材料和试剂
哺乳动物细胞培养
Kentaro博士友情提供的中国仓鼠卵巢 K1 细胞（CHO-K1；细胞号：RCB0285，Riken BRC，日本）花田，在细胞培养基中培养（见食谱）。
无菌血清移液器（例如，5 mL、10 mL 和 25 mL 的血清移液器； Sarstedt ，目录号： 86.1253.001、86.1254.001、86.1685.001）
无菌培养容器 T-75 烧瓶（例如， Sarstedt ，目录号：83.3911）
基础细胞培养基（例如，高糖DMEM； Sigma-Aldrich, 目录号：D6546）
胎牛血清（FBS；例如，Sigma-Aldrich，目录号：F4135）
200 mM的L-谷氨酰胺原液（例如，Sigma-Aldrich，目录号：G7513）
青霉素-链霉素（例如，Sigma-Aldrich，目录号：P4333）
胰蛋白酶-EDTA 溶液（例如，Sigma-Aldrich，目录号：T3924）
汉克斯平衡盐溶液（HBSS；例如，Sigma-Aldrich，目录号：H6648）
台盼蓝溶液，0.4%（Thermo Fisher Scientific，目录号：15250061）
Tyrode 平衡盐溶液（TBSS；见食谱）
NBD-脂质的制备
购买的 C16:0-C6:0 NBD-脂质在氯仿中，包括：
NBD-PC（Avanti Polar Lipids，目录号：810130）
NBD-PE（Avanti Polar Lipids，目录号：810153）
NBD-PS（Avanti Polar Lipids，目录号：810192）
NBD-SM（Avanti Polar Lipids，目录号：810218）
二甲基亚砜（DMSO；Carl Roth，目录号： 4720.4）
用 NBD 脂质标记细胞
3-（-4-十八烷基）-苯甲酰基丙烯酸（OBAA； Sigma-Aldrich ，目录号：SML0075）
苯基甲基磺酰氟（PMSF； Sigma-Aldrich，目录号：p7626 ）
注意： OBAA 是一种有效的磷脂酶 A 2抑制剂（Eintracht 等人，1998 年）；据报道 PMSF 可抑制磷脂酶以及一些酯酶（James，1978；Estevez 等人，2012； Gadella 和 Harrison，2000）。
NBD-脂质摄取和代谢分析
PYREX ® 11 mL 螺旋盖培养管，16 × 100 毫米（ Corning ，目录号：9825-16）和具有锥形底部的离心玻璃 DURAN®，12 mL（Carl Roth，目录号：K211.1）。如果不使用盖子（参见 D2 点），也可以使用 12 mL 圆底离心玻璃 DURAN ® （Carl Roth，目录号：C102.1）。
用于离心玻璃的聚丙烯管盖（ Ohemen Labor，目录号：6702588）。使用大写字母是可选的。
容量为 15 mL 和 50 mL 的聚丙烯管（例如， Falcon 管， Sarstedt ，目录号：62.554.502 和 62.547.254）
1.5-mL 微量离心管（Sarstedt，目录号：72.690.001）
流式细胞仪管（例如， Sarstedt ，目录号：55.484）
可重复使用的带盖玻璃培养基瓶，250 mL 和 1 L（例如Thermo Fisher Scientific，目录号： 15456113 和 15486113）
刻度移液管血清学，5 mL（Sigma-Aldrich，目录号：BR27112）
Macroman TM移液器（Gilson，目录号：F110120）
一次性玻璃巴斯德移液器，230 mm（VWR，目录号：612-1702）
玻璃巴斯德移液管灯泡（VWR，目录号：470123-222）
牛血清白蛋白，基本上不含脂肪酸（BSA；Sigma-Aldrich，目录号：A6003）
注意：不含脂肪酸的 BSA 可以有效地从细胞膜中提取 NBD-脂质，由于未占据的脂肪酸结合位点。
碘化丙啶≥ 94.0% (HPLC) （PI；Sigma-Aldrich，目录号：P4170）
流式细胞仪清洁溶液（例如， Sysmex，目录号：04-4009_R）
流式细胞仪鞘液（例如， Sysmex，目录号：04-4007_R）
氯仿 99-99.4% 乙醇稳定并证明不存在光气和 HCl（VWR，目录号：22711.290）
无水乙醇≥99 。 8%（VWR，目录号：20821.321）
甲醇≥99 。 _ 8%（VWR，目录号：20847）
三乙胺（Carl Roth，目录号：X875.3）
薄层色谱（TLC）硅胶60，10 × 20 cm（Merck，Darmstadt，Germany，目录号：1.05626.0001）
媒体和缓冲区
细胞培养基（见配方）
TBSS 缓冲液（见配方）
NBD-脂质库存（见食谱）
PMSF 200 mM 库存（见配方）
5 mM OBAA 库存（见配方）
TBSS 中的 BSA (20% w/v) （见配方）
PI 库存 1 mg mL -1 （见食谱）
碱性运行缓冲液（参见配方）
设备
分析天平（例如， Sartorius Entris-i II，220 g/0.1 mg，Buch Holm，目录号：4669128）
Eppendorf Research ® plus 移液器 P20、P200、P1000（Eppendorf，目录号：3123000039、3123000055、3123000063）
移液器吸头 10 µL、200 µL、 1、000 µL（ Sarstedt ，目录号：70.760.002、70.3030.020、70.3050.020）
Neubauer 计数室（改进的暗线，0.1 mm）和盖玻片（20 mm × 26 mm × 0.4 mm）
适用于有机溶剂的流动柜
生物安全柜经认证可处理生物材料（例如Herasafe KSP Class II 生物安全柜、赛默飞世尔科技）
Hamilton 700 系列注射器 25 µL、100 µL、1,000 µL（Hamilton Company，内华达州，美国）
带转子的离心机，适用于 15 mL 和 50 mL聚丙烯管（例如，埃彭多夫 5810 R；韦瑟林，德国）
高压灭菌器（例如， Systec VX-65，Systec，林登，德国）
水蒸馏系统
2的气氛中保持 37°C 和 95% 的湿度（例如， Binder，图特林根，德国）
配备 10 ×物镜的倒置光学显微镜 (HI PLAN I 10 × /0.22 PH1; Leica DMi1, Mannheim, Germany)
水浴（例如， WPE45 Memmert ， Schwabach ，Germany），用于哺乳动物细胞和 NBD-脂质标记（ Julabo CORIO C-BT5，目录号：9011305）
涡旋混合器（例如， Vortex Genie 2 Scientific Industries Inc.，目录号：SI-0236）
带接口 I-100 的真空泵 V-100（ Buchi ，目录号：11593636 和 11593655D）
玻璃干燥器Boro 3.3，盖子上有插座，20 cm，包括旋塞阀（BRAND GmbH，目录号：65238）
管道（BRAND GmbH，目录号：143275）
TLC 显影室（Roth Carl，目录号 3133.1）
-20°C 和 -80°C 的冷冻箱
冰箱
荧光成像仪
对于该协议，使用了具有 530/28 滤光片和浅蓝色 Epi 照明的Chemidoc MP 成像系统（Bio-Rad，慕尼黑，德国）。
流式细胞仪
对于该协议，使用配备有 488 nm 固态激光器的CyFlow® SL流式细胞仪（Sysmex Partec ，Münster，Germany）。
带显示器的电脑（例如，戴尔 U2415)
软件
FloMax ®软件 ( Sysmex Partec)
FlowJo TM v10.0.7 软件（ FlowJo ）
Image Lab TM软件（Bio-Rad）
程序
当使用悬浮生长的细胞系时，跳过步骤 A1 - A5 并从步骤 A6 开始。
哺乳动物细胞的制备
在组织培养箱（37°C，5% CO 2 ，95% 湿度）中，在无菌培养容器（T-75 烧瓶）中的适当细胞培养基中培养贴壁细胞，直到它们达到 70 – 80% 的融合度。
注意：鉴于对于每个时间点和 NBD-脂质，至少需要约 10 4个细胞，每个测试的脂质共收集了 3 × 10 6 个细胞，这对应于三个 T-75 烧瓶中的 CHO-K1 细胞汇合70 – 80%。对于其他细胞系，可能需要调整生长条件和汇合度。
2+和 Mg 2+ ，在 37°C 下预热）清洗细胞两次。
加入 1.5 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液（在 37°C 下预热）并在组织培养箱（37°C、5% CO 2 、95% 湿度）中孵育 T-75 烧瓶。
5 分钟后，在显微镜下检查细胞是否脱落。如果细胞系允许，轻敲烧瓶的侧面以帮助细胞从底部脱离。
注意：悬浮细胞将呈现圆形形态。
通过添加 7.5 mL 适当的细胞培养基（在 37°C 预热）停止胰蛋白酶消化。
注意：对于悬浮培养的细胞，步骤 A1 - A5 被省略。
将细胞悬液转移到 50 mL Falcon 中，并在 1.5 mL 微量离心管中留出 50 μL 用于细胞计数，例如，使用血细胞计数器（见下文）。
× g和室温下将 50 mL Falcon 管中的细胞离心10 分钟并弃去上清液。
在室温下向细胞沉淀中加入 10 mL 的 TBSS 缓冲液（参见配方），并通过上下移液完全重新悬浮。
笔记：这一额外的洗涤步骤可确保去除酚红，这是 DMEM 培养基中存在的一种 pH 指示剂，会干扰 NBD-脂质荧光定量。
× g和室温下将 50 mL Falcon 管中的细胞离心10 分钟并弃去上清液。
将 TBSS 缓冲液中的细胞重悬（参见配方）至终浓度为 ~10 6 个细胞 mL -1 。
为了阻止细胞磷脂酶对 NBD 脂质的转化，将 PMSF 和 OBAA 分别添加到细胞悬浮液中，最终浓度为 1 mM 和 5 μM。
轻轻混合并在 20°C 的水浴中放置在冷室中孵育10 分钟。该测定通常在 20°C 或更低温度下进行以抑制内吞作用。
细胞计数
通过用异丙醇清洁腔室和盖玻片来准备血细胞计数器。使用无绒组织干燥血细胞计数器。将玻璃盖玻片放在计数室上。
将 50 μL 的 0.4% 台盼蓝库存溶液添加到 50 μL 的细胞悬浮液（步骤 A6）中，以获得 1:1 的稀释。
用 10 μL 的细胞悬浮液加载血细胞计，并在低放大倍率的倒置相差显微镜下立即检查。
计算大外象限中活细胞（被视为明亮细胞）和非活细胞（染成蓝色）的数量。
计算活细胞的百分比：% 活细胞 = [1.00 - (蓝色细胞数÷总细胞数)] × 100。细胞活力应至少为 95%。
在每个正方形占 10 -4 mL 细胞悬浮液体积的前提下计算细胞浓度。
要获得每毫升等分试样的活细胞总数，请将活细胞总数乘以 2（台盼蓝的稀释因子）和 10 4的校正因子（每个正方形的体积）。
NBD-脂质摄取测定
注意：为了防止 NBD 脂质的非特异性结合，所有步骤都必须在玻璃管中进行。
在检测开始之前，准备圆底玻璃管，在 DMSO 中加入 NBD 脂质储备（参见食谱）和 1.5 mL 微量离心管在冰上：一个是空的，一个是 30 µL 的 20% BSA（参见食谱）时间点。
注意：我们通常使用 4.6% (w/v) 的最终 BSA 浓度进行 NBD-脂质提取。然而，提取所需的 BSA 量以及孵育时间可能会因测定中使用的细胞类型和脂质类似物而异（Fellmann 等人，2000）。要确定最佳条件，请在 4°C 下标记细胞，并在细胞悬液与 BSA 接触不同时间后测量细胞相关荧光。
要开始细胞标记，请将 3 mL 的细胞悬浮液（从步骤A1 2）添加到含有 NBD-脂质库存的玻璃管中，并轻轻涡旋 2 秒（图 2）。
将细胞与 NBD-脂质一起孵育所需的时间段，例如， 0、5、10、20、30、45和 60 分钟。请注意，对于 t=0 分钟，需要在将细胞添加到脂质悬浮液后立即收集样品。在并行分析几种 NBD 脂质的吸收时，以 1 分钟的间隔开始添加细胞。
在每个时间点，使用低涡流功率设置轻轻涡旋细胞悬浮液 2 s，以避免细胞沉淀，并取两个 100 μL 的等分试样。将一个等分试样转移到预冷的 1.5-mL空微量离心管中，将另一个等分试样转移到含有 30 µL 20% BSA 的预冷 1.5-mL 微量离心管中（参见图 2）。
注意：此时，可以使用脂质提取和薄层色谱分析来分析荧光脂质类似物的代谢转化（见 D 节）。
收集最后一个样品后，将样品放在冰上最多一小时，并通过流式细胞仪对其进行分析。
打开CyFlow ® SL 流式细胞仪，启动计算机，然后打开FlowMax软件。
单击面板“仪器设置”并手动输入参数（表 1）。
注意：将使用的参数保存在仪器上，以便在以后的运行中重新加载。
打开门控菜单，选择“多边形”并单击“新建”。在图中生成一个门，默认情况下称为 R1，x 轴为前向散射 (FSC) 参数，y 轴为侧向散射(Dawaliby et al. , 2016) ，覆盖中心的大部分表面的情节。
注意： Gates 可以在以后的运行中保存和加载。
单击“设置”选项以打开“设置”窗口。选择 R1 10,000 个细胞的最大计数。单击“确定”。
注意：我们通常在门 R1 中计数细胞直到达到 10,000（对应于 P1 人口）。
要在使用前冲洗机器，请将 1 mL 的 TBSS 添加到流式细胞仪管中，并以 4–8 µL s 1之间的速度运行约 1 分钟。
注意：确保计数很少或没有，因此流式细胞仪中没有污染或残留细胞。如果有污染物，用 TBSS 冲洗更长的时间，如果仍然存在，用清洗液清洗，然后再用 TBSS。
将流速设置为 3–4 µL s -1以平均计数 300 个细胞 s -1 。必要时可以调整速度。
将细胞样品转移到流式细胞仪管中，然后加入 1 μL 的 1 mg mL -1 PI 和 1 mL 的 TBSS。快速涡旋并将样品管放入样品架中。 PI 标记允许从分析中排除死细胞，这些死细胞很容易吸收 NBD-脂质，因为它们的质膜被破坏。添加新的细胞样本后，会显示一条消息以保存刚刚收集的数据。在所使用的设备中，样品会自动以 .fcs 格式保存（查看“数据分析”以了解如何进行样品分析）。

图 2. 示意图 NBD-脂质摄取测定。
对于标记，将在 20°C 与磷脂酶抑制剂预孵育的细胞（10 6 个细胞 mL -1 ）转移到含有溶解有 DMSO 的 NBD-脂质的玻璃管中，然后孵育不同的时间段。在每个时间点，取两个 100 µL 的等分试样。一份转移到预冷的 1.5-mL 空离心管中，另一份转移到预冷的含有 30 µL 20% BSA 的 1.5-mL 微量离心管中。随后通过流式细胞术分析样品。文本中描述了各个步骤的详细信息。
表 1. 用于对 NBD 脂质标记的哺乳动物细胞系 CHO-K1 进行流式细胞术分析的参数。
每个参数采用的设置，包括增益、比例 (Log)、下限 (LL) 和上限 (UL)。 FSC，前向散射； SSC，侧向散射； FL1，NBD荧光通道； FL3，PI 荧光通道。使用的流式细胞仪配备有蓝色固态激光器（488 nm，20 mW ）。 FL1 和 FL3 荧光分别用带通滤光片 IBP 527/30 和长通滤光片 RG 630 nm 记录。请注意，这些值可能需要根据所使用的细胞系和/或流式细胞仪进行调整。
参数_增益_日志_L -LU -L
FSC _1 70升在1 109 99.9
不锈钢_1 90升在1 09 99.9
F L12 20日志41 09 99.9
F L34 15日志41 07 35.9
荧光脂质代谢分析
可以根据修改后的(Bligh and Dyer, 1959)方案进行脂质提取。该方法基于在氯仿和甲醇的双相混合物中分配脂质。添加有机溶剂（如氯仿）后，甲醇会破坏脂质和蛋白质之间的氢键。除了离心，所有描述的步骤都在流动柜中进行，以避免直接暴露于有机溶剂。
在给定时间点转移等分的细胞悬浮液至 12 mL 玻璃管。我们通常在 60 分钟后分析代谢，取与 ~4 nmol NBD-脂质相对应的体积（150 µL 用 NBD-PE 标记的细胞；300 µL 用 NBD-PC 标记的细胞；600 µL 用 NBD-PS 标记的细胞或 NBD-SM）。
考虑到每个玻璃管中已经存在的体积，最多添加 2 mL 的 ddH 2 O。
添加 2.2 mL 甲醇，然后使用玻璃刻度移液器添加 2 mL 氯仿，并小心涡旋 3–5 s，以实现单相。
× g离心管 5 分钟以获得两个分离的相。
使用玻璃巴斯德吸管将下相（含有脂质的氯仿相）转移到锥形底部玻璃管中。
对于第二轮萃取，在原管中加入 1 mL 氯仿，短暂涡旋，再次以 500 × g离心5 分钟。
将下层相从步骤 D5 转移到玻璃管中。
准备四个锥形底玻璃，并添加 4 nmol 的 NBD-PC、NBD-PE、NBD-PS 和 NBD-SM 重新悬浮在氯仿中：甲醇（1:1，v/v）来自用于标记细胞的相同脂质库存。这些样品将作为标准品与提取的脂质样品进行比较。
将脂质提取物和标准样品在 250 mbar 真空下干燥过夜或在温和的氮气流下 30 分钟至 1 小时。
在 TLC 硅胶板上，用铅笔将 1 厘米线标记为加载点。它们应与底边相距 1.5 厘米，与侧边相距 1 厘米且彼此相距 1 厘米。总共绘制 8 条线，其中 4 条用于 NBD 脂质标准，4 条用于提取的 NBD 脂质样品（图 3A）。样品信息可以用铅笔写在装载点下。在 TLC 板上书写时不要用力过大，因为这会去除二氧化硅涂层。
小心地将运行缓冲液（参见食谱）倒入显影室中，直到填充到约 0.5 厘米高。盖上盖子，让空气饱和约 20 分钟。
μL的氯仿/甲醇 (1:1, v/v)的体积中。
使用玻璃巴斯德移液器将溶解的 NBD 脂质涂抹到 TLC 二氧化硅板上，小心地将其放在 1 厘米加载点的顶部，以避免剥落二氧化硅并确保均匀分布。在加样点顶部添加更多样品之前，让有机溶剂蒸发。
放置 TLC 板尽可能均匀地在腔室中稍微倾斜。盖上盖子并运行 20-25 分钟，或直到运行前端距离顶部边缘 1 厘米。
从腔室中取出 TLC 板，用铅笔标记运行前部，让它干燥 15-30 分钟。
在 Chemidoc 成像系统中使用 Image Lab TM软件和发射滤光片 530/28 nm 在蓝光 Epi 照明下成像 NBD-脂质荧光（图 5C）。
注意：将 TLC 板放在透明塑料袋的顶部，以免刮伤 Chemidoc 托盘表面。
TM软件对条带强度进行量化，例如，以评估脂质代谢转化的百分比。低水解 (<10%) 不影响 NBD-脂质内化动力学。然而，对于更高的水解 (>10%)，确定转化是发生在细胞内还是在细胞表面，以解释结果是至关重要的。

图 3. TLC 的制备。
A ) 用铅笔在二氧化硅板上标记加载点，并用玻璃巴斯德吸管加载 NBD-脂质（详细信息见正文）。车道不应放置得太靠近边缘：保持 1.5 厘米的距离，如红色箭头所示。 B ) 将硅胶板放入含有碱性电泳缓冲液的 TLC 室中，并盖上玻璃盖。将板显影直到溶剂在板顶部下方约半厘米处。
数据分析
从流式细胞仪中以原始格式 (.fcs) 导出数据并导入 FlowJo 软件。
双击第一个文件的顶部。将打开一个图，并且可以将单元格可视化为点。分别为 x 和 y 轴选择 FCS 和 SSC ，并选择对数刻度。调整比例范围。
周围生成一个门并将其标记为 P1，在这种情况下指的是 CHO-K1 细胞（图 4A）。双击所选种群的顶部，将打开另一个面板图。
为 x 轴选择 FL3（PI 荧光），并在新图中为 y 轴保留 SSC。在具有低 PI 荧光的细胞群周围生成一个门，其中仅包括活细胞，并标记为 P2（图 4B）。
双击 P2 种群的顶部。一个新的情节将打开。为 x 轴选择 FL1（NBD-脂质荧光），为 y 轴选择 SSC（侧向散射）（图 4C）。
在 FlowJo 界面中，创建的种群 P1 和 P2 出现在 .fcs 文件下方。右键单击每个文件并选择“将分析复制到组”以将门应用于所有其他文件。
检查生成的门是否适合所有样本，并在必要时移动以适合。
在 FlowJo 界面中，点击 Workplace，然后点击 Add Statistics。选择“几何平均值”、总体 P2 和参数 FL1。
将分析的样本保存为 Worspace (WSP) 文件和 Excel (xls) 文件。
计算细胞在每个时间点吸收的 NBD-脂质百分比 (图 5A, B)。没有添加 BSA 的样品的每个时间点的几何平均值被认为是 100% NBD 荧光。在给定时间点具有 BSA 的样本的几何平均值是与分配给 100% 的值相比的相对百分比（来自没有 BSA 的样本；等式 1）。新计算的百分比在步骤 11 和方程式中称为不可提取的 NBD-脂质。 1 或图 5B 和其他地方的 NBD 脂质摄取。绘制每个时间点内化 NBD 脂质的百分比（图s 5A 和 5B）。
Non˗extractable NBD˗lipid (%)=(geometrical mean value of sample with BSA)/(geometrical mean value of sample without BSA) × 100 Eq.1
根据单指数曲线的方程拟合数据（例如，使用 Microsoft Excel 和插件程序 Solver）：
y=a+b*(1-e^(c*t) ) Eq.2
在哪里
y是在每个时间点以百分比 (%) 表示的 NBD-脂质荧光的拟合值，
t是添加 NBD 脂质后的时间，
a是 t = 0 时不可提取的 NBD 脂质的百分比，
b是稳态下不可提取的 NBD 脂质的百分比，
c是比率系数。

图 4.使用FlowJo软件对细胞群进行门控。
细胞用 NBD 脂质标记并在给定时间点收集。该数据说明了与标记为 60 分钟并用 BSA 处理的细胞相对应的门控程序。 A ) 细胞在侧向和前向散射的对数刻度图中可视化。群体P1 被定义为对应于哺乳动物细胞并且不包括其他可能的颗粒（例如，细胞碎片）。 B ) P1 群体在绘制侧向散射和红色碘化丙啶 (PI; dos Santos等人, 2013 )-荧光的新面板中可视化。通过选择活细胞并排除死细胞来定义群体 P2，并用 PI 标记。 C ）随后将 P2 群体绘制在侧向散射和绿色 NBD 荧光板上，从而显示内化 NBD 脂质的活细胞。

图 5. CHO-K1 细胞中 NBD 脂质摄取和脂质代谢的示例性时间流逝。
在反萃取至 BSA 后，通过流式细胞术分析在 20°C 下用指定的 NBD-脂质培养的细胞。 A ）在指定时间点测量 BSA 孵育后 CHO-K1 细胞中 NBD-PC 荧光强度的直方图。请注意，如果没有代谢修饰，例如，NBD-脂质类似物水解成溶血衍生物和游离 NBD-脂肪酸，未经 BSA 处理的细胞的相应直方图将显示随时间持续高的细胞相关荧光. B ) NBD-脂质在 CHO-K1 细胞中内化的时间过程，显示为荧光强度相对于在没有 BSA 的情况下处理的细胞的荧光的百分比。绘制的线代表单指数曲线的最佳拟合。 C ）孵育 60 分钟和 BSA 处理后从 CHO-K1 细胞中提取的 NBD 脂质的薄层色谱图。脂质样品与标准品一起被解析到硅胶板上，并进行荧光成像。二酰基甘油 (DAG) 神经酰胺 ( Cer ) 和 NBD-X [6-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)hexanoic acid] (hexanoic acid)，NBD 产品-脂质代谢转化也被指出。星号 (*) 表示来自 NBD-PE 的未知污染物或脂质种类。右边的箭头表示碱性缓冲液的运行方向。标有运行原点 (O) 和运行前沿 (F)。 NBD，硝基苯并恶二唑； PC、磷脂酰胆碱； PE、磷脂酰乙醇胺； PS，磷脂酰丝氨酸； SM，鞘磷脂。
食谱
使用内部水蒸馏系统获得的双蒸馏水 (ddH 2 O) 制备缓冲液。或者，所有缓冲液均使用超纯水制备，25°C 时纯化灵敏度为 18 MΩ cm -1 。
细胞培养基
打开 500 mL 烧瓶的高葡萄糖 DMEM 培养基
加入50 mL胎牛血清
加入 5 mL L-谷氨酰胺
加入 5 mL 青霉素-链霉素
在无菌柜中制备；储存于 4°C
TBSS 缓冲器
136 毫米氯化钠
2.6 毫米氯化钾
1.8 毫米氯化钙2
1 毫米氯化镁2
0.36 毫米 NaH 2 PO 4
5.56 毫米葡萄糖
5 毫米 HEPES
用 NaOH 将 pH 值调节至 7.4。完成体积至 1 L。使用 0.22 µm 过滤器过滤进行消毒。
在 4°C 下可保存数月。
NBD-脂质库存
所有步骤都必须在玻璃管中进行，以防止脂质的非特异性结合。
注意：氯仿是一种化学危险品。不要吸入气体/烟雾/蒸气/喷雾。穿合适的防护服。在通风橱中工作。
使用玻璃注射器将所需量的 NBD 脂质转移到直径为 12 毫米的一次性玻璃管中。通常，我们用 80 nmol 的 NBD-PE、40 nmol 的 NBD-PC 和 20 nmol 的 NBD-PS 或 NBD-SM 标记 3 mL 的细胞悬浮液。
笔记：这些数量已经过优化，以允许在分析标记细胞时使用相同的流式细胞仪设置。
在 250 mbar 真空下过夜或在温和的氮气流下干燥脂质30 分钟至 1 小时，以便在管底部形成干燥的脂质膜。
在使用前不久将 NBD-脂质重新悬浮在 20 μL 的 DMSO 中。将移液器尖端放在玻璃管壁和干燥的脂质膜顶部，以圆形方式添加 DMSO。缓慢上下移液器重复圆周运动，直到所有脂质膜重新悬浮。
注意： DMSO 脂质悬浮液由于其吸湿性而容易沉淀，应新鲜制备。 DMSO 是一种化学危险品。穿合适的防护服。
200 mM PMSF 库存
重量 34.838 毫克，带防护装备，避免吸入或接触皮肤。
溶解在 1 m L乙醇中。
储存在-20°C。
注意: PMSF 是一种化学危险品，特别是在其固态时，如果吞食会产生剧毒，接触会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。准备库存溶液时，穿上合适的防护服并在通风橱中工作。小心处理原液。
5 mM 的 OBAA 库存
重量 2.14 毫克
加入 1 mL 无水乙醇
储存于 -80°C
注意：穿合适的防护服。
TBSS 中的 BSA（不含香精脂肪酸，20% w/v）
重量 200 mg BSA 在 15 mL Falcon 管中
添加 1 mL 的 TBSS
在 37°C 的水浴中孵育直至部分溶解。
在冰箱中储存至第二天，并在一周内使用；不要冻结溶液。
PI 库存 1 mg mL -1
重量 1 毫克 PI
添加 1 mL 的 ddH 2 O
储存于 -20°C
注意： PI 是一种疑似致癌物，应小心处理。染料必须按照适用的当地法规安全处置。穿合适的防护服。
碱性运行缓冲液
将以下体积混合在 30:35:35:7 v/v/v/v (mL) 氯仿:乙醇:三乙胺: ddH 2 O 在蓝盖玻璃中。
用力摇晃。在实验的同一天准备。
注：TLC 腔室尺寸（宽×深×高：235 × 116 × 220 mm）在本协议中描述的碱性运行缓冲液是通过混合 15:17.5:17.5:3.5 v/v/v/v (mL) 氯仿:乙醇:三乙胺: ddH 2 O来制备的。有机溶剂具有化学危险性。不要吸入气体/烟雾/蒸气/喷雾。穿合适的防护服。在通风橱中工作。
致谢
该协议改编自我们之前的工作（Pomorski等人，1996；Weingartner等人，2011；dos Santos等人，2013；Grifell-Junyent等人，2022）。这项工作得到了灵北基金会 (R221-2016-1005 to TGP) 和德国研究基金会 (GU 1133/11-1 to TGP) 的支持。 MGJ 承认哥本哈根大学和波鸿鲁尔大学研究实习交流计划的资助。我们非常感谢 Marcus Peters 博士授予我们使用流式细胞仪的权限。
利益争夺
作者声明不存在相互竞争的利益。
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