材料和试剂

1. 固相可逆固定化（SPRI）选择珠（Beckman Coulter，目录号：B23318）。在室温下储存。

2. 高灵敏度 DNA 芯片和试剂（Agilent Technologies，目录号：5067-4626）。将试剂储存在 4 °C和 DNA 芯片在室温下。

3. 汉克斯平衡盐溶液（Sigma，目录号：H6648-500ML）。在室温下储存。

4. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4（Gibco，Thermofisher，目录号：10010-023）。储存在 4 °C。

5. Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）（Gibco，Thermofisher，目录号：12440-053）。储存在 4 °C。

6. 胎牛血清（FBS）（Gibco，Thermofisher，目录号：10082147）。储存在-20 °C。

7. 1 M Tris-HCl pH 7.4（Teknova，目录号：T5074）。在室温下储存。

8. 5 M NaCl（Teknova，目录号：S5845）。在室温下储存。

9. 1 M MgCl ₂（Teknova，目录号：M0308）。在室温下储存。

10. 洋地黄皂苷（Promega，目录号：G9441）。在水中以 1:1 的比例稀释原始的 2% 洋地黄皂苷溶液。等分并储存在-20 °C。

11. Tween-20（Sigma/Roche，目录号： 11332465001）。储存在 4 °C。

12. NP40（Sigma/Roche，目录号： 11332473001）。储存在 4 °C。

13. 标记 DNA 酶（转座酶）和 2 × TD 缓冲液（Illumina，目录号：20034197）。储存在-20 °C。

14. NEBNext 2 × MasterMix（New England Biolabs，目录号：M0541S）。储存在-20 °C。

15. Zymo DNA Clean & Concentrator ^TM-5 试剂盒（Zymo Research，目录号：D4014）。在室温下储存。

16. DNase（Worthington，目录号：LS002007）

17. 20,000 单位/mL DNase 原液（见配方）

18. ATAC-重悬缓冲液（ATAC-RSB）（见配方）

19. ATAC-RSB 与洗涤剂缓冲液（见配方）

20. 洗去裂解缓冲液（见配方）

21. 转置组合（见食谱）

设备

1. 移液器（P1000、P200、P20、 P10 ）

2. 细胞计数器（ Nexcelom，型号：Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter）

3. ThermoMixer（ Eppendorf，型号：C 带加热盖）

4. 热循环仪（ Bio-Rad，型号：T100）

5. 生物分析仪（安捷伦科技，型号：2100）

软件

1. Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 2100 Expert（安捷伦科技， https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 ）

程序

注意： _

1. 在开始协议之前，按照“食谱”部分中的说明准备缓冲液、混合物和库存溶液。

2. 我们建议从至少 2 个生物复制开始。如果这不可用，则应从同一样品制备 2 个技术复制品。

A. 为 ATAC-seq 准备冷冻保存的细胞（第 1 天）

笔记：

a. 细胞活力是成功的 ATAC-seq 实验最重要的参数之一。为避免细胞死亡和裂解，冷冻保存的小瓶中的细胞应小心解冻并迅速转移到有利的环境中。

b. 本节中添加的 DNase 消化步骤将消化裂解细胞中的 DNA，否则可能会干扰最终数据和解释。

1. IMDM + 10% FBS) 加热至 37 °C 。

2. 将 4 mL 的热介质添加到 15 mL 管中（每个样品一管）。

3. 从 -80 °C冰箱中取出冷冻保存的细胞小瓶，并将其放入装有冰的桶中。

4. 将冷冻保存的细胞小瓶置于37 °C （一次不超过 3 个小瓶）。

5. 当细胞解冻一半时（通常为 1-2 分钟），将 1:1 体积的温培养基添加到小瓶中。

6. 上下移液几次，直到细胞完全解冻。

7. 立即用温暖的培养基将细胞转移到 15 mL 管中。

8. 以 500 ×旋转细胞 g室温下 5 分钟。

9. 丢弃上清液并在 1 mL 的温暖介质中重新悬浮细胞颗粒。

10. 将重新悬浮的细胞转移到微量离心管中。

11. 将 10 μL的等分 DNase 库存溶液（参见配方 1）添加到重新悬浮的细胞中，并在 37 °C下孵育 30 分钟（每个样品中的最终 DNase 浓度为 200 单位/mL）。

12. 以 500 ×旋转细胞 g在 4 °C 下5 分钟。

13. 丢弃上清液并用 1 mL 的冰冷 PBS（第一次 PBS 洗涤）重新悬浮细胞颗粒。

14. 以 500 ×旋转细胞 g在 4 °C 下5 分钟。

15. 重复步骤A 13- A 14。

16. 用 1 mL 的冰冷 PBS 重新悬浮最终颗粒，计数细胞，并使用细胞计数器估计生存能力。使用基于双荧光（例如，吖啶橙和碘化丙啶）成像的自动细胞计数器可提供快速且相当准确的细胞计数和活力估计。

B. 细胞裂解、转座和 DNA 提取（第 1 天）

笔记：

a. 要进行成功的 ATAC-seq 实验，使用正确的细胞转座酶比率至关重要。使用太少的细胞会过度消化染色质，导致可能优先测序的较小 DNA 片段的富集，从而增加数据中的背景噪音。另一方面，过多的细胞会导致消化不足，导致产生可能难以测序的大 DNA 分子。

b. OMNI-ATAC 手稿的作者（Buenrostro 等人，2015 年；Corces 等人，2017 年）已将该检测的细胞数量优化至 50,000 个。因此，我们将这个数字用于我们的常规实验。如果需要使用更多或更少的细胞，则应通过相应调整所有试剂的体积来保持细胞与试剂的比例。

1. ×离心 50,000 个活细胞在 Eppendorf 离心机中4 °C 下g 5 分钟。

2. 非常小心地取出上清液，不要干扰沉淀的细胞。这个过程可能很困难，因为有时颗粒几乎看不见。为避免意外吸出细胞，我们建议先使用 P1000 移液器直到最后 150-200 μL ，然后使用 P200 移液器直到最后 15-20 μL留在试管中，最后用 P20 移液器去除剩余体积。如果在此过程中某些细胞意外受到干扰，则在 500 ×下进行第二次离心 g ，需要在4 °C 下5 分钟。

3. 要裂解细胞，加入 50 μL的冷ATAC-RSB 和去污剂缓冲液事先准备好的（见配方 2 和 3）。

4. 用 P200 移液器上下重悬细胞 3 次，立即在冰上孵育 3 分钟。如果准备多个样品，请确保所有样品的孵育时间相同。

5. 加入 1 mL 的冲洗裂解缓冲液（参见配方 4）并将试管倒置 3 次以混合。

6. 以 500 ×旋转产生的核溶液在 Eppendorf 离心机中4 °C 下g 10 分钟。

7. 如步骤 B2 所述，非常小心地吸出上清液。

8. 将细胞核颗粒重新悬浮在 50 μL的转置混合物中（参见配方 5），并通过上下吹打六次来混合。

9. 使用热混合器，将样品在 37 °C下搅拌（1，000 RPM）孵育 30 分钟。在这一步中，转座酶将使用接头对可访问的 DNA 进行片段化和标记。

10. 根据制造商的说明，使用 Zymo DNA Clean and Concentrator-5 试剂盒从转置核中提取 DNA。在 21 μL的洗脱缓冲液中洗脱 DNA 。在这一步，DNA 可以储存在-20 °C，直到准备好通过 PCR 扩增制备文库。

C. 图书馆准备（第 2 天）

笔记：

a. 在协议的这一部分中，使用带条形码的引物对 B 部分中被片段化并用适配器标记的 DNA 进行 PCR 扩增。

b. 为了将多达 24 个文库汇集在一起，表 1 中列出了24 个条形码寡核苷酸 (Ad2.1-Ad2.24) 。

c. 根据我们的经验，当从大约 50,000 个细胞开始时，在没有文库过度扩增的情况下成功进行 ATAC-seq 实验的 PCR 循环数在 7 到 9 之间。如果细胞存活率高（超过 80%），我们运行PCR 7 个循环。在低存活率（低于 50%）的情况下，我们做 9。但是，为了避免大小和 GC 含量 PCR 偏差的风险，可以通过 qPCR 确定适当的循环数。布恩罗斯特罗等人。（2015）对如何计算精确的 PCR 循环数有完整的解释。

1. 在 PCR 管中准备以下 PCR 反应混合物。

25 μL 2 × NEBNext Master Mix

2.5 μL的 25 μM引物 Ad1

2.5 μL的25 μM 条形码引物Ad2.1

20 μL转置 DNA 样本

2. 当在同一个池中准备不同的样本进行测序时，每个单独的样本 PCR 反应混合物将具有不同的条形码引物 Ad2。

3. 使用以下循环条件执行 PCR：

1 = 72 °C 5 分钟

2 = 98 °C持续 30 秒

3 = 98 °C持续 10 秒

4 = 63 °C ，持续 30 秒

5 = 72 °C 1 分钟

6 = 转到步骤 3，六次

7 = 保持在 4 °C

表1 。条形码引物列表。

D. 图书馆净化（第 2 天）

注意：PCR 完成后，需要进行双面珠子纯化，以去除超过 1,000 bp 的引物二聚体和片段。

1. 执行双面 SPRI 珠纯化。

a. μL )中加入 0.5 ×体积 (25 μL ) 的 SPRI 磁珠，上下移液 10 次以充分混匀。

b. 快速将管子向下旋转 3 秒，并在室温下孵育 10 分钟。

c. 将 PCR 管放在磁架中 5 分钟，或直到上清液澄清。

d. 小心地将上清液转移到新的 PCR 管中。

e. 加入 1.3 ×原体积 (65 μL ) 的 SPRI 微珠，上下吹打 10 次以充分混匀。

f. 快速将管子向下旋转 3 秒，并在室温下孵育 10 分钟。

g. 将 PCR 管放在磁架中 5 分钟或直到上清液清澈。

h. 小心取出上清液并丢弃。

i. μL的 80% 新鲜乙醇清洗珠子两次。

j. 通过将管子向下旋转 3 s、将它们放回磁性机架中并用 P10 移液器吸头吸出乙醇来消除乙醇痕迹。

k. 在 20 μL的无核酸酶水中重新悬浮珠子。

l. 快速旋转管子 3 秒，并在室温下孵育 1 分钟。

m. 将 PCR 管放在磁架中 5 分钟或直到上清液清澈。

n. 将 19 μL的上清液转移到新管中。

o. 在生物分析仪上的高灵敏度芯片上运行 0.5 μL ，检查样品的片段大小分布曲线（图 1）。

p. 样品可以储存在-20 °C ，直到下一步。

注意：图 1A 显示了第一次珠子清理后的典型 ATAC-seq 生物分析仪配置文件。根据初始细胞活力、细胞类型、实验处理、转座核数和 PCR 循环数，核小体条带模式可能具有不同的结果。

图 1. 多个 ATAC-seq 文库在各种磁珠纯化后的高灵敏度生物分析仪配置文件。

A. 第一次双倍大小选择清理后的 ATAC-seq 配置文件。该文库中仍然存在超过 1,000 bp 的引物二聚体和片段。 B. 为了去除所有不需要的 DNA，进行了第二次双倍大小选择纯化。最终文库中的峰表示单核小体、二核小体和三核小体相关片段。 C. 第一次双倍大小选择清理后的 ATAC-seq 配置文件，显示存在引物二聚体。 D. 为了去除所有引物二聚体，进行了步骤 D2 中所述的第二次清理。 E. 第一次双倍大小选择清理后的 ATAC-seq 谱，显示存在引物二聚体、超过 1000 bp 的片段和一个大的第一个峰。 F. 为了减小低分子量峰的大小，在第二次纯化过程中应用了 0.95 ×而非 1 ×的珠粒比（有关详细信息，请参见 D 节中的注释）。

笔记：

1. 根据我们的经验，存活率非常低（低于 30%）的细胞通常在 9 个 PCR 循环后不会显示出良好的扩增。虽然这些文库可以进一步扩增，有时可能会出现类似于核小体条带模式的模式，但此类样本的 PCR 偏倚风险非常高，我们建议不要继续对此类样本进行测序。

2. 如果在 9 个 PCR 循环后，具有良好起始细胞活力的样品未显示扩增，我们建议进行几个额外的扩增循环（不超过 4 个）。

3. 在第一次文库纯化后，大多数实验仍会有超过 1,000 bp 的引物二聚体和/或片段（图 1A 和 1C）。另一个问题可能是存在一个大的低分子量峰（比其他 2 个峰高 3 到 4 倍，图 1E）。该峰的存在可能是由于转座酶过度消化或过度 PCR 扩增所致。这个大峰在测序过程中可能会出现问题，因为与其他两个峰相比，该峰中的 DNA 将被优先测序，因为它的分子量较低。在所有这三种情况下，应将库提交给第二次珠子纯化：（ i ）引物二聚体和片段超过 1,000 bp（图 1A）的库将需要步骤 D1 中描述的双面珠子清理。在这种情况下，步骤 D1e 中的珠比应为 1 × ，步骤 D1b 和 D1f 中的孵育时间应仅为 5 分钟（图 1B）。 ( ii ) 如果文库只有引物二聚体（图 1C），我们建议使用 1 ×珠比（步骤 D2）（图 1D）进行左侧清理。 3) 如果在这两种情况下也存在大的低分子峰 (图 1E), 步骤 D2b 和 D1e 中的珠子比应为 0.95 × (图 1F)。

2. 如果需要，执行左侧 SPRI 珠纯化。

a. 向步骤 E1n 中的样品中加入无核酸酶的水，直至 50 μL 。

b. 加入 1 ×体积 (50 μL ) SPRI 磁珠，上下移液 10 次以充分混匀。

c. 快速将管子向下旋转 3 秒，并在室温下孵育 5 分钟。

d. 将 PCR 管放在磁架中 5 分钟或直到上清液清澈。

e. 小心取出上清液并丢弃。

f. μL的 80% 新鲜乙醇清洗珠子两次。

g. 通过将管子向下旋转 3 秒，将它们放回磁性机架中，并用 P10 移液器吸头吸出乙醇来消除乙醇痕迹。

h. μL的无核酸酶水中重新悬浮珠子。

i. 快速旋转管子 3 秒，并在室温下孵育 1 分钟。

j. 将 PCR 管放在磁架中 5 分钟或直到上清液清澈。

k. 将 14 μL上清液转移到新管中。

l. 使用高灵敏度芯片生物分析仪运行 1 μL样品（图 1D）。

m. 样品可储存在 -20 °C 。

数据分析

1. 对于任何 Illumina 平台，汇集和测序所需的最小文库数量为 10 μL中的 5 nM 。

2. 按等摩尔在同一池中添加库。我们建议使用 qPCR 准确估计文库浓度。

3. 我们建议在 Illumina 平台 NextSeq1000/2000 或 NovaSeq6000 上进行双末端测序，每个样本至少有 1 亿次读取，读取长度为 2 × 100 bps，或 NextSeq500/550，读取长度为 2 × 75 bps。

4. 对于下游数据分析，每个样本至少需要重复两次。

食谱

1. 20,000 单位/mL DNase 原液

制作 20,000 单位/mL DNase 库存溶液。在 10 mL 的汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) 中重新悬浮冻干 DNase 粉末 (100 mg)。这对应于 10 mg/mL。由于 1 mg DNase 等于 2,000 Units，这意味着 10 mg/mL 为 20,000 Units/mL。将微量离心管中的库存溶液等分，并在 4 °C下保存长达 3 周。否则，将等分试样保持在- 20 °C 。

2. ATAC-RSB 缓冲器（表 2）

如表 2 所述准备缓冲 ATAC-RSB。此缓冲液可在室温下储存数月。

表2 。 ATAC-RSB 缓冲液配方。

3. ATAC-RSB 与洗涤剂缓冲液（表 3）

在实验当天用洗涤剂缓冲液制备 ATAC-RSB，并将其储存在4 °C 。

表3 。 ATAC-RSB配方与洗涤剂缓冲液（每个样品50 μL ）。

4. 冲洗缓冲液（表 4）

在实验当天准备冲洗缓冲液并将其储存在4 °C 。

表4 。洗出裂解缓冲液的配方（每个样品 1 mL）。

5. 转座组合（表 5）

根据表5，在 ATAC-seq 协议部分的步骤 6 中准备转座组合，并将其保持在冰上。如果制备多个样品，请添加额外过量的每种试剂。

表5 。 转置混合物配方（每个样品50 μL ）。

致谢

我们感谢 OMNI ATAC-seq 手稿的作者 Chang 博士和 Greenleaf 博士同意出版该协议。我们感谢弗雷德里克国家癌症研究实验室 CCR 测序设施的所有成员在样品制备和测序过程中提供的帮助，特别是 Yuliya Kriga 和 Yunlong He 在图书馆准备方面的帮助，Oksana German 为图书馆 QC 和 Tatyana Smirnova 运行测序仪。我们还要感谢测序设施生物信息学组的所有成员进行数据分析。该协议用于DOI 的研究手稿：10.1126/science.abb9847

利益争夺

没有要申报的竞争利益。

参考

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3. Buenrostro, JD, Wu, B., Chang, HY 和 Greenleaf, WJ (2015)。 ATAC-seq：一种检测全基因组染色质可及性的方法。 Curr Protoc Mol Biol 109：21 29 21-21 29 29。

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