材料和试剂

1. 10、200 和 1,000 μL 移液器吸头（Genesee Scientific，目录号：23-121RLC、23-150RLC 和 23-165RLC）

2. 1.7 mL微量离心管（Genesee Scientific，目录号：24-281）

3. 15 mL培养管（Genesee Scientific，目录号：21-130）

4. 50 mL锥形管（Genesee Scientific，目录号：28-108）

5. 2 mL冷冻管（VWR，目录号：10018-754）

6. 1升培养基瓶（VWR，目录号：10754-820）

7. 10 mL 和 25 mL 血清移液管（Genesee Scientific，目录号： 12-104 和 12-106）

8. 250通风挡板摇瓶（VWR，目录号：89095-270）

9. 胰蛋白胨（Biobasic，目录号：TG217（G211））

10. 酵母提取物（Biobasic，目录号：G0961）

11. 氯化钠（Biobasic，目录号：DB0483）

12. 无水硫酸铵（VWR，目录号：M105）

13. 葡萄糖（VWR，目录号：89405-376）

14. Bis-Tris（GoldBio，目录号：B-020-500）

15. 酪蛋白氨基酸（Biobasic，目录号：CB3060）

16. 12 M盐酸（Biobasic，目录号：HC6025）

17. Tris碱基（GoldBio，目录号：T-400-500）

18. Triton X-100（Sigma Aldrich，目录号：93443）

19. 不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂 (A32965)

20. 菌株DLF_R004 (F-, λ-, Δ( araD-araB)567, lacZ4787(del)::rrnB-3), rph-1, Δ(rhaD-rhaB)568, hsdR51, ΔackA-pta, ΔpoxB, ΔpflB, ΔldhA、ΔadhE、ΔicIR、ΔarcA、ΔompT::yibDp- λR-nucA-apmR ）在低磷酸盐诱导型启动子（例如，yibD ）（例如，Addgene 质粒 #127078）下用表达您感兴趣的蛋白质（例如 .GFPuv）的质粒转化

21. 低盐 LB（见食谱）

22. AB-2（见食谱）

23. 裂解缓冲液（见配方）

设备

1. 移液器控制器（Eppendorf，型号：4430 000 018）

2. 恒温摇床，轨道设置为 50 mm（Kuhner，型号：ISF4-X）

3. 台式离心机（Thermo Scientific，型号：Legend XTR）

4. -80°C 冰箱（Thermo Scientific，型号：TSX700）

5. 微量离心机（Eppendorf，型号：5415R）

6. 热块（Bioer，型号：CHB-201）

程序

A. 摇瓶两阶段发酵

1. 使用表达您感兴趣的蛋白质的 DLF_R004 冷冻原液（例如，如果使用表达 GFPuv 的 Addgene #127078 质粒，浓度为 35 µg/mL卡那霉素硫酸盐是必需的）。

2. 将 5 mL 细胞培养物在 37°C 下以 150 rpm孵育过夜（摇床轨道：50 mm）。

3. 用 20 mL 的无菌 AB-2 填充每个 250 mL 摇瓶，并辅以适当的抗生素。

4. 用 1% v/v 的过夜 LB 培养物接种 AB-2 培养基（每个 250 mL 摇瓶使用 200 μL 的 LB 过夜）。

5. 将 AB-2 培养物在 37°C 下孵育 24 小时，同时以 150 rpm的速度摇动（振动器轨道：50 毫米）

6. 24 小时后，由于蛋白质表达完成（Menacho-Melgar等人，2020b），测量并记录 OD。虽然我们观察到蛋白质表达高于 OD 5，但典型的 OD 值范围为 10 到 20。如果 OD 未达到 10，请参阅下面“注释”下的“适应替代细胞培养设置”。

7. × g下离心20 分钟来收获细胞。

B. 使用自溶/自水解提取蛋白质（参见图 3）

1. × Autolysis 缓冲液（每 20 mL 摇瓶培养物的总体积为 2 mL）中，补充有蛋白酶抑制剂的细胞培养体积的十分之一。为了便于处理，将细胞重悬液从摇瓶转移到微量离心管中。

2. 在 -20°C 或 -80°C 冰箱中冷冻细胞 1 小时。通过倾斜试管并检查细胞不流动，确保细胞冻结。这是该协议的一个很好的停止点，因此可以使用更长的冷冻时间（例如，过夜）而不影响裂解。

3. 在 37°C 的加热块中解冻细胞并孵育 1 小时。在较低温度（例如，室温）下孵育会导致细胞裂解不完全。

4. ×离心细胞 g在微量离心机中。

5. 收集含有不含 DNA/RNA 的蛋白质提取物的上清液。

6. 为了量化蛋白质滴度，我们建议使用 Bradford 检测（测量总蛋白浓度）和 SDS-PAGE（测量表达水平）。

图 3. 自溶/自水解协议大纲。

将细胞在摇瓶中的 20 mL AB-2 中培养 24 小时（步骤 A5）后，通过离心收获细胞（步骤 A7），重悬于 1x 裂解缓冲液中（步骤 B1，两管用于单次摇动-烧瓶），并冷冻至少 1 小时（步骤 B2）。将细胞解冻并在 37°C 下孵育 1 小时（步骤 B3）。然后将裂解物离心（步骤 B4）并可以收集蛋白质提取物（步骤 B5）。

笔记

适应替代细胞培养设置。

设备或材料的差异可能会影响本协议的性能。如果存在上述差异，并且本协议中指示的细胞孵育条件不会导致高蛋白表达（>5% 表达水平，在 SDS-PAGE 凝胶中可见）和完全裂解，我们建议进行优化循环，其中填充体积并且摇动转速会有所不同，以确定您的设置的最佳条件。对于 GFPuv，每个摇瓶的蛋白质滴度应为 1.9 g/l 或 ~40 mg。

食谱

1. 低盐 LB（Lennox 配方）

10 克胰蛋白胨

5克氯化钠

5克酵母提取物

调整到 1,000 mL 的去离子水和高压灭菌器。

2. AB-2

a. 解决方案1：

500 克葡萄糖

用去离子水和高压灭菌器填充至 1,000 mL。

b. 解决方案2：

41.8 克 Bis-Tris

5.4克硫酸铵

6.2克酵母提取物

3.5克酪蛋白氨基酸

3毫升盐酸

用去离子水和高压灭菌器填充至 910 mL

c. 对于 1 L 的 AB-2，将 90 mL 的灭菌溶液 1 添加到 910 mL 的灭菌溶液 2。

3. 裂解缓冲液

20 mM Tris HCl，pH 8.0

0.1% v/v Triton X-100

每 50 mL 裂解缓冲液添加 1 片蛋白质抑制剂。

致谢

我们要感谢以下支持：DARPA# HR0011-14-C-0075、ONR YIP #N00014-16-1-2558 和 DOE EERE 赠款 #EE0007563、北卡罗来纳州生物技术中心2018-BIG-6503和NIH R61 AI140485-01 。

利益争夺

MD Lynch 在 DMC Biotechnologies, Inc. 拥有财务权益。MD Lynch 和 R Menacho-Melgar 在 Roke Biotechnologies, LLC 拥有财务权益。

参考

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4. Cai, Z., Xu, W., Xue, R. 和 Lin, Z. (2008)。用于高通量筛选的热诱导自溶载体简便、无试剂和原位释放大肠杆菌胞内酶。蛋白质工程 Des Sel 21（11）：681-687。

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