材料和试剂

1. CM-DCFH ₂-DA（Invitrogen Life Technologies/Molecular Probes，EUA），储存温度 -20°C

2. 高品质无水二甲亚砜 (DMSO)、二甲基甲酰胺 (DMF) 或 100% 乙醇、H ₂O ₂和有机盐（默克，巴西），储存于 15/30°C

3. 上样缓冲液，如简单生理缓冲液 (PBS)，4°C 冰箱保存

4. N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）（Sigma，目录号：A7250），储存在4°C冰箱中

5. 丁硫氨酸亚砜亚胺（BSO）（Sigma，目录号：B2515），储存在4°C冰箱中

6. HUVEC 获自美国典型培养物保藏中心，在补充有 10% 胎牛血清、青霉素和链霉素抗生素的 RPMI 1640 培养基中培养。实验在 37°C 和 95% 空气和 5% CO ₂的潮湿气氛中进行。

7. PBS（见食谱）

8. 磷酸盐缓冲液（见配方），储存在 4°C 冰箱中

设备

1. 分光光度计型号 U-2010（Software UV Solutions，1.1 版，日本日立）

2. 96 孔微孔板（黑壁，透明底部；康宁，目录号：CLS3829）

软件

1. GraphPad Prism 5.01 版（或更高版本）（GraphPad Software Inc.）

程序

1. 从贴壁或悬浮细胞中去除生长培养基，然后用 PBS 1× 洗涤两次。使用前平衡至 37°C。1× Buffer 可以冷冻保存或在 4°C 下保存以备将来使用。

2. 在测定之前和期间，培养基不应含有酚红或其他比色染料。CM-DCFH ₂-DA 只能溶解在无水 DMSO、DMF 或乙醇 (100%) 中。工作溶液必须在避光小瓶中新鲜制备，并在使用前密闭。

3. 对于经常使用的标准测定，将 50 mg CM-DCFH ₂-DA（MW 487.3）溶解在 2.565 ml DMSO 或无水乙醇（40 mM）中。等分试样可在 -20°C 下保存至少 3 个月。用 39.9 ml 预热的培养基（最终工作浓度 100 μM）稀释 100 μl 原液，涡旋并加入细胞培养孔中。

4. CM-DCFH ₂-DA 应以尽可能低的浓度使用，以减少潜在的人工制品，例如不完全水解和水解副产物的污染。每个应用的理想工作溶液必须凭经验确定，以获得良好的信噪比，例如，通过 2-3 进一步 2 倍稀释标准浓度。

5. 在细胞培养箱 (37°C) 中以高相对湿度 (95%) 和受控水平的二氧化碳 (5%) 在细胞培养箱中培养超低簇板（特定黑色涂层 96 孔培养皿）中的细胞黑暗。通常，加载时间为 2 小时就足够了。此外，如果使用多孔板和自动读板器，则必须估计每个孔的细胞总量、细胞密度和/或总蛋白质水平，以实现标准化并确保最佳细胞密度和活力.

6. 用细胞缓冲液仔细清洗，然后孵育，让细胞酯酶有一个短暂的恢复期来水解乙酸酯基团。让染料对氧化作出反应。

7. 建议的阳性缓冲液对照是 H ₂O ₂或终浓度为 50 μM 的叔丁基过氧化氢 (TBHP)。

8. 样品的氧化还原状态可以通过细胞中 DCF 的荧光增加来测量，当样品在 485 nm 激发时，在 530 nm 处测量。

9. 重要的是，没有 DCFH ₂-DA 保持在加载缓冲液中的阴性对照的荧光需要确定为背景。

10. 在大多数健康细胞中，氧自由基被细胞酶和/或天然抗氧化剂消除，导致荧光水平通常较低。

11. 在开始时间过程测量之前，以合适的时间间隔启动荧光板读取器。描述板尺寸情况并选择合适的滤光片组来激发/检测荧光。

12. 读取每个板上的荧光并打印板数据或以数字形式保存。

13. 平均每个实验条件的三次重复的解释，并计算每个平均值的百分比变异系数 (CV)。

14. 从等效实验条件下处理的条件中减去无细胞处理控制的荧光平均值，以确定细胞内 DCF 荧光。计算每个一式三份的平均荧光和 CV，确认一式三份是一致的。

数据分析

使用 DCFH ₂-DA/DCFH ₂系统测量 RONS 的技术有一定的弱点，因为所有的分析都容易出现大量由样品制备或分析方法本身造成的伪影。用于溶解测试化合物的有机溶剂，例如 DMSO 或乙醇，是所有测试都有的另一个困难。DMSO 和乙醇是强大的 •OH 清除剂，尽管它们在测定中被高度稀释并且主要是细胞外的，但可能会导致对产生的 RONS 量的低估。因此，适当的控制非常重要，因为培养基中发生的各种反应或处理可能导致氧化应激的细胞培养物都会改变结果（Tarpey等，2004）。生物系统中的 RONS 测量不提供 RONS 水平的绝对量化，如下所述（图 3）。

图 3. 细胞内通路和 DCFH ₂与 RONS 反应速率的示意图。

DCFH ₂已被用作巨噬细胞和中性粒细胞呼吸爆发的指标，以及估计响应于其他丰富细胞类型中的几种刺激的氧化剂的产生。然而，在反应性物质氧化 DCFH ₂_的情况下检测 DCF可能指示 •OH、ONOO ^–，但 O ₂• ^-和单独的H ₂O ₂不是。

笔记

1. DCFH ₂与 O ₂_的反应性很小或没有反应性• ^–

a. O ₂• ^–由黄嘌呤/XO 系统产生，会被超氧化物歧化酶迅速抑制，从而阻止通过氧化DCFH ₂_进行检测（LeBel等，1992）。

b. 由 O ₂• ^–钾诱导的细胞色素c 的减少不会增加 DCF 荧光，表明 O ₂• ^–不会直接氧化 DCFH ₂(Zhu et al ., 1994)。

c. 持续提供 O ₂• ^–的稳态辐射分解也不会导致 DCFH ₂显着氧化（Zhu等人，1994 年；Wrona等人，2005 年）。

2. H ₂O ₂不能直接氧化 DCFH ₂

a. 在不存在亚铁的情况下，H ₂O ₂依赖的 DCFH ₂氧化为 DCF 缓慢发生，如果有的话。然而，在含有血红素、过氧化物酶、细胞色素c或其他氧化还原活性金属离子等含血红素物质的情况下，DCF 的形成会大大增强（Cathcart等人，1984 年；Kalyanaraman等人，2012 年）。

b. 过氧化物酶能够在不存在 H ₂O ₂的情况下诱导 DCFH ₂氧化（Rota等，1999）。因此，在决定 DCF 形成和细胞荧光的速率方面，细胞过氧化物酶或血红素活性的增加可能与 H ₂O ₂同等重要，如果不是更重要的话（Ohashi等，2002）。

c. 增强的细胞内铁运输，例如导致内皮细胞铁摄取增加的转铁蛋白受体，通常会促进 H ₂O ₂依赖性 DCF 荧光（Tampo等，2003）。

3. •OH 自由基氧化 DCFH ₂

a. 对于 Fe ²⁺/H ₂O ₂系统（芬顿反应），•OH 清除剂如 DMSO、乙醇、甘露醇和 Tris 仅部分抑制 DCFH ₂氧化（LeBel等，1992）。

b. 游离的•OH 寿命很短（在典型生理环境中<20 ms），不参与DCFH ₂的氧化，而位点特异性•OH 通过DCFH ₂羧基与Fe ²⁺结合形成可以氧化DCFH ₂。因此，与 DCFH ₂氧化成正比的Fe ²⁺/H ₂O ₂诱导的 •OH 生成（由水杨酸的位点特异性氧化为 2,3-二羟基苯甲酸表明）可以被 DMSO 和甘露醇抑制（朱等人，1994）。

c. DMSO 已被观察到在几个细胞或细胞系中抑制 DCFH ₂氧化，其中 •OH 也被证明可以高效氧化 DCFH ₂（Wrona等，2005）。

4. DCFH ₂作为 ONOO 的极好指标^——在活细胞中的形成

a. ONOO ^–介导的 DCFH ₂氧化比 H ₂O ₂、NO 或 O ₂• ^–氧化快得多、效率高得多。ONOO ^–与 DCFH ₂反应2 分钟后达到稳态，而 H ₂O ₂和 NO 继续氧化 DCFH ₂至少 10 分钟（Possel等，1997）。

b. 体外DCFH氧化₂由ONOO介导的^-未被•OH清除剂抑制，并且是不依赖于金属离子催化的反应。DCFH ₂-DA 不易被 ONOO ^–氧化，而 ONOO ^–可以很容易地氧化 DCFH ₂(Crow, 1997)。•OH 清除剂甘露醇和DMSO 缺乏抑制作用表明ONOO ^–与DCFH ₂的氧化反应不是基于游离H ₂O ₂的形成，而游离H ₂O ₂由两个•OH 自由基的组合迅速形成。

c. 有效的 ONOO ^–介导的 DCFH ₂氧化不需要金属催化。该反应似乎直接由 ONOO ^–介导，不需要其他自由基的二次形成（Kooy等，1997）。

d. HKGreen-1具有通过芳醚键连接到一个DCF部分和用于检测ONOO提供一个高度选择性荧光探针酮单元^-在原代培养的神经元细胞（杨等人，2006）。

食谱

1. PBS

10×缓冲液。通过在去离子水中稀释 10× 缓冲液以制备 100 毫升 1× 缓冲液来制备 1× 缓冲液。将 10 ml 10× Buffer 与 90 ml 去离子水混合并轻轻混合。将此解决方案标记为“ 1× Buffer ” 。

2. 用于裂解细胞的磷酸盐缓冲液 (10 mM, pH 7.4)

5 毫升冷无水甲醇 (v/v)

10 微升 Triton X100

5 毫升缓冲液 A + B

A: 9.5 ml 200 mM KH ₂PO ₄

B：40.5 ml 200 mM K ₂HPO ₄

致谢

DS 根据赠款协议 n 获得欧盟地平线 2020 的项目相关支持。634413（EPoS，欧洲脂肪性肝炎项目）和 777377（LITMUS，肝脏对脂肪性肝炎标志物效用的调查），并由德国研究基金会合作研究项目授予 DFG CRC 1066/B3 和 CRC 1292/B8。

利益争夺

作者声明他们没有竞争利益。

参考

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