材料和试剂

体重为200-220g的雌性Sprague-Dawley大鼠*
异氟烷（Baxter S.L，目录号：691477H）
局部镇痛剂布比卡因0.25％（Braun Medical S.A，目录号：671065）
Betadine（Meda Farma Sau，目录号：644625.6）
眼用润滑剂（LabPérezGiménez，目录号：973370）
山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S6021）
来自大鼠血清的白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A6414）
红藻氨酸100mM（Sigma-Aldrich，目录号：K0250）
生物素化半胱天冬酶抑制剂100mM生物素-YVAD-CMK（AnaSpec，USA）
毛细管间隙显微镜载玻片（Dako REAL，目录号：K8020）
荧光素 - 链霉抗生物素蛋白缀合物（BD Pharmingen，Pharmingen</sup>，目录号：554060A-2001）
NeuN（Chemicon International，目录号：MAB377）
山羊抗小鼠IgG二抗Alexa Fluor-568（Life Technologies，Molecular Probes ，目录号：A11031）
Hoechst 33342（Sigma-Aldrich，目录号：B2261）
多聚甲醛
KH ₂ PO ₄
MgSO 4 4 /
NaHCO 3
CaCl <2>
KCl
等容克雷布斯林格碳酸氢盐（见配方）
高渗KRB（参见配方）
等容克雷布斯林格氏碳酸氢盐（KRB）（见配方）
高渗KRB（参见配方）
牺牲麻醉溶液（见配方）

设备

小动物sterotaxic装置（David Kopf，目录号：962）
灌注泵（Bas，目录号：MD-1001）
1ml注射器（Bas，目录号：MD-000）
牙钻和＃1毛刺
Scalpel
麻醉异氟烷蒸发器（Parkland Scientific，目录号：V3000PK）
大鼠耳棒（David Kopf，目录号：957）
大鼠麻醉面罩（David Kopf，目录号：1929-B）
皮下注射针（25 G）
微透析泵（BAS，目录号：MD-1001 Babe Bee）
微透析探头，截止值100.000道尔顿CMA-12 14/02 PES，（CMA，USA）
液体开关阀（Univentor，Zejtun ZTN08，目录号：8401405）
聚乙烯管R3603; 0.38mm ID（Cole Parmer Instruments Co.USA）

实验设置

程序

动物准备
1. 在放入立体定位仪器仪器前，必须麻醉大鼠。将动物放入蒸发器异氟醚盒（呼吸室），并保持直到大鼠完全麻醉。麻醉系统自动地将纯异氟醚溶液与所需比例的氧混合。在实验过程中，使用2％的异氟烷混合物
2. 从头部剃掉头发。
3. 使用大鼠耳杆和大鼠麻醉面罩稳定动物的头部，调整背腹侧-3.0。为了适当地标记微透析探针植入物的坐标，调节门牙棒直到λ和前囱的高度相等。根据Paxinos atlas（Paxinos和Watson，1997），当门牙杆降低到水平零点以下3.3±0.4mm时，实现了这种平坦的颅骨位置。
4. 在眼睛上涂抹眼润滑剂以避免干涸。
5. 借助于棉花尖端，将贝他丁应用于大鼠头部，对皮肤进行净化。
6. 为了避免头颅额外出血，我们在头部中线（0.1-0.2ml）皮下施用血管收缩剂局部止痛剂。
7. 做一个1-1.5厘米切口在皮肤头的中间行。
8. 轻轻刮去骨膜结缔组织后，确定前囟和λ
微透析探针植入
1. 根据Paxinos atlas（Paxinos and Watson，1997），用于植入微透析探头的坐标是： - 前囟后4.6 mm，中线外侧2.5 mm（右半球）， - 中线外侧2.5 mm（左半球）和来自硬脑膜的+ 3.0mm腹侧。
2. 立体地标记这些点，以便钻出骨头用于插入微透析探针。孔必须穿透整个颅骨，而不是硬脑膜。硬脑膜可以用皮下注射针（25G）切割。如果出现小出血，则应用棉绒
3. 将微透析探头安装在探头/导板固定器中，并将其连接到一个sterotaxic操纵器。
4. 将注射器连接到液体开关阀，然后通过500 mm长的聚乙烯管连接到探头的入口导管。
5. 将25 mm的Tygon管连接到探针的出口套管以收集灌注液
6. 在每个半球植入一个探头。
7. 在左半球，我们有两个注射器连接到探针：注射器A充满等张KRB和注射器B与等渗KRB +红藻酸。两者都连接到微透析泵。以1μl/min的流速运行泵。
8. 在右半球，我们还有两个注射器：注射器C充满高渗KRB和注射器B与高渗KRB +红藻氨酸。两者都连接到微透析泵。
9. 在探头植入后立即在左半球开始KRB灌注。丢弃第一个100分钟的灌注（稳定期）。此后，收集基础样品1小时。然后，灌注红藻氨酸60分钟，然后6小时的清洗期。在实验结束时，灌注生物素化的caspase-1抑制剂1小时。相同的协议用于右半球灌注。
10. 每小时收集样品在Eppendorf管中，立即将其转移到-20°C的冰箱进行后期IL-1分析。
11. 缝上皮肤头，将动物转移到笼子过夜。
组织处理和组织学检测caspase-1抑制剂
1. 在先前用50ml等渗盐水灌注洗涤后，通过用250ml的4％多聚甲醛进行心脏内灌注固定，在第二天在深度牺牲麻醉溶液下牺牲动物。
2. 在相同的固定溶液中在4℃下后脑修复24小时，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的30％蔗糖洗涤和冷冻保护组织。冻结组织，切下低温恒温器中海马的厚度为20μm的冠状切片。
3. 在带正电的载玻片（毛细管间隙显微镜载玻片）上装载组织切片，并在95℃下用10mM乙酸钠（pH 6.0）处理4分钟以进行抗原修复。
4. 在荧光素 - 链霉亲和素结合物（1:200）中孵育切片用于胱天蛋白酶-1抑制剂的荧光染料检测。
5. 对于使用神经元标记物的双染色，在用PBS中的0.1％Triton X-100中的5％正常山羊血清预先处理后，孵育具有抗神经元核初级抗体NeuN（1:500）的切片。
6. 用Alexa Fluor-568山羊抗小鼠IgG二抗（1:400）孵育切片
7. 盖玻片在含有对苯二胺和双苯酰亚胺的培养基（Hoechst 33342）中进行细胞核检测。
  注意：本工作中使用的所有程序均符合欧盟理事会指令（86/609/EEC）。该方案由医院"Ramóny Cajal"动物实验伦理委员会（动物设施ES280790002001）批准。

食谱

等张克雷布林格氏碳酸氢盐（KRB）
0.4mM KH 2 PO 4 sub/
1.2mM MgSO 4 25mM NaHCO 3/v/v 1.2mM CaCl 2 3 mM KCl
0.5 mg/ml大鼠白蛋白
高渗KRB
0.4mM KH 2 PO 4 sub/
1.2mM MgSO 4 25mM NaHCO 3/v/v 1.2mM CaCl 2 3 mM KCl
20％山梨醇 0.5 mg/ml大鼠白蛋白
牺牲麻醉溶液
0.4-0.5ml /大鼠制备的混合物如下：
0.5毫升氯胺酮（50毫克/毫升） 0.4ml缬氨酸（4mg/ml） 0.1ml阿托品（1mg/ml）

致谢

该协议已经从先前发表的文章改编而来：Compan em et al。（2012）。这项工作得到了来自PN I + D + I 2008-2011 - Salud Carlos III-FEDER（EMER07/049和PI09/0120）和FundaciónSéneca（11922/PI/09）的资助。作者声明没有利益冲突。

参考文献

Compan，V.，Baroja-Mazo，A.，López-Castejón，G.，Gomez，AI，Martínez，CM，Angosto，D.，Montero，MT，Herranz，AS，Bazán，E.and Reimers， 2012）。细胞体积调节调节NLRP3炎症小体激活。免疫力 2012; 37：487-500
Oprica，M.，Eriksson，C.and Schultzberg，M。（2003）。与红藻氨酸诱导的脑损伤相关的炎症机制，特别参考白细胞介素-1系统。 J Cell Mol Med 7（2）：127-140。

Paxinos G和Watson C.The ster brain in sterotaxic coordinates，3ed Edition。（1997）。 Academic Press，Inc.（Ca，USA）