材料和试剂

A. 动物

新生大鼠 [产后天 (P)3 和 P16 之间]

B. 分离部分

1. 用于转移半头和解剖耳囊的 60 毫米和 35 毫米培养皿

2. 用于抽取和过滤 L-15/HEPES/HEPES 溶液的10 m L注射器

3. 0.22 μ m aPES膜注射器过滤器（例如， Celltreat，目录号： 229747 ）

4. 用于腹腔注射安乐死溶液的胰岛素注射器

5. Leibovitz 培养基（Sigma-Aldrich，目录号：L4386）

6. 装满冰块的保温桶

7. 医用级氧气溶解成溶液（有足够的调节器和管道）。 L-15/HEPES 溶液没有碳酸盐缓冲，并在 O ₂进入溶液时保持稳定的 pH 值。

8. 基于戊巴比妥的安乐死溶液（例如，Fatal Plus。50-60 mg/kg 剂量）

9. 胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T1426）

10. 胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C5138）

11. L-15/HEPES 溶液是补充有 10 mM HEPES 的 Leibovitz 培养基（参见配方）。 HEPES 缓冲液可在解剖过程中稳定 L-15 培养基的 pH 值。在本协议的所有情况下，L-15/HEPES 解决方案均指此 HEPES 缓冲溶液。

12. 酶鸡尾酒（见食谱）

13. 标准内部解决方案（见配方）

14. 120 mM 磷酸盐缓冲液(PB) （参见配方）

15. 5 mM PB （见配方）

16. 山羊血清稀释/封闭缓冲液（GSDB）（见配方）

17. 洗涤缓冲液（见配方）

C. 安装盖玻片

1. 15 mm 圆形玻璃盖玻片

2. 硅弹性体，Sylgard 184（道康宁，目录号： 4019862）

3. 尼龙丝袜

注意：任何可以去除单纤维的长袜。

4. 导热胶带

注意：这是一种带有耐热粘合剂的聚酯胶带，可在销售电子元件和焊接设备的商店中找到。

D. 玻璃底记录室

1. 低剖面浴记录室（例如，Warner Instruments，目录号：64-0236）

2. 盖板玻璃，矩形，#1 厚度，22 × 40（Warner Instruments，目录号：64-0707）

3. 用于在矩形玻璃和记录室之间进行防水密封的硅脂套件（Warner Instruments，目录号：64-0378）

E. 录音_

1. 用于电极的丝状硼硅酸盐毛细管（例如，Sutter Instruments，目录号：BF140-117-10）

2. 参考电池（例如，World Precision Instruments，目录号：RC1T）

F. 录音解决方案

1. 0.2微米 aPES 膜过滤器（例如，Nalgene，目录号：566-0020）

2. 烧杯（1,000 毫升、100 毫升）

3. 容量瓶，100 mL

4. 血清移液器（10 mL、25 mL）

5. 0.22 μm PES膜注射器过滤器（例如， Celltreat ，目录号： 229747 ）

6. 34号熔融石英柔性针（World Precision Instruments，目录号：MF34G）

7. 封口膜（Bemis，目录号： PM992）

8. 培养皿，35 mm，60 mm（Fisher，目录号： 08772A，08772F）

9. 注射器（10 毫升，3 毫升）

10. Milli Q 水，无菌超纯水， R >18.18 mOsm cm（例如，通过 Millipore-Sigma 水净化系统过滤）

11. 生物胞素（Sigma-Aldrich，目录号： B4261）

12. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号： H3375）

13. LiGTP（Sigma-Aldrich，目录号： G5884）

14. ATP二钠（Sigma-Aldrich，目录号： A7699）

15. MgATP（Sigma-Aldrich，目录号： A9187）

16. Na-cAMP（Sigma-Aldrich，目录号： A6885）

17. EGTA（Sigma-Aldrich，目录号： E0396）

18. CaCl ₂（ JT Baker，目录号：1311-01 ）

19. KCl（Sigma-Aldrich，目录号： P93333）

20. MgCl ₂（Sigma-Aldrich，目录号： M1028）

21. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号： S7653）

22. NaH ₂PO ₄（Sigma-Aldrich，目录号： S0751）

23. NaHCO ₃（Sigma-Aldrich，目录号： S6297）

24. Sulforhodamine 101（Molecular Probes，目录号： S359）

25. 1 N NaOH 将 L-15/HEPES 的 pH 值调节至 7.35。

26. 1 M KOH 可将细胞内记录溶液的 pH 值调节至 7.35

G. 免疫解决方案

1. PBS（Thermo Scientific，目录号： 10010-023）

2. Na ₂HPO ₄（Sigma-Aldrich，目录号：S-100G）

3. NaH ₂PO ₄（Sigma，目录号：S-5011）

4. 正常山羊血清（Life Technologies，目录号：16210-064）

5. NaCl（JT Baker，目录号：4058-01）

6. Triton-X100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）

7. 4％多聚甲醛（EMS，目录号：RT-157-4）

8. 封固剂（Vectashield Antifade Medium，目录号：H-1000-10）

9. 抗体

a. 抗肌球蛋白-VI-兔多克隆，用于标记毛细胞的细胞质（Proteus Biosciences，目录号：25-6791）。以 1:1,000 的稀释度使用。

b. 链霉亲和素 Alexa Fluor 488 偶联物，用于标记充满生物细胞素的神经元（Molecular Probes，目录号：S32354）。以 1:200 的稀释度使用。

c. 抗外周蛋白兔，用于标记 II 型螺旋神经节神经元。（Millipore，目录号：AB1530）。以 1:500 的稀释度使用。

d. 二抗包括 Alexa Fluor 594 抗兔（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11080）。以 1:200 的稀释度使用。

设备_

1. 移液器（1,000 μL 、200 μL 、10 μL ）

2. 立体解剖显微镜（例如，Zeiss，型号：斯泰米 2000)

3. 落射照明光源（例如，Zeiss CL 1500 ECO）

4. 解剖工具：

用于二等分头部的手术剪刀（例如，直剪刀；FST，目录号：14060-09）

弹簧剪刀（例如，FST Vannas 弹簧剪刀，2.5 毫米切削刃）

钝钳（例如，FST Dumont #3）

带有细轴的细镊子（例如，FST Dumont #55）

精细镊子（例如，FST Dumont #5 ）

5. 如果解剖 P15 岁以上的老鼠，小动物断头台将被斩首

6. 防震台（例如，TMC 的 Cleanbench Airtables）

7. 带有 DIC 光学器件的正置显微镜，用于可视化完整制备中神经元的 3-D 结构（例如，蔡司，型号： AxioExaminer D.1）

8. 用于检查 Sulforhodamine 101 发出的光的滤光片立方体。 Sulforhodamine 的激发波长约为586 nm，发射波长约为 605 nm。我们的设置有蔡司滤光片组 #20，带通激发滤光片为 546 ± 12 nm，透射滤光片为 560，带通发射滤光片介于 576 和 640 nm 之间。

9. 荧光激发灯（例如，XCite EXFO 120）

10. 可选：10 ×或 20 ×水浸物镜，用于观察样品，快速评估样品质量

这个物镜很有用但不是必需的（例如，Zeiss 20 × “N Achroplan” 20 × , 0.5 NA; 420957-9900-000）。

11. 63 ×物镜适用于浸入盐溶液中，在 400 至 800 nm 范围内具有良好的荧光透射率。长工作距离对于插入电极很有用（例如，我们的记录装置有一个 Zeiss W Plan-Apochromat 63 × /1.0 M27； 421480-9900-000 ）

12. 在记录期间显示明场图像的相机（例如，带有 Axiovision 软件的 Axiocam MRM 数码相机）

13. 显微操作器能够进行大范围的行程，具有粗步和细步分辨率。我们的膜片钳装置有一个 Sutter MP285 电动显微操作器，在 3 个维度上具有大约 1 英寸的行进距离和大约 0.2 μm的粗略运动分辨率和 40 nm的精细运动分辨率。

14. 带有放大器、数字化仪和计算机控制软件的膜片钳系统，用于传输和记录信号

我们使用 Multiclamp 700B 放大器和软件控制的前面板、Digidata 1440（数据采集数字化仪）和 pClamp v10 软件套件来设计刺激和记录响应。安装了 pClamp 软件并在 Windows 7 操作系统上控制了数字化仪。

15. 至少有 2 个通道的蠕动泵

这用于在记录期间将含氧溶液连续灌注到样品中（例如，Rainin 2 通道蠕动泵）。

16. 立体解剖显微镜（例如，Stemi 2000，蔡司）

17. 用于固化硅弹性体 Sylgard 的实验室烘箱

18. 酸碱度计

19. 具有检查溶液渗透压标准的渗透压计

20. 搅拌板和搅拌棒

21. 精密天平能够测量到 0.1 毫克

22. 垂直电极拉拔器（例如，Narishige PC-10）

23. 能够激发和扫描 Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 594 的共聚焦成像系统

我们使用具有 60 × 1.42 数值孔径、油浸物镜和三倍变焦（专注于 IHC-SGN 突触）的蔡司 LSM 800。扫描格式设置为收集 1024 × 1024 像素，在横向 (XY) 维度上产生 0.069 µm/像素的采样。以 0.49 µm 的 z 步长获取切片，针孔设置为 1 Airy 单位。在不同的通道中依次扫描发射波长为 488 和 594 的荧光信号，以确保每个结构的最佳成像。

软件

1. 用于 DIC 明场和罗丹明通道的多通道图像采集的相机和软件。在这里，我们将 Axiovision 与 Axiocam MRM 相机结合使用。

2. 图像分析程序能够根据荧光强度进行图像分割，并从荧光信号的 z-stack 图像生成 3-D 纤维重建。我们使用了来自 Bitplane 的 Imaris。

3. 用于设计、交付和记录膜片钳数据的软件。我们使用了 pClamp v10，这是一种与 Molecular Devices 数据采集数字化仪 Digidata 1440 接口的商用软件包。

程序

A. 提前准备

1. 在无菌条件下制备大批量（~50 mL ）的细胞内溶液（参见食谱）。在制备过程中快速工作并保持溶液低温，以防止 ATP、cAMP 和 LiGTP 降解。使用 0.2- μm PES 膜注射器过滤器过滤，并在 -20 ° C 下以1-2.5 mL 等分试样储存。

注意：在记录当天添加新鲜的生物胞素。

2. L-15/HEPES 溶液：准备 1 L 的 Leibovitz 培养基，辅以 10 mM HEPES。用大约2 mL的1 N NaOH将 pH 滴定至 7.35 。该溶液可以提前几天制备、过滤并在密封瓶中在 4°C 下储存长达 1 周。

3. 制备和储存 120 mM 磷酸盐缓冲液（PB，100 mL）、5 mM PB（25 mL）、洗涤缓冲液（25 mL）和山羊血清稀释缓冲液（GSDB，25 mL）。请参阅“食谱”部分中的食谱。

4. 安装盖玻片

a. 准备三到五个安装盖玻片（图 1），将从女士尼龙袜中提取的两条尼龙纤维拉伸到重金属板上（例如，纽波特金属板，图 1A）。

b. 使用导热胶带将纤维连接到板上。在拉伸纤维下滑动 13-15 毫米盖玻片。

注意：在制作盖玻片之前，应在乙醇中清洁盖玻片。

c. 调整盖玻片的位置，直到尼龙纤维形成 “ V ”形，盖玻片中间的螺纹之间的距离约为 1 mm。应用两点 Sylgard 硅胶聚合物将纤维连接到盖玻片上（图 1B）。

d. 制作几个盖玻片，两根纤维之间的分离略有不同；这将为您安装不同长度的耳蜗转弯提供最佳灵活性。

e. 盖上玻璃培养皿，使盖玻片在制作时无灰尘。

f. 通过将带有盖玻片的金属板放入设置在大约 45°C 的实验室烤箱中，治疗盖玻片上的 Sylgard。孵育至少 1 小时以治愈 Sylgard。治愈的 Sylgard 将不再俗气。

g. 将安装盖玻片存放在无尘环境中。例如，我们将它们储存在用封口膜包裹的无菌培养皿中。

图 1 。安装盖玻片。

A. 在 15 mm 圆形玻璃盖玻片上拉伸的尼龙纤维。使用导热胶带将纤维连接到金属块上。 B. 在盖玻片边缘应用 Sylgard 点，将两条尼龙纤维固定在盖玻片上。 C. 记录电极的图像。

B. 录制当天

1. 电极：拉两个或三个大口径电极、五到十个清洁电极和大约十个记录电极在记录会话的前一天或晚上。每个电极的设置因实验室而异，具体取决于所用玻璃的拉拔器和类型。在我们的实验室中，我们制造了所有三种类型的电极。所有电极均在具有丝状硼硅酸盐玻璃的两级垂直拉拔器 (Narishige PC-10) 上制成。尽管我们在“配方”部分概述了我们实验室使用的“配方”，但应在每个实验室内调整拉拔器设置，并根据拉拔器的类型进行调整。在这里，温度设置报告为两阶段拉程序的每个阶段提供的最大输出的百分比。记录吸管的内径平均约为 1 μm （图 1C），记录吸管电阻在 4.5 和 6 mOsm之间。

2. 要降低移液器电容，请在电极尖端涂上一层薄薄的疏水涂层。在我们的实验室中，我们使用包裹在尖端周围的封口膜薄片或在尖端上涂上有机硅弹性体（Sylgard 184；道康宁，米德兰，密歇根州）。如果使用 Sylgard，请将电极穿过电热灯丝使其固化。请注意，不应让弹性体流到尖端，因为这会阻止成功的密封。读者可以参考 Brown等人的视频协议。 (2008)和The Sutter Pipette Cookbook作为制作合适移液器的更多技巧的优秀资源。

3. 解剖

a. 根据机构批准的指南对任一性别的新生大鼠（P3 和 P16 之间）实施安乐死。我们使用 Fatal Plus 腹膜内注射麻醉动物，这是一种基于戊巴比妥的安乐死溶液，剂量为 50-60 mg/kg。 Fatal Plus 溶液通常在无菌盐水中稀释至 50 mg/mL 的工作浓度，以便对小大鼠进行给药。一旦动物达到麻醉深度，斩首。

b. 用 70% 乙醇冲洗头部，然后用冷冻 L-15/HEPES 溶液冲洗。

c. 使用小解剖剪刀去除皮肤并沿中线切割头部。这将产生两个半头，如图 2A 所示。

d. 取下下巴（沿虚线切割，图 2A）并从每个半头挖出大脑。

e. 将两半转移到 60 mm 培养皿中，培养皿中装有冷的含氧 L-15/HEPES 培养基（参见食谱）。

f. 使用钝 #3 镊子从每个半头（蓝色轮廓，图 2C）中取出两个耳囊。半规管产生的空腔是识别耳囊顶部的良好标志（图ure 2B -2 D )。将耳囊放入装有冰冷 L-15/HEPES 培养基的干净盘中。在转移过程中要小心，因为耳囊在 P8 以下部分是软骨部分，部分是骨质的，这使得它们容易被压碎。

注意：从此时起，耳囊应一直浸入L-15/HEPES溶液中。 L-15/HEPES 溶液应经常更换，并在整个解剖过程中保持冰冷，例如将解剖盘放在装满冰块的大培养皿中。

图 2 。大体解剖以去除耳蜗。

A. 显示一个平分的半头，并带有标明大脑、鼻子和舌头的标签。一条绿线表示沿着该线进行切割以去除舌头。 B. 去除大脑和舌头的半头。小星号表示半规管内形成的空腔。蓝线勾勒出耳囊。 C. 耳囊的高倍放大视图。 D. 从半个头上取下耳囊。 E. 耳囊翻转以可视化耳蜗的蜗牛形状。 OW - 椭圆形窗口，RW - 圆形窗口，V - 耳朵的前庭部分。 F. 去除骨壳后耳蜗转动。请注意，F 中的耳蜗与 AE 中的样本不同。

耳蜗解剖的以下步骤需要大量练习才能干净地提取耳蜗转弯而不损坏神经元和神经节体。他们可以通过持续的练习来掌握。

g. 耳蜗可以识别为耳囊的螺旋状蜗牛状部分（图2E ）。通过将钝钳 (Dumont #3) 的两个臂插入耳蜗底部的圆形和椭圆形窗口（或者保持在内耳的前庭部分），将耳蜗固定到位。

h. 开始从耳蜗顶端开始切削或刮除骨壳。在细刀手术刀和细镊子 (#5) 之间切换，以在它们折断时取出碎片。（请注意，当耳囊尚未完全骨化时，P6 以下不需要手术刀）。小心地取出所有骨套管，将完整的耳蜗与膜迷宫（图 2E）分开。可以在 Grant et中找到展示这部分解剖的精彩视频 人_ （2010）。

i. 如图所示穿过螺旋圈（图3A）。这应该留下三个转弯：顶端、中间和基底（图3B ）。

j. 使用细钳 (#5)，将中间转组织保持在边缘。使用第二对细镊子 (#55)，将血管纹 (图 3C) 慢慢拉离Corti 器官 (图3D )。使用细镊子（#55 镊子）取下 Reissner 膜（必要）和盖膜（可选）。生成的组织应如图3E所示。

注意：去除 Reissner 膜很重要，因为它有时会落回到神经节上，使螺旋神经节胞体的视野变得模糊。

图 3 。精细解剖 准备、清洁和安装整个耳蜗轮。

A. 耳蜗螺旋。 B. 耳蜗螺旋切成顶端、中间和基部的转弯。 C. 有血管纹的中转。 D. 条纹分离。 E. 识别 Reissner 膜。 F. 修剪线以去除纤维芯。 G. 用橙色突出显示螺旋神经节的清洁耳蜗转动。 H. 安装在尼龙纤维下的人工耳蜗。

k. 接下来，使用 Vannas 剪刀修剪耳蜗部分的核心以去除通过的纤维束（图ure 3F）。这将允许电极访问螺旋神经节神经元 (SGN) 细胞体。通过翻转组织使立体纤毛束朝下，可以更容易地识别要修剪的区域。当如此翻转时，毛细胞区域看起来是凹的。翻转组织时，径向纤维也最容易观察到。调整落射照明光源将帮助您定位神经节区域开始时的空间。神经节区域和内核之间的过渡更亮，看起来几乎像一条白线（图3F ，围绕该线绘制的蓝色曲线）。沿着蓝线剪开。在解剖结束时，耳蜗现在应该看起来像一个 C（图3G ）。它现在可以安装和酶消化了。

4. 组织安装和酶消化

a. 通过用真空密封的矩形盖玻璃封闭底部来准备录音室。将安装盖玻片放入录音室。这将创建两个玻璃层，形成腔室底部的盖玻片和安装盖玻片。

b. 用新鲜的 L-15/HEPES 培养基冲洗盖玻片以去除灰尘。

c. 要将耳蜗安装到安装盖玻片中，请使用细镊子轻轻提起一根尼龙纤维。它将处于相当大的压力之下。将耳蜗转弯的一端滑到拉伸的纤维下方。轻轻地将纤维释放到组织上。注意不要让纤维折断，因为这会切割组织。提起第二根纤维，将组织的另一端滑到第二根纤维下。组织应拉伸平放，但不要过度拉伸，因为这会导致毛细胞区域折叠和扭曲。有关安装过程的示例，请参阅视频 1。执行所有后续步骤，包括膜片钳记录、免疫组织化学和将样品连接到安装盖玻片上的成像（图3H ）。

视频 1. 将耳蜗安装到盖玻片上进行电生理记录。

d. 从位于组织边缘和顶部的神经节细胞记录是最容易的。纸巾也可以用发束朝上或朝下的方式安装；改变安装方向可以访问不同的神经元组。

e. 安装后，用胰蛋白酶-胶原酶鸡尾酒替换 L-15/HEPES 培养基，并将整个记录室与盖玻片和样品放在 37 °C的加湿培养箱中。孵育 10 到 15 分钟（对于 ~P6）。增加年长动物的孵化时间（P16 大约 20 分钟）。通过用新鲜的 L-15/HEPES 培养基连续更换浴液来终止酶促反应。

注意：酶消化后不要试图调整尼龙纤维，组织会撕裂。

注意：虽然示例图像显示了螺旋神经节的中转，但准备工作可以来自耳蜗的任何地方，但需要注意以下事项。在心尖转弯处，神经节形成一个厚球。组织的厚度使得在显微镜下更难看到单个螺旋神经节的胞体。相比之下，神经节在基底转处更分散，但牙根壁的更快骨化使得在解剖过程中更容易撕裂神经元纤维（我们发现在 P5 后很难干净地提取基底转）。随着动物年龄的增长，耳蜗所有区域的贴片电极记录变得具有挑战性。这是因为耳囊在产后最初几周内继续骨化，使解剖变得越来越困难。此外，髓鞘形成的发育进程使得难以清洁细胞膜以在 P14 后进行膜片钳夹。

5. 清洁和准备细胞膜片钳

a. 将带有样品的记录室转移到直立显微镜阶段，并开始用含氧 L-15/HEPES 灌注。

b. 用 L-15/HEPES 填充从玻璃毛细管中拉出的大口径电极（电极的尖端直径应为 5 至 10 μm ）。将电极加载到配备有吸管的微电极支架上（我们使用与膜片钳相同的支架）。在 63 ×物镜下可视化电极时，使用机械手将其移近螺旋神经节。轻柔地吸出漂浮的碎片和任何位于神经节细胞上的细胞。避免拉扯大片组织的诱惑；酶消化使组织变得脆弱，组织过度工作会杀死大量细胞并使该区域非常粘稠。该清洁步骤不应代替去除通过的纤维的切割步骤。

c. 接下来，通过剥离覆盖和髓鞘螺旋神经节胞体的卫星（雪旺）细胞，准备单个细胞进行记录（图4A ）。这些细胞最终在细胞体周围形成多层髓鞘。因为雪旺细胞紧紧地附着在胞体上，所以有时很难看到它们。这些细胞需要被移除以允许记录移液器进入神经元的细胞膜。为此，请引入另一系列充满细胞内溶液的清洁电极。首先，施加正压以轻轻吹散溶液并“抛光”雪旺氏细胞的膜。这一抛光步骤通常会清除感兴趣的细胞体周围的边界，并帮助人们看到螺旋神经节体细胞周围的雪旺细胞。雪旺细胞通常在其细胞核附近有肿胀。压入雪旺细胞并轻轻吸力以将细胞从神经元上撬开（图4A ）。注意不要在拉雪旺细胞时拉伸神经元。随着动物年龄的增长，单个 SGN 可能有多个需要去除的雪旺氏细胞。对于年龄较大的动物，在酶中延长孵育时间可能会有所帮助（我们在 P6 使用大约 15 分钟，在 P16 使用 20 分钟）。只要清洗电极的尖端没有被堵塞，同一个电极就可以用来剥离多个施万电池。重复细胞剥离过程，直到清洁了少量细胞。

注意：拉出雪旺细胞的技术需要一些练习。

d. 清洁后，让准备工作在灌注系统运行的情况下休息 20 分钟。这段休息时间的好处是可以让新鲜的 L-15/HEPES 洗去松散的碎屑。它还允许神经元从清洁的机械压力中恢复。对治疗没有弹性的细胞将在尝试记录之前裂解。这通常是解冻并将生物胞素添加到细胞内溶液中的好时机。

图4.膜片钳记录和加载单个单元格。

A.清洁电极拉出施万电池。 B. 记录电极在 SGN 上形成密封（与 A 不同的电池）。 C. Sulforhodamine 标记的细胞作为中间标记，以跟踪标记的细胞。 D. 电压钳模式下全细胞膜片钳记录的示例。注意神经元的钠和钾电流特征。 E. 响应电流注入步骤的示例电流钳记录。当前步进的幅度显示在每条迹线旁边。示例来自两个不同的神经元，它们显示出不同类型的动作电位模式以响应相同的刺激。

6. 记录

a. 一旦 soma 可以访问，加载一个包含细胞内溶液和 biocytin 的记录电极（参见食谱）以记录和标记神经元。为了在电池上形成成功的密封，首先应用正压清洁和清洗电极将着陆的膜区域（图4 B）。用轻微的正压推入电池。释放正压。随着正压的释放，密封将形成。施加一点吸力（负压）以帮助形成密封。当 gigaOhm 密封开始形成时，打开保持电位（我们选择 -60 mV）。形成稳定的密封后，轻轻而稳定地抽吸以破裂到细胞中。细胞内溶液将涌入细胞。

b. 记录电压钳中的电压门控电流（图4 D）和电流钳中的触发模式（图4 E）。注意指示钠电流的瞬时内向电流和指示钾电流的持久外向电流。这些电流的存在和电流钳中记录的动作电位表明这些记录来自螺旋神经节神经元。有关如何解释这些录音的更多详细信息，请参阅 Markowitz 和 Kalluri (2020) 。

c. 完成所需的记录后，我们以 10 Hz 的频率注入一系列电流脉冲，持续 30 秒，以诱导神经元的重复脉冲。调整脉冲序列的幅度以达到电流阈值。我们发现，在我们诱导 30 到 40 秒的尖峰的细胞中，生物胞素的负载得到了增强。记录的总持续时间应保持较短，以实现最佳的生物胞素标记（我们通常在细胞上停留不到 10 分钟）。

d. 加载细胞后，打开落射荧光光源以检查细胞体是否用磺基罗丹明明亮地标记（图4 C）。中央轴突的一小部分通常会用 Sulforhodamine 标记，但我们还没有找到要标记的外围树突。这意味着您只有在完成免疫组织化学步骤后才能知道外围树突是否标记。

e. 使用组织地标仔细记录所记录细胞的位置。

f. 确认体细胞标记后缓慢撤回电极。目标是确保细胞膜密封起来，以便在拔出电极后将生物胞素保留在细胞中。在我们手中，小尖端电极（串联电阻在 5-6 mOsm范围内）比电阻较低（1-2 mOsm ）的大孔电极更容易拉断。我们还发现，在锯齿形路径中将电极撤回有时有助于轻轻地将电极从电池中分离出来。

g. 录音完成后，从录音室中取出整个安装盖玻片并转移到 4% 的多聚甲醛中。让样品在室温下固定 15 到 30 分钟。所有后续的免疫标记和成像步骤都应在样品仍附着在安装盖玻片上的情况下进行。

7. 免疫组织化学

a. 用 PBS 洗 3 次，每次 15 分钟每个。在洗涤步骤期间将样品放在摇床上。然后可以从阻塞步骤 (c) 开始处理样品或将样品储存在 PBS 中直到准备好处理。在开始下一步之前，我们最多将样本存储在 PBS 中 2-3 天。

b. 如果样品被储存，在 PBS 中洗涤 3 次，每次 10 分钟在摇床上。

c. 在由 16% 正常山羊血清、0.3% Triton X、450 mM NaCl 和 20 mM 磷酸盐缓冲液组成的封闭/稀释缓冲液中，在室温 (~25 °C ) 下孵育样品 1 小时。这种封闭/稀释缓冲液的配方标记为“山羊血清稀释/封闭缓冲液”（GSDB）。

d. 在洗涤缓冲液中洗涤 3 次，每次 10 分钟（参见下面的食谱）。

e. 用一抗溶液在 4 °C 下孵育样品过夜。一抗溶液是抗肌球蛋白-VI-兔多克隆抗体（1:1,000 稀释度）和链霉亲和素 Alexa Fluor 488 偶联物（1:200）在 GSDB 中的稀释液。抗肌球蛋白抗体标记毛细胞，链霉亲和素标记充满生物细胞素的神经元。在一些样本中，我们用抗外周蛋白 (1:500) 代替抗肌球蛋白抗体来标记 II 型螺旋神经节神经元。

f. 在洗涤缓冲液中洗涤 3 次，每次 10 分钟。

g. 用在 GSDB (1:200) 中稀释的二级抗体 Alexa Fluor 594 抗兔在室温下孵育 1 小时。

h. 在 5 mM PB 中洗涤一次 10 分钟。 PB 的配方可在下面的配方部分找到。

8. 成像

a. 准备幻灯片，将 4-5 个硬化指甲油点放置在计划盖玻片的圆周下。确保载玻片无尘，必要时使用乙醇擦拭干净。将免疫标记样品仍贴在载玻片上的安装盖玻片上。

b. 添加一滴褪色保护介质，如 Vectashield。盖上另一个直径大于安装盖玻片的盖玻片。或者，将安装盖玻片倒置在一滴 Vectashield 上。硬化的指甲油点可防止盖玻片压碎耳蜗部分。确保 Vectashield 不会从盖玻片的边界漏出。

c. 用指甲油密封边缘。将样品带到共聚焦显微镜上进行扫描 [有关扫描设置的具体示例，请参见 Markowitz 和 Kalluri (2020)]。记录后成功标记的示例如图ure所示 5 ;描述了分析这些图像的其他示例和策略（Markowitz 和 Kalluri，2020）。

图5.两个生物胞素标记的螺旋神经节神经元（青色）接触内毛细胞（红色）。

数据分析

有关数据分析的详细信息，请参阅 Markowitz 和 Kalluri ( 2020 ) 。

食谱

A. 电极

所有拉动都是具有 8 厘米和 4 厘米滑块设置的两阶段拉动。 Narishige 拉拔器有两个标准砝码，可以添加到拉拔器中以控制电极的形状。

1. 大口径电极：温度1：79%；温度2：59%；两个重量轻。打破尖端和火抛光到大约 10微米的尖端宽度。

2. 清洗电极：温度1：79%；温度2：59%；一重量轻。

3. 记录电极：温度1：89.9%；温度 2：59.9%，1 重量轻，如果需要，火抛光以改善形状。

B. 电生理学解决方案

1. 标准 L-15/HEPES 解决方案

制作 1 L 的 L-15 培养基，辅以 10 mM HEPES 。

a. 用 NaOH 滴定调节 pH 至 7.35。

b. 通过 0.2 μm Nalgene 过滤器过滤并储存在两个 500- mL无菌瓶中。

c. °C 下将未开封的瓶子存放长达 1-2 周。

2. 酵素鸡尾酒

a. 使用 10 m L血清移液器，将 5 m L的 L-15/HEPES 溶液添加到干净的 25 mL 介质瓶中。

b. 在瓶子中加入 0.0050 克胶原酶和 0.025 克胰蛋白酶。

c. 再添加 5 毫升L -15/HEPES。

d. 添加搅拌棒并放置在搅拌板上，直到两种酶都溶解。

e. 解决方案将是橙色/棕色。

3. 标准内部解决方案

135 毫米氯化钾

3.5 毫米氯化镁₂

3 毫米钠₂ATP

5 毫米 HEPES

5 毫米 EGTA

0.1 毫米氯化钙₂

0.1 毫米锂-GTP

添加 1 mg/100 mL Sulforhodamine 101

用 KOH 滴定至 pH 7.35

a. 检查渗透压是否约为 280 mOsm。

b. 通过 0.2 μm过滤器过滤并储存在 1-2.5 mL 等分试样中。

c. 在录制当天解冻一份。

d. 在内部溶液中加入 2.5 mg/mL 生物胞素。

e. 涡旋以帮助生物胞素完全进入溶液。

f. 将溶液吸入 3 mL 注射器中。

g. 将 35 号 Microfil 尖端连接到负载电极。

h. 将此注射器用箔纸和冰盖住。

C. 免疫组化解决方案

所有溶液都应通过 0.2 μm膜过滤并在室温下储存（除非另有说明）。与所有荧光标记一样，溶液应保持无灰尘。

1. 120 mM 磷酸盐缓冲液(PB)

使最终体积为100 m L：

100 mM Na ₂HPO ₄1.412 克

20mM NaH ₂PO ₄0.240 克

Milli Q水100 毫升

2. 5毫米铅

使最终体积为25 m L：

铅 1.04 毫升（见上文）

Milli Q水 23.96 毫升

3. 山羊血清稀释/封闭缓冲液 (GSDB)

使最终体积为25 m L：

16% 正常山羊血清 4 mL

450 毫米氯化钠 0.6575 克

0.3% Triton-X100 75 μL

20 mM PB 4.17 mL（见上文）

Milli Q水16.75 毫升

注意：应导致 pH = 7.4，最终体积为 25 mL；在 -20°C 下以 0.5 mL 等分试样储存。

4. 洗涤缓冲液

使最终体积为25 m L：

450 毫米氯化钠 0.6575克

20毫米铅 4.17 毫升

0.3% Triton-X 75 微升_

Milli Q水20.75 米_

致谢

这些技术的开发是由于南加州大学前众议院研究所的研究基金和 NIH NIDCD 向 RK 授予R03 DC012652 和 R01 DC015512以及美国耳科学会向 AM 提供的研究生奖学金提供的支持而开发的。我们感谢 Maya Monges-Aviles 和 Lucy Gharibian 对解剖技术和照片的早期贡献。该协议源自 Markowitz 和 Kalluri (2020; Doi：10.7554/eLife.55378 ）。

利益争夺

作者没有财务和非财务竞争利益。

伦理

所有程序均经南加州大学机构动物护理和使用委员会批准。协议 20704 有效期至 2023 年 2 月 24 日。

参考

1. Brown, AL, Johnson, BE 和 Goodman, MB (2008)。使用可编程拉拔器制作贴片移液器和锋利的电极。 J Vis Exp (20)：939。

2. Davis, RL 和 Liu, Q. (2011)。复杂的初级传入：螺旋神经节内电生理相关表型的分布告诉我们有关外周神经编码的信息。听到第 276(1-2) 号决议：34-43。

3. Glowatzki, E. 和 Fuchs, P. (2002)。毛细胞带状突触处的发射器释放。 自然神经科学5：147-154。

4. Liu, Q.、Lee, E. 和 Davis, RL (2014)。小鼠螺旋神经节神经元的异质内在兴奋性由 Kv1 和 HCN 通道决定。 神经科学257：96-110。

5. Markowitz, AL 和 Kalluri, R. (2020)。新生儿听觉神经元生物物理特性的梯度与突触接触位置和内毛细胞的强度编码图一致。生命9： e55378 。

Rutherford, MA, Chapochnikov, NM 和 Moser, T. (2012)。耳蜗螺旋神经节神经元对神经递质释放时间的尖峰编码。 神经科学杂志 32（14）：4773-4789。