材料和试剂
50 m L锥形管（无菌）（ Genesee ，目录号：28-106）
15 m L锥形管（无菌）（ Genesee ，目录号：28-103）
9” 玻璃巴斯德移液器（ Daigger ，目录号：EF20402C）
10 m L血清移液管（Genesee ，目录号：12-104）
5 m L血清移液管（Genesee，目录号：12-102）
6孔组织培养板（ Diagger ，目录号：EF24881）
通风组织培养瓶（ Genesee ，目录号：25-209）
96孔圆底板（Genesee，目录号：25-109）
1.1 m L聚丙烯管（USA Scientific，目录号：1412-1000）
流式细胞术的5 m L圆形底管（VWR，目录号：60819-728 ）
16 m L无菌聚苯乙烯培养管（Genesee ，目录号：21-129 ）
小鼠 IgG1 同型对照 SAFIRE (Bio-gems, 44212-25)
全血或“血沉棕黄层” （即离心后全血中富含 PBMC 的部分）
Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare，目录号：17-1440-03）
1 ×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（VWR，目录号：95042-486）
ACK 裂解缓冲液（VWR，目录号：10128-806）
RPMI-1640 带/ 谷氨酰胺（VWR，目录号：95042-508）
（ Milipore Sigma，目录号：F0926-500）
青霉素-链霉素（Thermo Fisher，目录号：15140163）
台盼蓝4克/升（VWR，目录号： K940-100ML）
Immunocult CD3/CD28/CD2 T 细胞激活剂（Stem Cell Technologies，目录号：10970）
抗人CD3抗体，克隆HIT3a NA/LE（BD Biosciences，目录号：555336）
抗人CD28抗体（BD Biosciences，目录号：555725）
抗CD3抗体OKT3（Bio-gems，目录号：01521-05）
重组人IL-2（ Peprotech ，目录号：200-02）
碘化丙啶（Thermo Fisher，目录号：P1304MP）
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucelofactor X Kit L（Lonza，V4XP-3024）（包括：Lonza P3 缓冲液、Lonza 移液器和 Lonza 比色皿）
RoboSep TM缓冲液（Stem Cell Technologies，目录号：20104）
人 CD8 + T 细胞分离试剂盒（Stem Cell Technologies，目录号：17953）
TIM-3 siRNA（Thermo Fisher，目录号：4392420）（储存在-20 °C ，分装）
非特异性siRNA对照（Thermo Fisher，目录号： 12935300 ）（储存在-20 °C ，等分）
TIM -3 阻断单克隆抗体，克隆 F38-2E2（ Biolegend ，目录号：35004）
重组人 Tim-3-FC Chimera（R&D Systems，目录号：2365-TM-050）
200 Proof Ethanol（ Decon Labs Inc.，目录号：2716）
超纯水（大学提供）
70% 乙醇（见配方）
完整的 RPMI 媒体（参见食谱）
不含抗生素的 RPMI 培养基（见配方）
重组人 IL-2 溶液 (rIL-2)（见配方）
siRNA 等分试样（参见食谱）
PI 解决方案（参见食谱）
设备
离心机Sorvall Legend X1XTR（Thermo Fisher，目录号：75004539）
II A2 级生物安全柜（用于无菌工作流程）
Accuri C6 流式细胞仪（Becton Dickenson）
Vortex- Genie 2（Scientific Industries Inc.，目录号：SI-0236）
4D Nucleofector TM核心单元和 4D Nucleofector TM X 单元（Lonza，目录号：AAF-1002B 和 AAF-1002X）（包括：Lonza 比色皿支架）
“The Big Easy” EasySep TM磁铁（Stem Cell Technologies，目录号：18001）
移液器辅助工具（Genesee，目录号：33-901）
壳牌实验室37°C 水浴（Sheldon Manufacturing Inc.，目录号：SWB15）
Heracell TM 150i 5% CO 2培养箱（Thermo Fisher，目录号：50116048）
细胞计数器或血细胞计数器
软件
Accuri C6 流式细胞仪软件 (Becton Dickenson)
FlowJo（Becton Dickenson， https: //www.flowjo.com/ ）
程序
Ficoll分离外周血单个核细胞
，来自一名患者的呈血沉棕黄层或全血样本管（例如ACD 管）形式的样本将被称为“供体”。描述了 25 mL的单个血沉棕黄层供体的处理步骤。然而，我们已经使用这种可扩展的协议来处理多达 15 个独特的供体（8–30 mL 全血）同时。除离心（封闭管）外，所有步骤均在无菌生物安全柜 (BSC) 中进行。 PBMC 的分离可以通过其他技术加速[例如， SepMate管 ( StemCell Technologies) 或 CPT 管 (Becton Dickinson)]。然而，根据我们的经验，此处描述的Ficoll协议通过比较提供了最佳的纯化和产量。
用 70% 乙醇准备和消毒材料以用于无菌 BSC ：9 英寸玻璃移液器吸头、 Ficoll Plus、50 m L锥形离心管、1 × PBS、ACK 裂解缓冲液和供体样品。放置完整的 RPMI 媒体在37°C的水浴中。
将 25 m L的供体样品倒入标有 50 m L的离心管中。
稀释供体样本 1:1与1 × 无菌PBS ：将我们的 PBS 倒入 50 mL离心管中，直到达到 50 mL标记。
盖上试管并倒置 4-6 次以混合样品和 PBS。
将一半的PBS /血液混合物倒入另一个标有 50 mL 的离心管中，使每个离心管含有 25 mL 。
将一根玻璃巴斯德移液器放入每个 50 m L离心管中，使移液器的尖端接触管的底部。
使用 10 m L血清移液器吸头和Pipette Aid 将 13 m L Ficoll Plus 通过巴斯德移液器分配到每个 50 mL 管中（一次加入3 ml Ficoll等分试样的吸管，重复直到添加13 mL），如图 2 和视频 1 所示，在样品/PBS混合物顶层下创建一个清晰独特的Ficoll底层。
注意：用Ficoll梯度填充巴斯德移液器可能会很慢而且很棘手。 9英寸巴斯德移液器一次准确填充 3 mL ，但排液速度较慢，以在每支管的底部获得不受干扰的Ficoll层。此外，应小心将血清移液器吸头轻轻放在巴斯德移液器上，以免损坏巴斯德移液器。当 13 mL已排至 50 mL离心管底部时，应将巴斯德移液器轻轻向上拉至 50 mL离心管的一侧并缓慢移出，以免干扰梯度并让任何残留的Ficoll进入移液器排至底座。

图 2.为 PBMC 隔离添加Ficoll 。
A.描述了Ficoll分布的设置。两个 50 mL 离心管具有等量的样品/PBS 混合物。巴斯德移液器置于混合物中，使吸头位于试管的锥形部分。将 10 mL 血清移液器装满Ficoll ，轻轻放在巴斯德移液器的开口处，缓慢地放置 3 mL Ficoll或直到移液器充满。重新填充血清移液管和以不超过 3 mL 的增量分配Ficoll的过程一直进行到每个离心管中存在 13 mL。 B.步骤s A7 和 A8的最终产品应该类似于这个面板。巴斯德移液器缓慢移出，以免干扰底部的Ficoll 。 Ficoll中只有少量 RBC 。溶液现在能够缓慢地转移到离心机中。

视频 1. Ficoll技术从人类血沉棕黄层中分离 PBMC。
缓慢取出巴斯德吸管后，轻轻盖上离心管，以免干扰Ficoll 层在底部。
将50 m L离心管轻轻放入离心机（摆动斗式转子，每侧平衡）并在室温下以2,000 RPM旋转20 分钟（全速加速，不减速）。
注意：快速减速和制动可能会中断这 Ficoll梯度；因此，离心机转子应自然减速，无需制动。
当管子旋转时，标记另一组无菌 50 m L 离心管。
小心地取回试管并带回 BSC 以打开盖子。
注意：在Ficoll梯度上离心分离后，PBMC 层（即血沉棕黄层）对摇晃和干扰极为敏感。将PBMC 50 m L管放在架子上往返离心机，并在取回 PBMC 时避免在梯度中意外混合层（即，不要从移液器中排出液体）。
使用 5 m L血清移液器吸头，轻轻收集血浆：Ficoll梯度界面处的 PBMC 白色层，并将其放入新的50 m L离心管中，如图 3 所示。尽量减少回收体积，避免Ficoll和红细胞/粒细胞沉淀。
注意： Ficoll梯度产生四个不同的层，可以根据实验设置和兴趣保留用于不同用途。从上到下，顺序如下：血浆/PBS、PBMC、 Ficoll 、红细胞/粒细胞沉淀。有时，红细胞可能会残留在 PBMC 层中并导致浅红色变色。 ACK 裂解缓冲液用于消除这些残留的红细胞。小心移液，避免在 PBMC 层中转移任何部分的沉淀或红细胞“块” 。

Ficoll分离后 PBMC 层的分离。
A.通过离心形成Ficoll梯度后，白色 PBMC 层将变得明显（如红色箭头所示）。 PBMC 层应该有很少的 RBC。 B.可以通过使用 5 mL 血清移液器吸头并将吸头小心地放在 PBMC 层的顶部，缓慢去除它，同时避开血清（上图）和Ficoll （下图），可以去除白色 PBMC 层。倾斜管子可能会有所帮助。
如果界面处可见残留的 PBMC，则重复步骤 A12 ，并将所得结果放入同一离心管中（每管总体积 <8–10 m L）。用Ficoll丢弃原来的试管，除非您还收集血浆（顶部）和/或粒细胞（颗粒）以供额外使用。
×填充新的PBMC 管无菌PBS 直到达到 50 m L线。
以1,400 ×离心管 g在室温下10 min （全速加速，并从该点向前减速）。
在此旋转过程中，在BSC中标记另一组50 m L离心管为每个供体/样本创建两组离心管。
尽量不干扰颗粒，将最近离心管的一半内容物倒入新标记的管中（每管约 25 m L ）。用 1 × PBS填充至 50 m L标记。
重复步骤A14。
注意：由于Ficoll的密度较大，在 PBS 洗涤步骤（A12 – 15）期间离心时，PBMC 层去除的多余Ficoll会阻止 PBMC 的正常沉淀。如果离心后洗涤液仍然混浊，将上清液倒入单独的试管中，在 PBS 中进一步稀释，然后重复离心以最大化 PBMC 回收率。
从每个 50 m L离心管中吸出上清液，不要干扰 PBMC 颗粒，根据残留红细胞的存在，PBMC 颗粒可能呈现白色、粉红色或红色。
将颗粒重新悬浮在总共 5 m L的 ACK 裂解缓冲液中。在室温下孵育5 分钟。
注意：如果ACK 裂解后PBMC 颗粒中仍然存在红色色调或条纹，则可以重复此步骤。然而，进一步的孵化会降低 PBMC的恢复。
× PBS将 50 m L离心管填充到 50 m L标记处。
以1,400 ×离心管 G 在室温下放置 10分钟。
吸出上清液并将白色 PBMC颗粒重新悬浮在10 m L的完整 RPMI 介质中。
使用血细胞计数器或自动细胞计数器对培养基中的 PBMC 进行计数，根据需要稀释以获得准确的细胞计数。使用 1:1 稀释的台盼蓝来区分活细胞（白色/透明）与死细胞（蓝色）。
笔记：
L的血沉棕黄层中分离细胞时，我们通常回收150-9 亿个 PBMC （平均约400-5亿个）。因此，所有 PBMC的50 mL稀释液过于浓缩，无法进行准确的细胞计数。因此，如果血沉棕黄层是PBMC 的主要来源，我们建议将该溶液的 10 μL等分试样进一步稀释 1:10。从全血中回收的 PBMC 通常较低（ 1 × 10 6 – 2 × 10 6细胞/毫升血液）。在血细胞计数器中仍可能看到残留的红细胞；如果过量，可能需要额外的 RBC 裂解。
PBMC 也可以作为一个整体进行刺激和培养，在具有适当 rIL-2 浓度的完整 RPMI 培养基补充剂中保持在 1 × 10 6 – 2 × 10 6 个细胞/ mL之间，并在所需的激活后日期用于 RICD 测定.
中纯化静息 CD8 + T 细胞
+ T 细胞分离试剂盒说明书中描述的几乎相同( https://www.stemcell.com/easysep-human-cd8-t-cell-isolation-kit .html#section-related-products ) ，假设平均输入 5 亿个 PBMC。我们还分离了 CD4 + T 细胞、幼稚细胞和其他 T 细胞群以测试 RICD 敏感性。
注意：平均而言，我们使用250-5 亿个 PBMC在5-10 mL的RoboSep TM缓冲液中分离出15-4000万个CD8 + T细胞。也可以使用干细胞技术EasySep TM缓冲液或PBS （尤其是稀释时）。
准备BSC所需的材料： EasySep TM磁铁、16 m L细胞培养管和RoboSep TM缓冲液。
以1,400 ×离心PBMC g在室温下5 分钟。
吸出培养基上清液并在5 mL RoboSep TM 缓冲液中重悬沉淀（浓度= 5 × 10 7 PBMC / mL）。
将细胞悬液转移至16 m L 无菌培养管。
加入 50 μL /m L CD8 + T 细胞分离鸡尾酒（总计= 500 μL ）。吸管上下混合。
在室温下孵育 5 分钟。
涡旋RapidSpheres TM持续 30 秒。
将 50 μL /m L RapidSpheres TM添加到溶液中（总计= 500 μL ）。吸管上下混合。
在室温下孵育 3 分钟。
将未加盖的溶液管放入EasySep TM磁铁中。在室温下放置 3 分钟。
在不移除或干扰磁铁管的情况下，小心地将内容物（即分离的CD8 + T 细胞）倒入一个新的 15 m L锥形管中。
以 90 ×离心分离的 CD8 + T 细胞 g在室温下放置 10分钟。
将 CD8 + T细胞沉淀重悬在 10 m L 完整的 RPMI培养基中并计数细胞（参见步骤 A24）。
激活、修饰和培养 CD8 + T 细胞
*我们实验中使用的刺激剂通常是 Immunocult Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator ，在以下步骤中引用。但是，注释中讨论了其他刺激剂。
未修饰的 CD8 + T 细胞的激活和培养
CD8 + T 细胞调整为2 × 10 6 细胞/m L在完全 RPMI 培养基中。
以 25 μL / m L添加活化剂Immunocult 。使用血清移液器，上下吹打轻轻混合，然后转移到通风的组织培养瓶中。
注意：我们实验室使用Immunocult抗CD3/CD28/CD2 激活试剂来强烈刺激CD4 +和 CD8 + T 细胞。然而，我们使用了许多不同的激活刺激，从珠子交联或板结合抗CD3/CD28、抗CD3/CD28 Dynabeads 、自制磁珠或 PMA/离子霉素（一种绕过 TCR 参与的方法）到刺激 T 细胞。可溶性抗 CD3/CD28 抗体 (Abs) 在没有带有 Fc 受体的辅助细胞的情况下不能对纯化的 T 细胞提供足够的刺激，并且只能在未分级的 PBMC 中刺激 T 细胞时使用（Katz和 Snow ，2013 年）。
将组织培养瓶置于5% CO 2 37°C培养箱。
台盼蓝计数细胞 24 小时后。将完整的RPMI培养基添加到混合物中，以达到1 × 10 6 个细胞/毫升的细胞浓度。
继续培养直到第3 天，维持细胞浓度在 1 × 10 6 – 2 × 10 6 个细胞/毫升之间。
注意：激活后监测细胞对于确保正确激活很重要。通过流式细胞术可以观察到第 1 天 CD69 和第 2-3 天 CD25 的存在。未正确爆破的细胞，即尺寸未增加且未结块的细胞，可能会导致 RICD 结果出现偏差。
台盼蓝计数细胞。开始加热完整的 RPMI 培养基（在 37°C 水浴中）并在冰上解冻重组 IL-2 (rIL-2) （单个等分试样 = 3 × 10 5 U/ m L）。
注意： IL-2 是 T 细胞增殖的重要补充，因为激活后 2-3 天 IL-2 受体 (CD25) 上调。快速扩增将在第 7-10 天发生，需要每天监测培养基颜色和细胞密度。如果整个 PBMC 群被激活，添加 IL-2 将导致大量 CD4 +和 CD8 + T 细胞的积累。
将CD8 + T 细胞转移到适当的无菌管中，并以 1,400 ×离心 G 在室温下5分钟。
5 mL的 1 × PBS中吸出上清液并重悬细胞。填充离心管的其余部分。
重复步骤 C1g。
在完全 RPMI 培养基中以 1 × 10 6 个细胞/m L吸出上清液并重悬细胞，并辅以100 U/ m L的rIL 2（1:3,000 稀释度）。
24 小时后用台盼蓝计数细胞以准备RICD测定（第4 天：早期阶段），或通过将细胞保持在 1 × 10 6 – 2 × 10 6 个细胞/m L在完全 RPMI 培养基+ 100 U/ m L rIL-2 中。必要时将细胞悬液移至额外/更大的通风组织培养瓶中。
激活和培养修饰的 CD8 + T 细胞
* 在这里，我们描述了我们在单个供体中使用对照 [非特异性(NS) siRNA]与TIM-3特异性siRNA 对人类原代 CD8 + T 细胞进行 siRNA转染的方案。该协议还适用于更多的供体和/或涉及额外siRNA或其他修改（如 CRISPR ）的条件（Seki等人，2018 年）。使用的所有siRNA均保持在 50 μM并冷冻在10 μL等分试样中（请咨询提供公司以了解可用的 siRNA 浓度）。我们通常转染1 × 10 7 每个条件百万CD8 + T 细胞，但我们用更少的细胞（5 - 8 百万）实现了合适的击倒结果。
将 CD8 + T 细胞以 2 × 10 6 个细胞/ mL置于无抗生素培养基中（ RPMI + 10% FCS）在通风的组织培养瓶中，在 37°C的培养箱中培养30 分钟。
注意： CD8 + T 细胞在激活前在37°C培养箱中相对稳定。我们在激活前将未受刺激的CD8 + T 细胞在培养箱中静置至少 3 天，激活电位和表型没有大的变化。 PBMC 可以耐受过夜，尤其是 T 细胞，但这些单核细胞可能粘附到烧瓶上会限制可恢复性。
在此期间，为 siRNA 核转染准备和消毒BSC 中的材料：2 个 Lonza 比色皿、2 个 Lonza 移液器和一个 Lonza 比色皿支架。在冰上解冻 siRNA 等分试样（每个 500 pmol ）。
准备一个 6 孔细胞培养皿，每个供体每个条件下使用 3 mL 的无抗生素 RPMI 培养基：一个条件用于控制，一个条件用于有针对性的击倒。放入5% CO 2 37°C培养箱直至准备就绪。
以 90 ×离心2 × 10 7 CD8 + T 细胞 g在室温下放置 10 分钟。
在离心过程中，将 Lonza P3 缓冲液放在工作台顶部以温至室温。
将细胞样品与 Lonza P3 缓冲液、细胞培养板和解冻的NS和 TIM-3 siRNA等分试样一起放入引擎盖中。
从CD8 + T细胞沉淀中吸出培养基，并以每 1 × 10 7 个细胞90 μL重悬于 P3 缓冲液中，轻轻上下吹打一次或两次。
将90 μL的 P3 细胞/缓冲溶液转移到含有10 μL等分NS siRNA 的管中，并立即将 100 μL 体积直接转移到Lonza比色皿中。
重复 TIM-3 siRNA （或对另一个靶基因特异的 siRNA）。
在以下条件下将每个比色皿放入Lonza 4D Nucleofect和nucleofect中：缓冲液：缓冲液 – P3，程序： – 人， unstim HF。成功完成核转染程序后，将试管返回引擎盖。
使用 Lonza移液管，在一个动作中，从细胞培养板的适当孔中吸取约 100 – 200 μL培养基，将其逐滴添加到比色皿中，取回整个培养基/P3 缓冲液溶液并逐滴返回细胞培养板的同一孔中。虽然这一步是时间紧迫的，但同样必须轻柔地处理细胞以避免破裂和死亡。根据需要在单独的孔中重复额外的比色皿。
在步骤 C1b 继续。
电镀 T 细胞用于 RICD 检测
* 该测定以 1 × 10 6 个细胞/ mL运行。每个条件需要 1.2 × 10 6 个细胞和 1.2 mL培养基；额外的细胞（相应体积中的 1.3 × 10 6 – 1.4 × 10 6细胞）对于确保足够量的溶液非常有帮助，无论移液错误等如何。此处假设用于重新刺激 T 细胞的抗 CD3 OKT3 的最终浓度为 100 ng/m L。可以使用药理抑制剂或阻断抗体，并在再刺激前 1 小时给药。 TIM-3 阻断抗体、IgG1 同种型对照和嵌合蛋白以 10 μg / mL使用。
台盼蓝计数 CD8 + T 细胞。
收集所需的CD8 + T 细胞，并以1,400 ×离心机设置 G 在室温下5分钟。
在旋转过程中，准备足够加温的完整 RPMI 培养基，辅以100 U/ m L IL-2，并将所需材料带入BSC ：96孔圆底组织培养板、补充培养基和抗 CD3 （ OKT3 单克隆抗体）。
μL的介质中吸出介质并将沉淀的 CD8 + T 细胞重新悬浮。
将100 μL的细胞悬浮液添加到96 孔板的每个孔中，如图 4 所示（共 6 个孔）。该测定以一式三份运行每个条件，未刺激或用OKT3 再刺激。
注意：使用一系列 OKT3 再刺激浓度(~ 1–1,000 ) ng/m L 可能有助于产生剂量依赖性RICD 反应，观察到24 小时后通过 PI 染色观察到的细胞损失百分比增加。我们建议在未修饰的活化 CD8 + T 细胞中观察剂量曲线，然后在所选浓度下进行实验。

图 4. 96 孔板中的 RICD 检测设置。 RICD 测定应以存在两种类型对照的方式制定。
对照条件，由未改变的细胞或对照处理（例如转染的非特异性 siRNA）和未添加 OKT3 的对照三份组成。每个条件，对照或实验，将由六个孔组成：三个包含 OKT3，三个不包含它。可以将任意数量的条件添加到板中。使用 Biorender.com 创建的图。
笔记：我们没有包括完整的 96 孔板，以节省空间并能够清楚地识别适用/使用的孔。
+ T 细胞的每个条件重复。
将完整 RPMI 介质中的 OKT3 稀释至200 ng / mL浓度。
将100 μL的OKT3溶液添加到适当的孔中（100 ng/ m L 最终浓度）。对于未受刺激的控制井，添加 100 μL的完整 RPMI 培养基。
将 96 孔板放入5% CO 2 37°C培养箱24 h 。
注意： PI+ 细胞通常在再刺激后 18 小时出现，但我们在大约 24 小时后运行检测，而细胞损失没有任何大的差异。
读取和量化 RICD 检测
打开并初始化Accuri C6 流式细胞仪（或选择的流式细胞仪）。
使用1 μg/ mL碘化丙啶(PI)溶液，在工作台上的 96 孔板中的每个孔中添加 10 μL 。
注意：碘化丙啶在 488 nm 处被激发，最大发射波长约为636 nm ，具有可渗入其他通道(FL-3) 的宽发射光谱。如果同时使用其他染色剂/荧光染料，则应考虑这一点。
用 200 μL移液器彻底混合孔。为提高效率，首选12 吸头多道移液器。
将所有井转移到相应的 1.1 m L聚丙烯管中。
准备Accuri采集模板和门控策略如下：
注意：我们分析中使用的图 1 有助于确保我们可视化适当大小的细胞并以此为基础衡量细胞活力。 SSC 是侧向散射，通常用于解释细胞的内部复杂性（形状和粒度）。 FSC 是前向散射的，可用于解释细胞大小。这些参数一起有助于显示细胞样品的相对活力和纯度，以进行质量控制。该图还可用于辨别 PBMC 中的不同细胞群。图 2 显示了死细胞的阳性 PI 染色与细胞大小的关系，这是我们的量化统计数据的来源。 PI 染色不是双峰的，因为 PI 阳性染色可以具有平均荧光强度 (MFI) 增加的梯度。第三个图，FSC-H 与 FSC-A，可用于在数据分析之前排除细胞重复。
阈值：事件> 1,000,000 FSH-H
点图 1：FSC与 SSC
点图 2： PSC 与FL-2 (PI)
将每个 1.1 m L 管放入圆底 5 m L 流式细胞仪样品管中。在将每个样品放置在Accuri C6 SIP上之前，对每个样品进行短暂涡旋（1 – 2 秒）。
以最慢的流速采集 5 秒的样本数据。
中的活 CD8 + T 细胞群上适当地定位细胞和门。示例如图 3所示。
根据情节 2 中的活细胞门，重复运行第一个样本以收集~ 15,000 个事件。记录这次采集的秒数。
将 C6 设置为在上一步中确定的固定时间量内从每个后续样本中获取数据。时间是关键的度量，它在一个条件的持续时间内保持不变，但可能会在不同的条件下发生变化。这允许再现性和实验连续性。
注意：使用我们的示例，我们有两个条件：非特异性 siRNA 对照细胞和 TIM-3 KD 细胞。每个条件将有六个孔，三个没有抗 CD3，三个有。在 FL-2 与 FSC 图的活细胞门中达到约 15,000 个事件的时间将使用一式三份的第一个非特异性 siRNA 样品（不含抗 CD3）记录。这段时间现在用于在剩余的两个没有抗 CD3 的孔中获取活细胞事件，并用抗 CD3 进行三次。下一个条件将重复计时过程，不需要与前一个条件相同。然而，条件之间的时间（> 20 s）的较大变化可能表示细胞浓度不准确和结果偏斜。
+ T 细胞的每个条件重复步骤 E6-E10 。
数据分析
RICD 分析如前所述并已发表（卡茨和斯诺，2013 年）。分析涉及计算在再刺激条件下与未再刺激条件相比活细胞的百分比损失，从而提供最准确的细胞死亡评估。记录的事件可以从Accuri C6 程序中从数据采集期间建立的门中提取，或者从使用另一个分析程序（如 FlowJo）重绘和建立的门中提取（图 5）。计算如下：
AVG -OKT3 = 在没有 OKT3的可行 FL - 2 门中记录的一式三份事件的平均值
AVG +OKT3 = OKT3 在可行的 FL - 2 门中记录的一式三份事件的平均值
[1-(AVG^(+OKT3))/(AVG^(-OKT3) ) ]×100=% Cell Loss due to RICD
如果在同一三份中记录的事件有很大差异，我们通常会丢弃该实验。这可能由于移液错误、供体变化或材料/试剂变化而发生。 OKT3 是一种抗 CD3 抗体克隆，它在 T 细胞中诱导不同数量的细胞凋亡，这取决于供体和激活后的 RICD 检测天数。早期细胞通常会经历 10 – 25% 的细胞死亡，而晚期细胞的细胞损失可能高达 40 – 80%。在指定时间段内计数活细胞的好处是能够解释因细胞凋亡而死亡和解体的细胞，这些细胞无法被流式细胞仪检测到。与查看阳性细胞百分比或 MFI 变化相比，此方法提供了更高的灵敏度和可重复性。

e 5. 流式细胞仪输出和 RICD 计算。这里展示的是我们的数据分析工作流程，从流式细胞仪到使用活细胞事件进行的 RICD 计算。
A.在 FSC 与 PI (FL-2) 的点图中，显示了早期和晚期 CD8 T 细胞的示例图像（而不是通常获得的一式三份图像）。由于此时 RICD 敏感性增加，在晚期群体中，对于对照和 TIM-3 KD，活细胞数量的较大减少可以被理解。与相应的 -OKT3 图相比，+OKT3 中的活细胞事件减少也可以观察到。与已发表的内容相似，TIM-3 早期阶段的损失加剧了 RICD，而 TIM-3 晚期阶段的损失对 RICD 具有保护作用。 B.典型事件记录和使用上面提供的公式计算细胞损失百分比，以及在 NS（非特异性 siRNA）对照细胞和 TIM-3 KD 之间在激活后第 4 天看到的示例 RICD 敏感性。
食谱
70% 乙醇
700 mL 200 Proof EtOH
300毫升超纯水
完整的 RPMI 媒体
500 m L RPMI-1640 培养基，含谷氨酰胺 (2 nM )
10% 热灭活胎牛血清
1% 笔链球菌
不含抗生素的 RPMI 培养基
没有 Pen Strep 的完整 RPMI 媒体
重组人 IL-2 溶液 (rIL-2)
短暂离心母瓶（快速旋转）以确保所有冻干的 IL-2 都在瓶底。储存在冰上直到第 2 步。
准备一批新的 100 mM 乙酸。使用 0.45 μm注射器过滤器将无菌过滤器 ~5 m L放入锥形管中。
将 2 mL的 100 mM 乙酸添加到母瓶中并上下移液以溶解/混合。当前的 IL-2 浓度 = 0.5 mg/ ml 。放在冰上。
准备 ~40 m L 的新鲜 1 × PBS + 0.1% BSA - 使用0.45 μm注射器过滤器将其消毒到 50 m L 锥形管中。
将 2 m L 的 IL-2 转移到单独的 50 m L 锥形管中，其中包含 31.3 m L 的无菌 1 × PBS + 0.1% BSA。最终 IL-2 浓度 = 0.3 mg/ m L (~3,000 U/ m L)。
稀释的 IL-2 的约 0.5 m L 等分到无菌标记的 1.5 m L 微管中。将等分试样储存在 -80 °C 。
siRNA 等分试样
用无核酸酶的水将冻干的 siRNA 材料复溶至 50 µM。分成 10 μL 等分试样。
PI解决方案
在双蒸水中将 Thermo Fisher 碘化丙啶稀释至 1 µg/m L。避光。
致谢
这项工作是由美国国立卫生研究院 (R01GM05821、R35GM139619 到 ALS) 和统一服务大学的赠款资助的，该研究和协议设计是在那里进行的。我们还要感谢美国国立卫生研究院的献血志愿者和迈克尔莱昂纳多博士获得血沉棕黄大衣。此外，我们感谢我们的实验室成员 Bradley Bauman 、Gina Dabbah和Batsukh博士 Dorjbal对这项工作的支持、批评和帮助。使用该协议的原始研究发表在以下期刊文章中：Lake等人。（2021 年）。
利益争夺
无需声明任何利益冲突。
伦理
匿名、去识别的血沉棕黄层和血液样本是在美国国立卫生研究院血液空白（由迈克尔·莱昂纳多博士提供）的健康志愿者的知情同意下获得的。
参考
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