材料和试剂

A. 动物

8 到 10 周大的 BALB/c 雌性小鼠（Charles River，028 品系）

B. 屋尘螨的制备和管理

1. 1.5 mL Eppendorf 聚丙烯管，带锁帽（Fisher Scientific ，目录号： 05-402-25）

2. 2 00μL移液器（Millipore Sigma，Eppendorf ，目录号： Z740441 ）

3. 200μL移液器过滤器吸头（Fisher Scientific ，目录号： 05-413-952 ）

4. 异氟醚（VetOne ，目录号： 502017）

C. 肺解剖、灌注和膨胀

1. 70％乙醇（Fisher Scientific ，目录号： NC9663244）

2. 喷雾瓶（Fisher Scientific ，目录号： 02-991-721）

3. 50 mL注射器（Fisher Scientific ，目录号： 14-817-57）

4. 蝴蝶针，27 G（Fisher Scientific ，目录号： 02-664）

5. 铝箔片（Fisher Scientific ，目录号： 01-213-106）

6. 聚苯乙烯泡沫塑料垫（例如，聚苯乙烯泡沫塑料盒的盖子，用作解剖垫）

7. 21 G 1”针（用作针）（Fisher Scientific ，目录号： 14-840-92）

8. C折纸巾

9. 丝绸手术缝合线（Fine Science Tools ，目录号： 18020-01）

10. 5 mL注射器（Fisher Scientific ，目录号： 14-829-45）

11. 20 G 0.5”钝针/套管（Sai Infusion ，目录号： B20-50）

12. Falcon 50 mL锥形管（Fisher Scientific ，目录号： 14-432-22）

13. Falcon 15 mL锥形管（Fisher Scientific ，目录号： 14-959-53A）

14. 冰

15. 90毫米培养皿（Fisher Scientific ，目录号： 07-202-028）

16. 水浴（Fisher Scientific ，目录号： 07-202-155）

17. 10％中性缓冲福尔马林（ Fisher Scientific ，目录号： 22-026-213）

18. 实验室标记（Fisher Scientific ，目录号： 13-379-4）

D. 组织处理和染色

1. 90 mm 培养皿（Fisher Scientific，目录号：07-202-028）

2. 7.5 mL 移液管（Fisher，目录号：13-711-47）

3. Falcon 15 mL锥形管（Fisher Scientific，目录号：14-959-53A）

4. 最佳切削温度（OCT）化合物（Sakura，目录号：4583）

5. 25 mm × 20 mm × 5 mm 样品低温模具（Fisher Scientfic ，目录号： NC9643511）

6. 活检组织盒（Sakura ，目录号： 4154-01）

7. 甲醇洗瓶（ × 4）（Fisher Scientific ，目录号： 03-409-11H）

8. Superfrost+显微镜载玻片（25/75/1 mm）（Fisher Scientific ，目录号： 12-550-15）

9. 玻璃盖玻片（24 × 60-1）（Fisher Scientific ，目录号： 12-545-MP）

10. 存储盒（Fisher Scientific ，目录号： 14-372-86）

11. ImmEdge 疏水笔（Vector Labs ，目录号： H-4000）

12. 1.5 mL Eppendorf 聚丙烯管，带锁帽（Fisher Scientific ，目录号： 05-402-25）

13. 241 × 241 × 20 mm 生物测定皿（Thermo Scientific ，目录号： 240845），带有四个 5 mL 移液器（Thermo Scientific ，目录号： 170373N），其尺寸被修整为水平安装在培养皿内部，带有两组两个移液器放置 50 毫米，并用透明胶带作为滑动支撑，并用湿纸巾衬里（如图 7C 所示）。用铝箔盖住黑暗孵化。

14. 铝箔片（Fisher Scientific ，目录号： 01-213-106）

15. 抗体和染料（详见表 1）

DAPI（细胞核）（Invitrogen，目录号：D1306）

酰肼A488（弹性蛋白）（Invitrogen，目录号：A10436）

小鼠α- SMA Cy3（SMC和新内膜）（Sigma，目录号：C6198）

亚美尼亚仓鼠α -CD31（内皮）（Bio-Rad，目录号：MCA1370Z）

山羊α-亚美尼亚仓鼠A647（Invitrogen，目录号：A-21451）

16. Prolong Gold 固定安装介质（Thermo Fisher ，目录号： P36930）

解决方案

1. 10 ×磷酸盐缓冲盐水（PBS），在蒸馏水（dH ₂O）中稀释至1 × PBS（Quality Biological，目录号： 119-069-101）。在室温 (RT) 下储存，并在 12 个月内使用（参见食谱）

2. 屋尘螨（HDM）（Stallergenes Greer，目录号： XPB70D3A25）。在 -20 °C 下以 120 µL 等分试样储存在 PBS 中，并在 12 个月内使用（参见食谱）

3. PBS 中的肝素/NaCl。储存于4 °C，并在3 个月内使用（参见食谱）

NaCl（Millipore Sigma目录号： S9888-500G）

肝素（Millipore Sigma，目录号： H3393 ）

4. PBS中的2％低熔点（LMP）琼脂糖（ Fisher Scientific，目录号： 16-520-050）。储存于 4 °C，并在3 个月内使用（参见食谱）

5. 16％多聚甲醛（PFA），在PBS中稀释至4％PFA（ Electron Microscopy Sciences，目录号： 15170。将16％PFA在室温下储存，并在12个月内使用。将4％PFA溶液保持在冰上，并在同一天使用（见食谱）

6. PBS中的30％蔗糖（ Milipore Sigma，目录号： S0389）。储存于 4 °C，并在 1 个月内使用（参见食谱）

7. 甲醇系列，用 dH ₂O 稀释至所需浓度（霍尼韦尔，目录号： BB233-4）。在室温下将稀释液储存在洗瓶中，并在 1 个月内使用（参见食谱）

8. PBST（0.1% Tween 20 in PBS）（ Millipore Sigma，目录号： 9005-64-5）。储存在 RT，并在 1 个月内使用（见食谱）

9. 预块。储存于4 °C，并在 24 小时内使用（参见食谱）

Triton X-100（Millipore Sigma，目录号： T8787）

山羊血清（Bio-Rad，目录号： C07SA）

BSA（Millipore Sigma，目录号： A2153）

设备

A. 屋尘螨的制备和管理

1. 麻醉诱导室（Harvard Apparatus ，目录号： 75-2029）

2. 空气过滤罐（Harvard Apparatus ，目录号： 60-0979）

3. 氧气罐，E 25cf（Praxair ，目录号： OX 2.6MC-E）

4. 异氟醚麻醉机（Fisher Scientific ，目录号： 50-154-0189）

B. 肺解剖、灌注和膨胀

1. 钝尖弯曲锯齿虹膜钳（Fine Science Tools，目录号： 11370-31）

2. 尖头弯曲锯齿钳（Fine Science Tools，目录号： 11270-20）

3. 解剖剪刀（Fine Science Tools，目录号： 14558-11）

C. 组织处理和染色

1. 钝尖弯曲锯齿虹膜钳（Fine Science Tools，目录号： 11370-31）

2. 解剖剪刀（Fine Science Tools，目录号： 14558-11）

3. 低温恒温器（徕卡，型号： CM3050S）

4. Vibratome（徕卡，型号： VT1000 S）

5. 湿室（自制：“材料和试剂”中的组装说明，D 部分“组织处理和染色”，第 13 点和图 7C）

软件

1. 禅蓝或禅黑（卡尔蔡司显微镜）

2. 斐济/ImageJ ( Imagej.net )

3. 谷歌表格 ( google.com )

4. Excel（微软）

5. R 与 R Studio ( R-project.org ; rstudio.com )

6. ggplot2 ( ggplot2.tidyverse.org )

程序

A. 动物

使用 8 至 10 周大的 BALB/c 雌性小鼠（Charles River，028 株）产生标准的 HDM 血管重塑时间进程。该协议已在多种基因型、年龄和体重的成年雄性和成年雌性小鼠（>10 周龄）以及多名实验室人员中进行了测试和验证。没有注意到每种情况下血管重塑的程度或速率存在一致的差异。在开始大规模实验之前，我们建议在实验室的特定实验装置中确认动脉重塑的时间线（使用相同遗传背景的小鼠、相同的实验室人员、相同的 HDM 批次等，这些将用于更大的实验) 与少量动物（每个终点 2-3 只）。生成动脉重塑时间过程（如图 2B 所示）和每个时间点的内侧厚度和新内膜病变定量图（如图 2C 所示）将允许精确分期血管重塑窗口，为每个实验室的特定条件量身定制和实验题。

B. 屋尘螨准备和鼻内给药

1. HDM 准备

a. 用无菌 PBS 将 Stallergenes Greer (XPB70D3A25) 中的冻干屋尘螨提取物稀释至每 120 μL 50 μg Derp1 蛋白，用于 4 ×库存浓度。

b. 将 HDM 库存分成 120 µL 等分试样，分装在 1.5 mL 带锁盖的 Eppendorf 管中，并储存在 -20°C。

c. 在计划使用的当天解冻等分试样，并添加 350 μL 无菌 PBS 以达到最终的 470 μl工作溶液，足以用于 9 剂。

提示： _

i) 原液解冻和稀释后，不要重新冷冻等分试样。多余的尘螨溶液可在 4°C 下储存并使用长达 48 小时。

ii) 由于 HDM 批次的 Derp1 浓度和总蛋白质浓度各不相同，因此建议从单个批次中为整个实验准备足够的 HDM 库存。

2. HDM 鼻内给药

a. 在麻醉诱导室中用异氟醚吸入麻醉动物（2.5% 异氟醚在每分钟 2 升 100% 氧气中雾化）。

提示： _

i) 一次最多可以麻醉 5 只动物。

ii) 当感应室轻轻倾斜到一侧时动物不再反应时，动物被充分麻醉，但保持接近正常的呼吸频率，在异氟醚中大约 45 秒。避免重度或长时间麻醉，因为这会抑制呼吸，并损害 HDM 吸入。

iii) 由于该方案涉及为期数周的每日麻醉，研究人员可能希望包括建议的“无 HDM”对照（参见下面的步骤g ，在相同的频率和麻醉下施用等量的无菌 PBS HDM 暴露动物中的方案）和额外的“无麻醉”对照（动物从不麻醉，既不接受 PBS 也不接受 HDM）。对于我们评估的所有参数，包括 RVSP 和动脉重塑，我们发现“无 HDM”和“无麻醉”对照之间没有差异，这表明重复麻醉不是这些过程中的一个因素。

b. 在装有新鲜一次性吸头的 200 μL 移液器中绘制 50 μL 的 HDM 工作溶液（5 μg Derp1 蛋白）。

c. 将一只老鼠从麻醉室中取出，将其脖子后面松散的毛皮擦掉，然后将老鼠的鼻子朝上，腹部朝向研究人员。

d. 将 HDM 工作溶液的单个液滴（每个液滴的体积约为 10 μL）涂抹在一个鼻孔的表面，让镇静的小鼠在下一个液滴给药之前在每个液滴中呼吸，如图 3A -3 B所示。

提示：避免应用大液滴或将液滴集中在鼠标的鼻子上（而不是放在单个的右鼻孔或左鼻孔上），以防止溶液通过人中流入口腔，如图 3C 所示。

e. 50 μl HDM 工作溶液后，将麻醉小鼠仰卧在其家笼中，使其从麻醉中苏醒。动物应在 20-30 秒内正常移动笼子。

f. 连续 5 天每天对所有动物重复，每周休息两天。

g. 通过 200 μL 移液器和一次性尖端管理 50 μL 无菌 PBS，以相同的方式对“无 HDM”控制小鼠进行管理，并遵循与 HDM 动物相同的时间表。

h. 在笼子里的所有动物都清醒并表现正常后，将笼子放回架子上。

提示：根据所需的血管重塑阶段（图 2B），每周 5 天（例如，周一至周五）在每天大约相同的时间对动物进行给药 2 至 8 周。允许休息两天（例如周六和周日）很重要，因为连续服用超过 5 天的小鼠可能会出现外在的疾病迹象，最常见的是毛皱褶和嗜睡。动物按照“5 天休息 2 天”的时间表给药，没有表现出疾病的外在迹象，并且行为正常。在整个协议中，HDM 暴露“一周”是指这种模式，即每天暴露 5 天，然后是 2 天不暴露，重复指定的周数。

图 3. 溶解在 PBS 中的 HDM 提取物的鼻内给药。

HDM 溶液液滴放置在异氟醚麻醉小鼠 (A - B) 的鼻孔上。避免将液滴放在鼻子中央 (C)，因为溶液可能会通过人中流入口腔。

C. 分期药理学调制

在这种 PH 小鼠模型中观察到的动脉重塑的精确且可重复的时间允许在动脉血管重塑的离散阶段进行分阶段的药物调节：内侧增厚（0-2 周 HDM）、新内膜建立（2-4 周 HDM）、新内膜扩张（ 4-6 周 HDM）和新内膜回归测试（6-8 周 HDM），如图 4 中的示意图所示。虽然分阶段药理学试验的精确实验设计将取决于相关药物，但药物的模式交付、药物药代动力学以及在实验中要检查哪些重塑阶段，以下一般指南应有助于设计试验。

1. 在整个药物或载体给药期间，每天（5 天，2 天休息）鼻内 HDM（或 PBS）给药。

2. 实验动物：在研究人员质疑药物效果的 2 周重塑窗口期间，根据药物特异性药代动力学，将所需药物溶解在适当的载体溶液中，并以适当的时间间隔给药。

对照动物：按照与实验动物相同的给药技术和时间表单独使用载体。

提示：这种分阶段药理学方法可以使用多种给药方式，并且必须确定每种给药方式的最佳给药方式（静脉注射、腹腔注射、渗透泵输注、口服管饲法、处理过的水）和给药频率。化合物，理想情况下基于先前在小鼠中的体内研究。

3. 在两周药物/车辆暴露窗口完成的当天收获动物。

4. 完整的血流动力学测量、组织收集和血管重塑定量（详细方案如下）。这种分阶段的药理学调节允许定量比较药物治疗动物和载体对照之间的重塑参数。

图 4. 肺动脉重塑离散窗口期间的分期药物治疗允许定量比较药物对动脉重塑特定阶段的影响。

在图 2 中定义的动脉重塑的每个阶段，通过适当的时间，可以用可管理的药物（例如，小分子药物、抗体、病毒载体、他莫昔芬或四环素以改变基因功能）调节特定的分子或感兴趣的途径。药物管理（ “治疗窗口”）。使用图 2 中提供的定量方法比较每个时间点的药物与载体治疗组，可以识别药物对动脉重塑过程中精确步骤的影响。

D. 肺动脉高压的血流动力学评估

（Ma et al. ，2016），通过右心导管插入术和右心室收缩压 (RVSP) 测量小鼠来评估肺动脉高压的血流动力学证据 ADDIN EN.CITE Ma2016295(Ma, 2016)29529517Ma, Z.Mao, L.Rajagopal, S.Department of Medicine, Duke University Medical Center. Department of Medicine, Duke University Medical Center; sudarshan.rajagopal@dm.duke.edu.Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial HypertensionJ Vis ExpJ Vis Exp1102016/05/12AnimalsArterial Pressure*Disease Models, AnimalHemodynamicsHypertension, Pulmonary/*pathologyHypertrophy, Right Ventricular/*physiopathologyMiceRatsVentricular Dysfunction, RightVentricular Function, Right2016Apr 111940-087X (Electronic) 1940-087X (Linking)27167679https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27167679PMC494190610.3791/53335。在 HDM 模型中，在 HDM 给药 2 周后注意到 RVSP 显着增加，并且这种升高在 HDM 给药 8 周内保持（Steffes等人，2020）。

E. 组织收集和处理

1. 组织采集准备

a. 在解剖站附近放置一个水浴并将其预热至 45 °C 。

b. 在微波炉中融化制备好的 2% LMP 琼脂糖溶液，经常旋转直到琼脂糖颗粒完全溶解并且溶液澄清。

提示：小心不要通过过度煮沸来浓缩溶液。

c. 在水浴中将2% LMP 琼脂糖溶液平衡至 45 °C ，并保持在那里，为肺膨胀做准备。

d. 在冰上冷却肝素/氯化钠溶液。

e. 准备 4% PFA 溶液，分装成 50 mL 锥形管（每管 40 mL 4% PFA），并在冰上冷却。每个收集的心肺块需要40 m L。

f. 准备任何未用 4% PFA 固定的计划准备所需的收集管：

i. 石蜡切片：将 10 mL 的 10% 中性缓冲福尔马林分装到15 mL 锥形管中并在冰上冷却。每个收集的叶，需要 10毫升。

ii. RNA 或蛋白质收集：无菌无核酸酶 1.5 mL 试管，冰上冷藏。每个收集的叶需要一根管子。对于计划进行的任何下游实验，请遵循适当的 RNA 或蛋白质分离方案。

g. 用新鲜的铝箔覆盖聚苯乙烯泡沫塑料解剖板，并用实验室胶带固定箔。

h. 在解剖站方便的地方组装解剖工具和用品：一堆 c 折叠纸巾、喷雾瓶中的 70% 乙醇、锋利和钝的弯曲镊子、解剖剪刀、连接到 50 mL 注射器的蝴蝶针、连接到 5 mL 的钝套管注射器、缝合线、带有等分固定剂的冰桶和用于标记试管的实验室标记。

2. 解剖心脏、肺和气管的可视化

a. 在进行血流动力学评估后，在异氟醚麻醉下通过切断降主动脉对动物实施安乐死。

提示：如果不需要进行血流动力学测量，请通过施用二氧化碳（或首选任何经批准的方法）对动物实施安乐死。由于吸入麻醉剂、100% 氧气和二氧化碳会改变血管张力，为了定量评估血管重塑参数（详见下文“血管重塑量化”），所有要比较的动物都应以相同的方式实施安乐死。

b. 将安乐死的鼠标放在解剖板上的几张堆叠纸巾上，腹侧朝上，四肢横向延伸并用别针固定。

c. 用装有 70% 乙醇的喷雾瓶喷洒腹面，以润湿毛皮，并减少解剖过程中进入胸腔的脱落。

d. 用钝锯齿钳提起肋骨下方的皮肤，用解剖剪刀在皮肤上进行水平切割，露出腹膜。

e. 从原始切口到胸骨垂直切开皮肤，将皮肤拉向两侧，露出胸部和前腹部。

f. 用钝锯齿钳提起腹膜，再次水平切割，使腹部器官可视化。

g. 提起肝脏并将肝动脉和门静脉一分为二，作为肺灌注期间的流出物。

h. 抓住剑突，用镊子提起，用解剖剪刀在隔膜上做一个浅切口（注意避免无意中划伤肺部）。释放胸内负压，让肺塌陷。

i. 将腹侧肋骨从两侧的胸骨外侧切开约 0.5 厘米，以使心脏和肺部完全可视化（图 5A）。

图 5.肺灌注和膨胀。

在进行血流动力学评估和安乐死后，打开胸部以显露心脏和肺 (A)，将盐水缓慢注入心脏的右心室 (RV) (B) 以去除肺循环中的血液。为了用 LMP 琼脂糖给肺部充气，将腹侧喉咙的皮肤剖开以露出气管。在气管上做一个小切口，插入装有钝套管的 LMP 琼脂糖填充注射器 (C)，并在气管和套管周围收紧缝合线以形成密封 (C 中的蓝色箭头)。当叶尖是刚性的（C 中的白色箭头）时，认为充气完成。 D，灌注和琼脂糖膨胀后从胸部移除的心肺阻滞。

3. 肺灌注

a. 将 20 mL 的肝素/NaCl 溶液抽取到 50 mL 注射器中，连接 27 号蝶形针，并从管道中冲洗空气。

b. 将针头插入心脏的右心室（图 5B）并以每秒 <100 μl 的速度灌注，以清洗肺血管床中的血液 2-3 分钟。

细胞 从肺循环中冲洗出来时，肺部会完全变白；在肺动脉重塑的动物中，灌注的效果明显较差。

4. 肺膨胀

a. 使用钝钳和解剖剪刀，垂直切割颈部的腹侧皮肤，露出气管。

b. 剪下 4 英寸的缝合线，在气管下方用尖头弯曲钳在柄水平处系上花边，然后系成松散的手术结（稍后在气管内插管周围收紧）。

c. 在结水平上方的腹侧气管上做一个小切口，刚好足够宽以允许插入插管。

提示：如果要从单个肺叶制备 RNA 或蛋白质（参见下面的“组织固定和处理”和图 6），请在琼脂糖膨胀之前用缝合线结扎通向这些肺叶的主支气管。

d. 从 45 °C水浴中取出 2% LMP 琼脂糖瓶，将 3 mL 溶液吸入装有 20 号钝尖套管的 5 mL 注射器中。

提示：快速工作，使琼脂糖没有时间在套管内聚合。

e. 将套管插入气管切口并向下推进气管，直到套管尖端高于隆突水平约 3 毫米。

提示： _

i) 在将 2% LMP 琼脂糖溶液插入气管之前，先从套管尖端喷出少量，以确认 2% LMP 琼脂糖溶液仍然是液体。一旦缝合线在气管内插管周围收紧，更换插管就很困难。

ii) 如果 LMP 琼脂糖溶液在用于充气之前经常聚合，1) 将水浴的温度略微升高 (~2 °C )，或 2) 从填充的插管中喷出少量到纸巾上每 ~ 10 秒，从套管尖端喷出冷却的琼脂糖，并用注射器室中的温琼脂糖代替。

f. 拧紧手术结，在气管和套管之间形成牢固的密封，然后将熔化的 LMP 琼脂糖轻轻注入气管以使肺部膨胀（图 5C）。

g. 仔细监测肺膨胀情况，并在副叶远端僵硬时停止（图 5C - 5D ）。

提示：注意不要过度充气肺部，这会损害肺实质形态。

h. 取下套管并立即收紧气管结扎，以防止琼脂糖流出。

提示：如果立即用无菌 PBS 或水冲洗套管，可以多次重复使用，以去除残留的 LMP 琼脂糖。

i. 等到 LMP 琼脂糖凝固，大约 2-4 分钟，然后再继续解剖。

5. 去除心肺阻滞

a. 用解剖剪刀剪下并取出腹侧锁骨。

b. 使用钝锯齿钳，抓住肝水平上方的食道，轻轻向上拉，从胸腔提起心肺阻滞。

c. 夹住并解剖任何将心脏和肺组织与背胸壁结合到气管水平的粘连。

d. 切开结扎上方的气管，并在冰上的培养皿中用冷 PBS 短暂冲洗心肺块。

6. 组织固定和处理

注意：如果需要，可以从每只动物的心肺块制备多种组织制剂。图 6 显示了如何在多个制剂之间划分心肺阻滞的一个可能示例。除了保留一个肺叶用于回收大量 RNA 或蛋白质（参见上面的“肺膨胀”），准备石蜡切片、冷冻切片、振动切片，并将剩余的组织在甲醇中脱水，以便在 -20 °C 下长期储存。新鲜和甲醇脱水的心脏都可以被解剖以计算富尔顿指数（Ma et al., 2016） 。我们从未观察到同一动物体内不同肺叶之间重塑速度或程度的差异，并发现在多个制剂之间划分肺可以更有效地利用珍贵动物。

a. 如果需要石蜡切片，请在固定前取出一个裂片，并将其浸入准备好的 10% 中性缓冲福尔马林管中，在 RT 下 48 小时。然后，将其转移到活检组织盒中，在 70% 乙醇中洗涤，石蜡包埋，并按照标准协议进行切片。

提示：该组织适用于组织学染色（H&E、Movat 五色等）、免疫组织化学（Hofman 和 Taylor，2013）或 RNA 原位杂交方案，包括 RNAscope （Wang 等人，2012） 。

b. 将心肺块的所有剩余部分浸入准备好的冰冷 4% PFA 管中，并在 4 °C 下轻轻摇动固定 4 小时。

c. 在 PFA 固定后，将肺分成单独的叶，以进行所需的染色准备：

i. 通过将它们浸入 PBS 中的 30% 蔗糖中（在 15 m L Falcon 管中每叶 10 m L ），准备用于冷冻切片的裂片。在 4 °C 下孵育过夜，轻轻摇动。

ii. 将用于 vibratome 切片的裂片转移到冷 PBS 中，储存在 4 °C，并在 24 小时内切片。有关振动切片机切片的整体染色和深层组织成像的更多信息，请参见 Steffes等人。 (2020) 和 Gillich等人。（2020 年）。

iii. 通过甲醇系列（25%、50% 和 75% 甲醇在 diH _{2 O 中，各 30 分钟）对剩余的肺叶、气管和心脏进行脱水，然后转移到 100% 甲醇中，}在-20 °C 下长期储存密封良好的 50 mL 锥形管。储存在甲醇中的裂片可以根据需要进行再水化和切片，或作为整片制剂染色（Metzger等人，2008）。

图 6. 可以从单个动物的心肺阻滞制备多种组织制剂。

灌注后，单个叶的气道可以在琼脂糖膨胀之前结扎以提取 RNA 或蛋白质（左叶；连接用虚线表示）。用于石蜡切片的裂片在充气后取出，并用 10% 中性缓冲福尔马林（右尾叶）固定。所有其他准备工作（冷冻切片、振动切片、长期保存在甲醇中等）均在用 4% 多聚甲醛固定的组织上完成，随后分开进行单独处理。示意图说明了在六种不同准备之间划分心肺传导阻滞的一种可能计划。我们观察到同一只小鼠的不同肺叶之间的肺动脉重塑程度没有差异。

F. 冷冻切片和免疫组化面板突出显示与定量相关的血管隔室

1. 从蔗糖中取出裂片，在纸巾上短暂吸干。

2. 在充满 OCT 的低温模具中定位叶，并用 OCT 完全覆盖肺。

3. 在干冰床上的冷冻模具中冷冻肺。

4. 将块储存在-80 °C的密封袋中，直到准备好切片。

5. 使用低温恒温器切割 20 μm 部分。

6. 收集 Superfrost+ 玻璃显微镜载玻片上的切片。

7. 风干 10 分钟，并储存在 -80 °C的玻片盒中。

8. 要染色，解冻实验室工作台上的单个载玻片，让冷凝水完全蒸发。

9. 用疏水笔在部分周围绘制边界。

10. 在 PBST 中使用两次 5 分钟的洗涤去除 OCT。

提示：我们发现通过使用“池和尖端方法”（图 7）进行溶液孵育和洗涤，可以最大限度地减少对切片的损坏。

a. 使用一次性移液管将溶液直接汇集到水平载玻片上。（图 7A）。

b. 在实验室工作台上的潮湿室（图 7C）中在 RT 中孵育，在指定的时间长度内不加盖。

c. 通过将液体从幻灯片上倾倒到干纸巾上而不接触幻灯片表面 (图 7B), 去除解决方案。

图 7. 池和尖端染色方法可最大限度地减少对切片的损坏。

A. 用疏水笔在组织切片周围绘制屏障，然后将溶液直接轻轻地汇集在水平载玻片上，无需盖玻片。 B. 在所需的孵育期后，将溶液倒在干净的纸巾上，除去溶液。 C. 自制的湿室——由 241 × 241 × 20 mm 方形生物测定盘制成，带有 5 mL 一次性移液器，切成一定长度作为载玻片架，水饱和纸巾切成一定尺寸以保持大气湿润，并用箔纸覆盖避光 – 最多可容纳 14 张幻灯片。即使没有大体积洗涤或洗涤过程中搅动载玻片，染色也是有效的，并且切片损失或损坏是最小的。

11. 要阻塞部分，在潮湿室中的 RT 中将 ~300 μL新鲜制作的预块溶液池化 30 分钟至 4 小时

提示：应调整血清物种以匹配产生二抗的物种。

12. 通过尖端方法去除预块，并将在预块中稀释的一抗溶液稀释在水平幻灯片上。

13. 在 RT 避光的潮湿室中孵育过夜。

提示：表 1 中显示了一个简单的染色面板，它允许在血管重塑过程中显示多个重要的相关血管隔室，并有助于重塑定量测量（参见图 2B）。

14. 用 PBST 清洗载玻片 3 次，每次 5 分钟，使用池和尖端方法。

15. 应用稀释在水平幻灯片上的预块中稀释的二级抗体溶液。

16. 在避光的潮湿室中在 RT 中孵育 45 分钟。

17. 使用池和尖端方法用 PBST 清洗幻灯片 3 次，每次 5 分钟。

18. 盖玻片与坚固的水性封固剂（例如ProlongGold）和 60 mm 盖玻片。

尖端：

i) 在成像前至少让安装介质聚合 2 小时，以避免损坏组织切片。

ii) 盖片后 48 小时内的图像幻灯片，以获得最佳图像质量。

表 1. 突出主要容器隔间和图像重塑的染色面板。

G. 血管重塑量化

1. 让另一名实验室成员用随机标识符编码的不透明胶带遮盖载玻片标签，从而使研究人员盲目地进行图像收集和定量。

2. 使用共聚焦显微镜，以低倍率扫描肺切片，以识别直径在20 μm和 200 μm之间的动脉，以便进一步检查。

提示：首选横截面视图，因为它们简化了定量分析。如有必要，可以对纵向切割进行定量，但需要显着的组织厚度（或进入连续切片）来识别动脉的真实中心平面。

3. 一旦找到合适的动脉横截面，增加放大倍数（至 25-40 × ）

4. 收集包含内侧平滑肌层、新内膜病变和内皮细胞的最全面视图的高分辨率图像。

5. μ m 大小范围内的所有动脉的图像，无需选择重塑程度、在肺叶中的位置等。

提示：动脉与静脉可以通过位置和血管解剖来区分（图8）：

i) 发现动脉伴有气道，包含内外弹性层，将用酰肼标记（图 8A -8 B）。

ii) 静脉远离气道，并具有单个弹性层（图 8A -8 C）。

6. 使用图像分析软件（ Zen Blue、Zen Black 或 ImageJ）为每个容器获取两组正交测量值（图 2B）。测量应包括：

a. 外部血管直径（外部弹性层的外缘）。

b. 介质厚度（外弹力层内缘到内弹力层外缘）。对于两个正交测量轴中的每一个，将有两个介质厚度测量值。介质厚度报告为绝对测量值 ( μ m)。

c. 新内膜厚度（内弹力层内侧边缘到内皮边缘）。对于两个正交测量轴中的每一个，将有两个新内膜厚度测量值。新内膜厚度可以报告为绝对测量值或血管直径的百分比：将每个测量轴的两个新内膜测量值相加，除以血管直径，然后乘以 100。

7. 从每只小鼠至少 50 条动脉收集测量值，以确保对动脉进行广泛调查，并允许进行有意义的统计分析。

8. 将测量值记录到电子表格（GoogleSheets 或 Excel）中。

9. 在记录所有样本的测量值后对样本进行揭盲，并将每次测量的小鼠数量、药物治疗组和 HDM 暴露长度添加到电子表格中，以方便下游统计分析。

图 8. 动脉和静脉可以通过位置和弹性蛋白染色来区分。

A. 动脉靠近气道，而静脉远离气道。 B. 动脉有内部和外部弹性层，而静脉 (C) 只有一个弹性蛋白层。用酰肼染色显示弹性蛋白（绿色）； SMA 抗体染色突出显示的平滑肌细胞（红色）；用 DAPI（蓝色）染色的细胞核。箭头，弹性薄片。

数据分析

数据分析的详细讨论可以在与该协议相关的原始研究论文中找到（Steffes等人，2020）。统计分析可以在 Excel 或统计语言 R 中使用 R Studio 执行，就像我们在此处所做的那样。

1. 将 PBS 暴露的动物与 HDM 时间过程中的每个收集时间点（例如，PBS 与 2 周 HDM等）进行比较。这将确定在所研究的每个时间窗内哪些重塑事件（内侧增厚、新内膜建立或新内膜病变生长）发生显着变化。

2. 使用双向方差分析分析在每个时间点识别药物和车辆暴露动物之间的任何变化。

3. 使用绘图包 ggplot2（或等效绘图软件）创建散点图，显示内侧厚度和新内膜病变厚度的每血管定量，叠加箱线图和晶须图以及 R 中的 p 值，就像我们在图 2C 中所做的那样.

食谱

1. 1 ×磷酸盐缓冲盐水 (PBS)

用 900 mL 无菌 dH ₂O稀释 100 mL 的 10 × PBS

2. 屋尘螨解决方案 (HDM)

将冻干屋尘螨提取物稀释至 50 µg Derp1 蛋白/120 µL PBS

3. 肝素/NaCl

将 9 g NaCl 溶解在 1 L 的 PBS 中，然后加入 56 mg 肝素

4. 2% 低熔点 (LMP) 琼脂糖

在 200 mL 的 PBS 中加入 4 g LMP 琼脂糖。在微波炉中煮至溶液澄清

5. 4%多聚甲醛

在 30 mL 的 PBS 中溶解 10 mL 的 16% PFA

6. PBS 中 30% 的蔗糖

在 500 ml PBS 中加入 150 g 蔗糖，在微波炉中加热直至溶解。在应用于组织之前冷却至 4 °C

7. 甲醇系列

稀释 100% 甲醇用于分级组织脱水（25%、50%、75% 甲醇的 dH ₂O）

8. PBST

PBS 中 0.1% 吐温 20

在 500 mL 的 PBS 中溶解 0.5 mL 的 Tween 20。

9. 预块

0.3% 海卫 X-100

5% 山羊血清

PBS 中 1.5% BSA

通过将 1 mL 的 Triton X-100 添加到 9 mL 的 PBS 中，将 Triton X-100 稀释至 10% 的库存溶液。对于 10 mL 预块：在 15 mL 锥形管中，添加 300 μL的 10% Triton、500 μL血清、150 mg 牛血清白蛋白 (BSA)，并用 PBS 将体积增加到 10 mL。

致谢

这项工作得到了斯坦福大学儿科桥 K 计划和弗朗西斯家庭基金会、帕克 B.弗朗西斯 LCS 奖学金和美国心脏协会 16SDG30030006、斯坦福光谱儿童健康研究所种子资助、布拉沃家庭捐赠教师奖学金和Vera Moulton Wall 肺血管疾病研究中心向 MEK 提供资助该协议所依据的原始研究论文是 Steffes等人。（2020 年）。

利益争夺

没有一个作者有财务或非财务上的竞争利益。

伦理

所有动物实验均获得了斯坦福大学机构动物护理和使用委员会的 IRB 批准（APLAC 31869，于 2016 年 9 月 6 日首次批准，有效期至 2022 年 9 月 23 日。

参考

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