材料和试剂
1. 15 mL离心管（Genesee Scientific，目录号：28-103）
2. 1.7 mL微管（ Geneesse Scientific，目录号：28-281）
3. 过滤器吸头移液器吸头：10 μL （Fisher Scientific，目录号： 02-707-473）、200 μL （Fisher Scientific，目录号： 02-707-478）、1 mL（Fisher Scientific，目录号：2707480）
4. 血清移液管：5 mL（Genesee Scientific，目录号：12-102），10 mL Genesee Scientific，目录号：12-104）
5. TPP 组织培养板，100 mm（ MidSci ，目录号：TP92406）
6. O+ AS-1 包装细胞（州际血库，孟菲斯，田纳西州）
7. IRDye ® 800CW 抗小鼠（Li-Cor，目录号：926-32210，以 1:20,000 用于蛋白质印迹）
8. IRDye ® 680RD 抗兔（Li-Cor，目录号：926-68071，以 1:20,000 用于蛋白质印迹）
9. 兔抗HA抗体（Life Technologies，目录号：715500，以1：100用于蛋白质印迹）
10. 小鼠抗 PMV 抗体（来自华盛顿大学医学院 Daniel Goldberg 的礼物，用于蛋白质印迹的 1:400）
11. V5-Tag (D3H8Q) Rabbit mAb （Cell Signaling Tech, Inc.，目录号：13202S，以 1:1,000 用于蛋白质印迹）
12. 抗 HA 磁珠（Thermo Fisher Scientific/ Pierce TM ，目录号：88836）
13. 二乙烯基砜，97% 刺伤。含0.05％对苯二酚（Thermo Fisher Scientific/Alfa Aesar ，目录号： L12827）
14. 皂苷Quillaja sp.，皂苷元含量20-35％（Sigma，目录号： S4521-10G）
15. 蛋白质样品上样缓冲液，4 × （Li-Cor，目录号： 928-40004）
16. Chameleon Duo 预染色蛋白阶梯（Li-Cor，目录号：928-60000）
17. 2-巯基乙醇（Fisher Scientific，目录号：21985023）
18. 10 × Tris/甘氨酸/SDS缓冲液（Bio-Rad，目录号： 161-0732）
19. 4-20% Mini-PROTEAN ® TGX TM预制蛋白凝胶（Bio-Rad，目录号： 456-1093）
20. Intercept TM封闭缓冲液（Li-Cor，目录号： 927-70003）
21. Odyssey硝酸纤维素膜（Li-Cor，目录号： 926-31092 ）
22. 停止蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Fisher Scientific/Life Technologies，目录号： 78429）
23. HA合成肽（Thermo Fisher Scientific/Life Technologies，目录号： 26184）
24. Simply Blue SafeStain （Thermo Fisher Scientific/Life Technologies，目录号： LC6060）
25. Tris-HCl（Fisher Bioreagents，目录号： 1185-53-1）
26. KCl （Sigma，目录号： 7447-40-7）
27. EDTA（Fisher Bioreagents，目录号： 60-00-4）
28. NP-40（Sigma，目录号： 9002-93-1）
29. Na 2 HPO 4 （Millipore Sigma，目录号：1065861000）
30. KH 2 PO 4 （Millipore Sigma，目录号：529568）
31. NaCl（Fisher Scientific，目录号：BP358212）
32. TRIS 基础（Fisher Scientific，目录号：YBP152500）
33. 甘氨酸（Fisher Scientific，目录号：ALF-036435-A1）
34. 甲醇（Fisher Scientific，目录号：A4081）
35. Tween-20（Fisher Scientific，目录号：BP337-100）
36. 免疫沉淀提取缓冲液（见配方）
37. 免疫沉淀结合缓冲液（见配方）
38. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.4（参见食谱）
39. 蛋白质加载染料（见食谱）
40. 10×传输缓冲区（见配方）
41. 1×传输缓冲区（见配方）
42. 0.1% Tween-20，在 1× PBS 中（见配方）
43. 10× Tris 缓冲盐水 (TBS)（参见食谱）
44. 2 mg/mL HA 肽（见配方）
设备
1. 索瓦尔TM Legend TM XTR 离心机（Thermo Fisher Scientific，型号： 75004506）
2. 奥德赛® CLx成像系统（Li-Cor，型号： 9140）
3. DynaMag TM -2 磁铁（Life Technologies，型号： 12321D）
4. Branson S450D 数字声纳器（Thermo Fisher Scientific，型号： 101-063-593）
5. Mini-PROTEAN Tetra 细胞系统（Bio-Rad，目录号：1658005EDU）
6. PowerPac TM基本电源（Bio-Rad，目录号：1645050）
7. Forma TM Series II 水套式 CO 2培养箱（ ThermoFisher Scientific，目录号：3110）
软件
1. Image Studio 5.x CLx （Li-Cor， https: //www.licor.com/bio/image-studio-lite/ ）

程序
A. 用 DVSF捕获Trx域底物
1. 用 DVSF 孵育细胞
a. 恶性疟原虫寄生虫并表达表位标记的Trx域蛋白的红细胞 (RBC)培养物转移到无菌 15 mL 锥形管中。作为起点，使用 10 mL 的培养物，血细胞比容为 2%，寄生虫血症为 10-15%。
b. 800 ×离心沉淀受感染的红细胞 g 3 分钟。
c. 去除上清液。
d. 使用血清移液器将红细胞重悬在等体积的 PBS 中制备的 3 mM DVSF 或单独的 PBS 作为对照（例如，沉淀 10 mL 培养物，并将细胞重悬在 10 mL 的 3 mM DVSF 或 PBS 中）。
e. 将细胞在 37 °C 下在 CO 2培养箱中孵育 30 分钟。
f. 800 ×离心沉淀细胞 g 3 分钟。
g. 去除上清液。
h. 处理DVSF 上清液。
i. 用 PBS 清洗细胞 3 次，使用等体积的 PBS（例如，如果使用 10 mL DVSF，则使用 10 mL PBS），并以 800 ×旋转 g 3 分钟。
2. 从细胞中提取蛋白质
a. 在 PBS 中制备 0.04% (w/v) 皂苷溶液并在冰上冷却，直到缓冲液冰冷。
b. 通过在 0.04% 皂苷中溶解红细胞来分离寄生虫。
i. mL沉淀的培养物在 1 mL冰冷的皂苷中重悬细胞（例如，在 2.5 mL的皂苷中重悬从 10 mL培养中沉淀的细胞）。
ii. 在冰上孵育 15 分钟。
iii. 以 2,000 ×离心沉淀寄生虫 g 5 分钟，在 4°C。
iv. 去除上清液并用冰冷的 PBS 洗涤两次，使用的 PBS 体积与步骤 A.2.a 中使用的皂苷体积相同，在 2 , 000 ×下进行旋转 g 5 分钟。
c. 在 50-100 μL的蛋白质加载染料中重新悬浮寄生虫。
d. 将寄生虫在 95°C 下煮沸 5 分钟。
e. 在室温下，在台式离心机上全速离心 10 分钟，使不溶性物质（包括寄生虫血红素）沉淀。
f. 将含有提取蛋白质的上清液转移到干净的试管中。
g. 通过蛋白质印迹证明成功的交联：与仅 PBS 的对照样品相比，DVSF 交联的样品应包含一条或多条更高分子量的条带，因为Trx结构域蛋白 + 底物在 SDS-PAGE 期间迁移速度比单独的Trx结构域蛋白（图 1 ）。
i. 30-50 μL的蛋白质样品和蛋白质梯加载到聚丙烯酰胺凝胶中。
ii. 通过 SDS-PAGE 在 180 V 下分离 DVSF 交联和仅 PBS 样品中的蛋白质，持续约 45 分钟，或直到蛋白质梯的条带充分解析。
iii. 将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，在 100 V 下 1 小时。
在涂抹到凝胶上之前在 1 ×转移缓冲液中预润湿来制备膜。
iv. mL的 50% Intercept TM封闭缓冲液（v/v，在 1 × PBS 中制备）在室温下轻轻摇动将膜封闭 1 小时。
v. 去除封闭缓冲液，加入 10 mL用上述 50% 封闭缓冲液制备的一抗溶液。
使用针对感兴趣的Trx结构域蛋白的一抗和上样对照。
vi. 在有盖的容器中，将膜在 4°C 的一抗溶液中孵育过夜，轻轻摇动。
vii. 取出一抗溶液，用 30 mL 的 0.1% Tween-20（v/v，在 1 × PBS 中制备）洗涤 3 次，在室温下轻轻摇晃 10 分钟。
viii. 加入 10 mL 在 50% 封闭缓冲液中制备的二抗溶液，如步骤 A.2.g.iv 中所述。多于。
ix. 在室温下，在有盖的容器中孵育 1 小时，轻轻摇动。
x. 取出二抗溶液，用 30 mL的 0.1% Tween-20（v/v，在 1 × PBS 中制备）洗涤 3 次，在室温下轻轻摇晃 10 分钟。
xi. mL的 1 × PBS清洗膜5 分钟，在室温下轻轻摇动。
xii. ®对膜进行成像 CLx成像系统可将蛋白质与感兴趣的Trx结构域蛋白质的交联可视化。

图 1. DVSF 交联将氧化还原伙伴捕获到恶性疟原虫 Trx结构域蛋白。
寄生虫在 37°C 下与 3 mM DVSF 孵育 30 分钟，然后通过蛋白质印迹提取和分析蛋白质。寄生虫表达表位标记的A.) Pf J2 或B.) Pf PDI8。 Plasmepsin V ( Pf PMV ) 用作上样对照，并用作非Trx结构域蛋白，证明了 DVSF 的特异性。
B. 免疫沉淀具有捕获底物的Trx结构域蛋白
1. 从寄生虫中提取蛋白质
a. 使用 0.04% 皂苷执行 DVSF 交联和分离寄生虫，如上文 A 节所述；重要的是，包括 PBS-only 控制寄生虫。对于质谱蛋白质鉴定的免疫沉淀，我们从 1 × 10 9寄生虫开始，并根据需要放大或缩小。
b. 将寄生虫颗粒重新悬浮在 300 μL的提取缓冲液中，然后加入 15 μL的 10% NP-40 和 3 μL的 HALT 蛋白酶抑制剂。
c. 在冰上孵育 15 分钟。
d. 通过超声裂解寄生虫。
i. 以 10% 的振幅对寄生虫进行 5 秒的声波处理。
ii. 让样品在冰上停留 30 秒。
iii. 重复步骤 B.1.di 和 -ii 两次，共进行三轮超声处理。
e. 在设置为 4°C 的台式离心机上全速离心裂解物 15 分钟。
f. 将含有提取蛋白质的上清液转移到新试管中。
g. 对步骤 B.1.e 中的颗粒进行第二次提取。
i. 将 300 μL的提取缓冲液和 3 μL的 HALT 蛋白酶抑制剂添加到颗粒中（第二次提取时不使用 NP-40）并立即进行超声步骤，无需在冰上孵育 15 分钟。
ii. 如步骤 B.1.ae 中所述进行超声处理和离心。
h. 将上清液与从步骤 B.1.f 中提取的蛋白质混合。
i. 将 60 μL混合上清液转移到干净的试管中作为“输入”样品并储存在 -20°C。
2. 免疫沉淀 HA 标签蛋白
a. 准备 Pierce 抗 HA 磁珠。
i. 将 25 μL的珠浆转移到干净的 1.5 mL离心管中。
ii. 加入 175 μL结合缓冲液，轻弹试管进行混合，然后短暂离心以收集试管底部的所有液体。
iii. 将试管插入磁架，待珠子收集到试管一侧后取出缓冲液。
iv. 取出管子，在珠子中加入 1 mL的结合缓冲液。
v. 旋转您手中的管子以混合珠子和缓冲液，持续 1 分钟。
vi. 使用磁性架从珠子中取出缓冲液。
b. 将步骤 B.1.h 中提取的蛋白质添加到珠子中。
c. 在室温下颠倒旋转孵育 30 分钟（或在 4°C 下过夜）。
d. 将管子短暂离心以将所有液体收集到底部，然后使用磁力架将未结合的蛋白质样品从珠子中取出；将此样品保存在标有“未绑定”的试管中。
e. 用结合缓冲液清洗珠子 3 次，如有必要，将每次清洗的缓冲液保存起来用于下游分析。
i. 将珠子重新悬浮在 300 μL的结合缓冲液中，并使用磁架从珠子中取出缓冲液。
ii. 再重复步骤 B.2.ei 两次，总共洗涤 3 次。
f. 使用 HA 肽从珠子中洗脱蛋白质。
i. 将珠子重新悬浮在 30 μL的 2 mg/mL HA 肽中。
ii. 在 37°C 下摇动孵育 5 分钟。
g. 使用磁力架将洗脱的蛋白质从珠子中分离出来，并将洗脱的蛋白质保存在标有“洗脱”的管中。
C. 从丙烯酰胺凝胶中提取交联蛋白用于蛋白鉴定
1. 在上述步骤 B.2.g 中收集的5 μL蛋白质梯和免疫沉淀蛋白质的“洗脱”样品装入聚丙烯酰胺凝胶的孔中。
2. 通过 SDS-PAGE 在 180 V 下将样品中的蛋白质分离约 45 分钟，或直到蛋白质阶梯充分解析。
3. 用 SimplyBlue SafeStain或其他考马斯染料染色凝胶中的蛋白质（图 2 ）。
a. mL去离子水冲洗凝胶 3 次。
b. 添加大约 20 mL的 SimplyBlue SafeStain或足够的染料以完全覆盖凝胶，并在室温下孵育 1 小时，同时轻轻摇动。
c. 去除污渍并在室温下用 100 mL去离子水清洗凝胶 1 小时，同时轻轻摇动。
d. 1 小时后，加入 20 mL的 20% NaCl（w/v，在去离子水中制备）并在室温下轻轻摇动继续孵育 2 小时或过夜。

图 2. DVSF 交联蛋白在提取之前对质谱蛋白进行鉴定的考马斯染色。
将表达表位标记的Pf J2 的寄生虫与 3 mM DVSF 在 37°C 下孵育 30 分钟，然后从寄生虫裂解物中免疫沉淀Pf J2。使用 SDS-PAGE 分离免疫沉淀的蛋白质并用 SimplyBlue SafeStain染色。黑色虚线框表示为蛋白质鉴定而提取的 DVSF 处理泳道中的凝胶区域。红色虚线框表示在 PBS 处理的泳道中提取的凝胶区域，作为蛋白质鉴定的对照。
4. 使用干净的剃须刀片，从凝胶中提取交联蛋白条带（即，提取凝胶中比非交联蛋白高的条带）。
5. 从仅含 PBS 的对照样品中凝胶的等效区域提取切片（例如，在仅含 PBS 的样品中提取一条 100 kDa的交联蛋白条带，并在 100 kDa处提取等量大小的凝胶片） .
6. 将凝胶切片转移到 1.5 mL离心管中。
7. 对凝胶切片中的蛋白质进行脱色。
用 30% 乙醇（v/v，在去离子水中制备）孵育 15 分钟，或直到凝胶切片不再染色，在室温下轻轻旋转。
8. 识别每个凝胶切片中存在的蛋白质，无论是在内部还是通过质谱服务。
9. 通过从 DVSF 交联样品中识别的蛋白质中消除仅 PBS 凝胶切片中识别的蛋白质，识别潜在的Trx结构域底物。
笔记
我们描述了使用 DVSF 来捕获、提取和识别恶性疟原虫寄生虫中的Trx域底物，但该协议的组件很容易适应其他生物体。因此，蛋白质提取、免疫沉淀和蛋白质印迹的细节应适应个别研究人员对其特定生物体的工作流程。
食谱
1. 免疫沉淀提取缓冲液
40 mM Tris-HCl pH 7.4
150 毫米氯化钾
1 M 乙二胺四乙酸
1 × HALT 蛋白酶抑制剂
0.5% NP-40 (v/v)
2. 免疫沉淀结合缓冲液
20 mM Tris-HCl pH 7.4
150 毫米氯化钾
1 毫米乙二胺四乙酸
1 × HALT 蛋白酶抑制剂
0.1% NP-40 (v/v)
3. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，pH 7.4
3.2 毫米钠2 HPO 4
0.5 毫米 KH 2 PO 4
1.3 毫米氯化钾
135 毫米氯化钠
4. 蛋白质负载染料
120 μL 4 × Li-Cor 蛋白上样缓冲液
20 μL 2-巯基乙醇
5. 10 ×传输缓冲器
30.3克TRIS基础
144.1克甘氨酸
用 Milli-Q 或去离子水加至 1 L。
6. 1 ×传输缓冲器
100 mL 10 × Transfer Buffer
200 毫升甲醇
700 毫升 Milli-Q 或去离子水
7. 0.1% Tween-20，在 1 × PBS中
将 1 mL 的 Tween-20 添加到 1 L 的 1 × PBS中
8. 10 × Tris 缓冲盐水 (TBS)
87.7 克氯化钠
100 mL 1 M Tris-HCl，pH 7.5
Milli-Q 或去离子水至 1 L
使用前稀释至1 ×
9. 2 毫克/毫升 HA 肽
HA 合成肽在 1 × TBS 中重组为 2 mg/ mL 的浓度。
致谢
我们感谢 Dan Goldberg 提供的抗 PMV 抗体。这项工作得到了 ARCS 基金会对 DWC 以及美国国立卫生研究院对 DWC (T32AI060546) 和 VM (R01AI130139) 的奖励的支持。
利益争夺
作者宣称没有利益冲突。
参考
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