（200 mM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030081）
胎牛血清（FBS）（Millipore Sigma，目录号：12003C-500 mL）
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红（Thermo Fisher Scientific，目录号：15400054）
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（Millipore Sigma，目录号：D8537）
Lipofectamine TM 2000（Thermo Fisher Scientific，目录号：11668019）
293A（人胚胎肾上皮）细胞（Thermo Fisher Scientific，目录号：R70507）
BS-C-1（非洲绿猴肾上皮）细胞（ATCC，目录号：CCL-26）
VACV WR（NIH TC 改编；ATCC VR1354），通常称为 Western Reserve（来源是 B. Moss，美国国立卫生研究院）。其他具有复制能力的菌株的行为应该类似。
VACV mCherry（VACV WR 的衍生物）（Gowripalan等，2020）
Cas9 核酸酶，化脓性链球菌，具有 10 × Cas9 核酸酶反应缓冲液（New England Biolabs，目录号：M0386M）
gRNA 作为 Ultramer ® RNA Oligos 购买，储存在 -80°C（集成 DNA 技术，见注 1）
用于重组的质粒在实验前合成并储存在 -20°C（见注 2）
NucleoSpin Plasmid Mini Kit（Machery-Nagel，目录号：740588.250）
羧甲基纤维素（CMC）钠盐（Millipore Sigma，目录号：C4888-500G）
100％乙醇（Ajax AR Grade，目录号：AJA214）
Sharpie ®超细永久性记号笔（Sharpie，目录号：37001）
Taq DNA聚合酶与ThermoPol ®缓冲液（新英格兰生物实验室，目录号：M0267X）
蛋白酶 K（真菌）（Invitrogen，目录号：25530-015）

库存通常在 50 mM Tris pH 8 中制成 10 mg/ml，并储存在 -20°C 下，并在无核酸酶水中进行稀释。

dNTP Mix（Bioline，目录号：BIO39053）
PCR 引物作为定制 DNA 寡核苷酸购买并储存在 -20°C（集成 DNA 技术）
凝胶加载染料，紫色（6×）（New England Biolabs，目录号：B7024S）
UltraPure TM琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，目录号：16500500）
SYBR TM Safe DNA Gel Stain（Thermo Fisher Scientific，目录号：S33102）
D0 媒体（见配方）
D2 媒体（见食谱）
D2 培养基 - 不含酚红（见配方）
D10 培养基（见配方）
D10 培养基 - 不含酚红（见配方）
4% CMC/D2 – 不含酚红（见配方）

设备

2 级生物安全柜（Euroclone，型号：Safemate Vision 1.2 ABC）
CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell 150i CO 2 ）
-80°C 冰箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Forma 705 -80 ℃)
Branson Analog Sonifier S-450 Sonicator（Branson，型号：S-450；102 带 3”杯）
奥林巴斯 CKX53 倒置显微镜（奥林巴斯，型号：N5731900）
带数字控制的干式加热器（Major Science，目录号：MD-02N）
Veriti ® PCR 热循环仪（Applied Biosystems，目录号：4375786）
台式离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5424）

程序

感染和转染

在 2 级生物安全柜中执行所有工作。
将 1 × 10 6 293A 细胞/孔接种到 6 孔板（注 3）中的 2 ml D10 培养基（配方 4 和 5）中。

我们发现这个细胞数量非常适合达到 70% 的汇合度和活跃的细胞生长，这是转染所需的条件。

在 37°C、5% CO 2下孵育细胞过夜。
第二天，在室温下解冻 VACV 股票。

注意：这应该是要修改的亲代痘苗原种。

在冰上超声处理病毒股票 3 次（每次 20 秒，中间间隔 5 秒）。
在 D0 培养基中将病毒原液稀释至 5 × 10 4 pfu/ml（参见配方 1），每孔允许 1 ml。根据电镀的细胞数量，这给出了 0.05 pfu/细胞的数量级。
从 293A 细胞中吸出培养基并用稀释的病毒代替。
在 37°C、5% CO 2下孵育细胞 1 小时。

注意：在某些实验室中，像这样的病毒接种过程中摇动平板是常规操作，但在本协议的任何阶段都没有必要。

在 120 µl D0 培养基中稀释 2 µg 重组质粒 DNA，并在室温下孵育 10 分钟（表 1）。标记管“混合 1”。

注意重组质粒可以使用任何所需的方法合成（见注 2）。

推荐：建议进行一式两份转染，以便获得两个不同的病毒谱系并确保获得所需的重组体。

表 1. 转染 DNA 的制备（混合 1）

将 4 µl Lipofectamine TM 2000 试剂加入 200 µl D0 培养基中，准备“Mix 2”并放置 5 分钟（表 2）。

表 2. Lipofectamine TM 2000 混合物（混合物 2）的制备

将“混合 1”和“混合 2”混合至最终体积为 320 µl/孔，并在室温下孵育 20-30 分钟。
孵育 1 小时后，从细胞中取出含病毒的培养基并丢弃。
向每个孔中加入 680 µl 新鲜 D0 培养基。
以逐滴方式，向每个孔中加入 320 µl DNA/Lipofectamine TM混合物并轻轻摇动板。
在 37°C、5% CO 2下孵育板 4 小时。
取出培养基并更换为 2 ml D2 培养基（参见配方 2 和 3）。
在 37°C、5% CO 2下孵育板 24 小时。
在感染后 24 小时，通过上下大力吹打并转移到 2 ml 低温小瓶中来收集细胞和上清液。

注意：如果使用强贴壁细胞，可以将细胞刮入培养基中。

使用干冰/乙醇浴快速冷冻细胞和上清液，然后使用 37°C 水浴或加热块解冻。循环冷冻和解冻 3 次以释放病毒（或储存在 -80°C 直到准备用于 Cas9 选择）。
继续 B 部分选择重组病毒。

Cas9选择

在 2 级生物安全柜中执行所有工作。
在 6 孔板中接种1 × 10 6 293A 细胞/孔，并在 37°C、5% CO 2下孵育过夜。

允许每管从 A 收集的细胞 6 个孔（见注 4）。

对于选择，通过混合表 3中的组件来制备 Cas9 和 gRNA 的核糖核蛋白 (RNP) 复合物。

注意：gRNA 应保存在冰上并分装使用，以防止重复冻融循环。

表 3. Cas9/gRNA RNP 复合物的制备

在室温下孵育 Cas9/gRNA RNP 混合物 10 分钟，然后添加 D0 培养基，每孔总共 120 µl（例如，对于 6 孔，这是 680 µl D0，总体积为 720 µl）。
在步骤 B4 的孵育过程中，按照表 2 中的方法制备 Lipofectamine TM 2000 混合物，使每孔的最终体积为 200 µl。
结合 Cas9/gRNA 混合物和 Lipofectamine TM 2000，每孔最终体积为 320 µl（120 µl RNP + 200 µl Lipofectamine TM 2000），静置 20-30 分钟。
从细胞中取出培养基并更换为 680 µl 新鲜 D0 培养基。
以逐滴方式，向每个孔中加入 320 µl Cas9/Lipofectamine TM 2000 转染混合物。
在 37°C、5% CO 2下孵育 4 小时。
使用来自 A 的冻融病毒管（应包括所需的重组体），在冰上超声 3 次，每次 20 秒，间断 5 秒。
在 1.25 ml D0 培养基中制备 1/5 连续稀释的病毒，在每管之间更换尖端。从 1/25 稀释开始（图 2）。

图 2. 制备 1/5 连续稀释液以去除病毒。

冻融后取 50 µl 病毒原液，用于在 D0 培养基中进行 1/25 病毒稀释。取 250 µl 原液并加入另一个含有 1 ml D0 培养基的管中。继续直到制备了 6 个稀释液，最高可达 1/78125。

在转染后 4 小时从细胞中吸出培养基，并加入 1 ml 的每种病毒稀释液。
在 37°C、5% CO 2下孵育 1 小时。
将病毒替换为 2 ml 新鲜 D2 培养基（如果您想观察荧光，则使用不含酚红的 D2）并在 37°C、5% CO 2下孵育 48 小时。
可选：如果重组病毒设计中包含视觉标记，则可以通过显微镜检查具有更高稀释度的孔，以识别和计数具有标记的噬菌斑和具有亲本表型的噬菌斑，以评估所需重组的频率。

注意：如果在这个阶段看到足够多的带有所需标记的病毒，单轮选择可能就足够了，可以跳过步骤 B18-B21。

使用倒置显微镜寻找病毒感染的证据（细胞病变效应，CPE）。从感染最多到最少，确定 CPE 在单层中不均匀的第一口井（图 3）。通过上下大力吹打（必要时先刮擦）从该孔中收集细胞和上清液，然后转移到 2 ml 低温小瓶中。

可选：任何一侧的井都可以类似地收获并作为备用。

图 3. 细胞病变效应作为VACV 感染后 48 小时适当孔选择的指标。

在 Cas9 选择板上观察到的细胞病变效应，选择收获的孔用红色框表示。在这种情况下，选择的稀释度是 1/625，但这会因实验而异。右下方框架中的比例尺 = 300 µm。

冻融 3 次，超声 3 次，如上。
重复步骤 B1-B9，准备新的 Cas9/gRNA 转染 293A 细胞板。

注意：理想情况下，细胞应在第一轮选择中收获病毒的当天准备好进行转染。

使用步骤 B16 中收集的病毒在 1.25 ml D0 培养基中制备连续 5 倍稀释，从 1/25 稀释开始（图 2）。
在转染后 4 小时，去除培养基并用 1 ml 的每种病毒稀释液代替。
按照步骤 B13-B16 完成病毒的孵化和收获。

可选：如果最终病毒中有颜色或其他标记，并且在这些培养物中可见分离良好的所需表型噬菌斑，则可以直接进行步骤 C9 并收集单个噬菌斑的后代，而不是收获整个噬菌斑好。

在 -80°C 下冷冻库存直至可以使用。

注意：如果重组病毒在此阶段后没有充分富集，则可以进行第三轮选择。

继续进行 C 部分以鉴定和纯化重组体。

重组病毒的分离

在 2 级生物安全柜中执行所有工作。
将 BS-C-1 细胞铺在 2 ml D10 培养基中的 6 孔板中（每个待测试斑块 6 孔；见注 5）。
第二天，取2轮Cas9筛选后收集的病毒，如上超声3次。
在 1.2 ml D0 培养基中连续稀释收集的病毒 1/10。请参阅表 4 中列出的卷。

表 4. 1/10 病毒稀释液的制备

从细胞中取出培养基，并在每个孔中加入 1 ml 病毒原液。
在 37°C 下孵育板 1 小时，5% CO 2 。
1 小时后，吸出培养基并更换为 2 ml 4% CMC/D2（参见配方 6）。
在 37°C、5% CO 2下孵育 48 小时。
使用倒置显微镜定位斑块。如果所需的重组体具有荧光或其他可见标记，请使用适当的方法来识别包含该标记的噬菌斑。
使用 6 孔板底部的超细永久性标记标记所需斑块的位置。

斑块应从尽可能稀释的孔中取出，并应与其他斑块间隔良好。建议至少标记 10 个斑块。

将板返回到生物安全柜。
将移液管插入标记区域上方的孔中并吸取 10 µl，同时刮取以从斑块中收集病毒。通过这种方法收集的病毒在下文中称为“噬菌斑分离物”。
将噬菌斑分离物转移到含有 500 µl D10 培养基的 2 ml Sarstedt 管中。
对所有标记的斑块重复。
斑块可在 -80°C 下储存。
继续到 D 部分通过 PCR 筛选这些分离物（对于无标记重组是必需的），或者如果视觉标记允许识别带有重组病毒的斑块，则直接到 E 部分。

通过 PCR（无标记重组体）筛选噬菌斑分离物

板 BS-C-1 细胞在 96 孔板的孔中汇合（每个待测试斑块一个孔）（见注释 6）。
从 C 中的每个斑块分离物中取出 10-50 µl，并添加到 200 µl D2 培养基中。
从细胞中取出培养基并用稀释的病毒代替。
在 37°C、5% CO 2下孵育板 3 天。
在显微镜下检查细胞是否存在 CPE 和/或标记物的表达。
用 CPE 从孔中取出培养基，用 150 µl PBS 洗涤，不要干扰细胞。
通过将 10 µg/ml 蛋白酶 K（Invitrogen）在 100 µl 1× ThermoPol ®缓冲液（New England Biolabs）中加入到每个孔中并在室温下孵育 5 分钟来裂解细胞。
在 -80°C 下冷冻板，然后在室温下解冻。
使用 56°C 加热块加热样品 20 分钟。
使用加热块在 85°C 下加热样品 10 分钟以灭活蛋白酶 K。

注意：样品必须在 85°C 下整整 10 分钟。

取每个样品 2 µl 进行 PCR。
设计引物以区分重组病毒和亲本病毒（参见图 4 中的示例）。

可选：在重组质粒设计过程中加入新的限制性位点，以帮助鉴定与亲本病毒非常相似的重组体。

图 4. 通过 PCR 确认重组病毒的身份。

A. 检查重组事件。B. 设计正向 (FW) 和反向 (REV) 引物以区分野生型和重组病毒。C. 筛选单个噬菌斑分离物和最终培养物以检查野生型 (WT) 病毒。选择一种策略来明确区分亲本和重组病毒。在这个例子中，只扩增外源 DNA 的第二个引物对可能是有价值的。

制备 PCR 混合物如下（表 5）：

表 5. PCR 主混合物的制备

使用设置为适合扩增条件的热循环仪执行 PCR。

注意：在病毒筛选之前根据您的特定引物和模板大小优化热循环条件。

使用 SYBR TM Safe 染色在 1-2% UltraPure TM琼脂糖凝胶上运行 10 µl 每个样品和 2 µl 6x Loading 染料，以检查 DNA 扩增。
可选：如果标记筛选或 PCR 后的噬菌斑仅显示所需病毒，或者如果对基因组的编辑太小而无法通过一组差异化的 PCR 引物检测到，则可以对包含基因组编辑区域的 PCR 产物进行测序进一步验证或识别感兴趣的斑块。
继续 E 部分以纯化重组病毒。

进一步的噬菌斑纯化以获得重组病毒种子储备

在 2 级生物安全柜中执行所有工作。
种子 BS-C-1 细胞在 6 孔板中汇合（每个待纯化的斑块分离物 6 孔）。
在 1.2 ml D0 培养基中连续稀释斑块分离物，通过标记表达或在 D 部分中鉴定为含有所需重组体（表 4）。
从 BS-C-1 细胞中吸出培养基并加入 1 ml 的每种病毒稀释液。
在 37°C 下孵育板 1 小时，5% CO 2 。
取出培养基并更换为 2 ml 4% CMC/D2。
在 37°C、5% CO 2下孵育板 48-72 小时。
在显微镜下检查板的斑块形成。
将斑块分离物收集到 500 µl D10 培养基中，如 C 和冻融 3 次。

注意：如果使用无标记病毒，应通过 PCR 和/或测序确认每个噬菌斑分离物的身份。

重复步骤 E1-E9。每次重复都被认为是“一轮”的牙菌斑净化。
1. 如果在每一步挑选多个斑块，标签数值到跟踪谱系，即，如果使用从1菌斑分离株1第一轮，噬菌斑分离株3从2次从3轮，和斑块分离物4次圆形，标签可以读取“斑块挑1-3-4”等。
2. 通常，3 轮噬菌斑纯化足以使病毒原液被认为是纯的。然而，我们发现从选择后（C 部分）挑选的第一个噬菌斑中的病毒有时通过 PCR 完全没有亲本病毒，在这些情况下，一两轮额外的纯化可能就足够了。
推荐：对于无标记病毒，取 1-2 µl 最终纯化的病毒并添加到 96 孔板中的 BS-C-1 细胞中。培养 3 天并按上述方法提取 DNA（D 部分）。使用 PCR 检查任何污染的父病毒 (图 3C)。
该菌斑悬浮液可被视为种子原液，或者可以使用 100 µl 进行扩增以感染 25 cm 2细胞组织培养瓶，这些细胞是培养一般 VACV 原液的首选。允许像往常一样生长 3 天（37°C，5% CO 2 ）。

数据分析

本协议在制备重组病毒过程中产生和分析的数据都是定性的。我们的经验是，在选择步骤之后，应首先检测至少 10 个噬菌斑分离物或挑选物。如果需要排除故障，我们建议使用类似于我们原始研究中的实验，例如测试 Cas9/gRNA 是否会降低病毒感染细胞中的荧光、细胞病变效应或病毒滴度。在这些情况下，至少需要一个测试和一个对照 gRNA，至少需要三个重复（Gowripalan等人，2020）。我们使用单向或双向方差分析与 Tukey 的后检验在有两个以上条件的情况下进行成对比较。如果比较一个测试和一个控制 gRNA，t测试就足够了。在我们获得病毒频率估计值的原始研究中，使用显微镜对 100 个噬菌斑进行了分类。对于无标记系统，通过 PCR 和测序分析了 20-100 个噬菌斑（Gowripalan等，2020）。

笔记

gRNA 应包含与称为 cRNA 的基因靶标互补的 20 bp 序列，然后是常见的 tracrRNA 序列（76 个碱基，5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC-3'），共 96 个碱基。可以使用在线平台设计或验证 cRNA，例如“ CRISPR -Cas9 guide RNA design checker”（Integrated DNA Technologies）。
通过重组设计用于工程化 VACV 的质粒的设计已经发表，并且通常遵循一般分子生物学原理（Broder 和 Earl，1997 年；Wong等人，2011 年；Marzook 和 Newsome，2019 年）。例如，重组臂应为 500 bp 或更大，理想情况下 GC 含量应在 40% 到 60% 之间，启动子应适合在您的上下文中表达。质粒可以是无标记的或包含用于观察的标记。这包括荧光团表达或显色模型，例如 β-半乳糖苷酶系统。胸苷激酶基因 (J13R) 是常用的重组位点。我们使用 NucleoSpin Plasmid Mini Kit (Machery-Nagel) 制备质粒。
选择 293A 细胞进行这项工作是因为它们支持 VACV 复制并且可以高效转染。其他 HEK293 克隆也适用。当使用不在 HEK293 细胞中生长的痘病毒时，应选择支持病毒复制和高转染效率的细胞系。Cas9 对病毒生长的抑制可以通过 a) 靶向重组 VACV 中的荧光基因并读出减少的荧光或 b) 如果仅存在非重组病毒，则寻找减少的 CPE 和病毒产生来测试和优化（Gowripalan等人., 2020)。
一旦在您的实验中确定了病毒滴度的估计值，您可以使用更少的病毒稀释液，即，代替 6 次连续稀释，3 次可能足以在至少一个孔中获得分离良好的病毒噬菌斑。
我们在此步骤中使用 BS-C-1 细胞，因为它们是接触抑制良好的大细胞，这使得它们非常适合从斑块中识别和收集病毒。
在 96 孔板中培养病毒分离物的微型培养物以生成 PCR 模板，因为我们尝试从病毒基因组直接从噬菌斑分离物中进行 PCR 的经验是不可靠的。这可能在某些情况下发生，因为没有收集到足够的病毒，但在其他情况下可能是由于培养基中的污染物。此步骤增加了两天，但这段时间被筛选出不生长的噬菌斑分离物的能力以及后续 PCR 的更高可靠性所抵消。结果，提高了整体效率。

食谱

D0媒体

500 毫升 Dulbecco's Modified Eagle's 培养基 - 高葡萄糖

10 mM L-谷氨酰胺

D2媒体

500 毫升 Dulbecco's Modified Eagle's 培养基 - 高葡萄糖

10 mM L-谷氨酰胺

2% (v/v) 热灭活 FBS

D2 培养基 – 无酚红

500 毫升 Dulbecco's Modified Eagle's 培养基 - 高葡萄糖，不含谷氨酰胺，不含酚红

10 mM L-谷氨酰胺

2% (v/v) 热灭活 FBS

D10 媒体

500 毫升 Dulbecco's Modified Eagle's 培养基 - 高葡萄糖

10 mM L-谷氨酰胺

10% (v/v) 热灭活 FBS

D10 培养基 – 无酚红

500 毫升 Dulbecco's Modified Eagle's 培养基 - 高葡萄糖，不含谷氨酰胺，不含酚红

10 mM L-谷氨酰胺

10% (v/v) 热灭活 FBS

4% CMC/D2

2克CMC

50 毫升 PBS

450 ml D2 培养基（或 D2 培养基 - 如果观察荧光则无酚红）

将 2 g CMC 与 50 ml PBS 和高压釜混合。

用适当的 D2 培养基加满 500 毫升。

致谢

我们感谢莎拉克罗夫特对手稿的有益评论。这项工作由 NHMRC 的赠款和奖学金资助：APP 1104329、APP1084283 和 APP1126599 以及 ARC:DP190101325。之前已经描述了导致该协议的原始研究（Gowripalan等，2020）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

Broder, CC 和 Earl, PL (1997)。重组痘苗病毒的设计与构建。分子生物学方法62：173-197。
Gowripalan, A.、Smith, S.、Stefanovic, T. 和 Tscharke, DC（2020 年）。使用 CRISPR/Cas9 作为选择工具的快速痘病毒工程。公共生物学3（1）：643。
King, MW 和 Munger, J.（2019 年）。使用 CRISPR/Cas9 系统编辑人类巨细胞病毒基因组。病毒学529：186-194。
Marzook, NB 和 Newsome, TP (2019)。表达荧光蛋白的重组痘苗病毒的构建和分离。分子生物学方法2023：73-92。
Russell, TA、Stefanovic, T. 和 Tscharke, DC（2015 年）。通过感染转染方法改造单纯疱疹病毒，包括 CRISPR/Cas9 核酸酶靶向重组位点。J Virol 方法213：18-25。
Smith, GL 和 Moss, B. (1983)。传染性痘病毒载体具有至少 25 000 个外源 DNA 碱基对的容量。基因25(1)：21-28。
Wong, YC, Lin, LC, Melo-Silva, CR, Smith, SA 和 Tscharke, DC (2011)。使用紧凑型 GFP-杀稻瘟素抗性融合基因进行工程重组痘病毒的选择。病毒学杂志171(1): 295-298。
Yuen, KS, Chan, CP, Wong, NM, Ho, CH, Ho, TH, Lei, T., Deng, W., Tsao, SW, Chen, H., Kok, KH, et al . (2015)。CRISPR/Cas9 介导的人类细胞中 Epstein-Barr 病毒的基因组编辑。 J Gen Virol 96（第 3 篇）：626-636。