材料和试剂

1.15-mL离心管（ CellTreat ，目录号： 229411）

2.T-75烧瓶（ CellTreat ，目录号： 229341 ）

3.bEnd.3 细胞（ATCC ® ，目录号： CRL-2299 TM ），在液氮中扩增和储存细胞原液

4.明胶（猪皮A型；Sigma，目录号： G1890），室温储存

5.Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（Gibco，目录号： 11965118），4 °C储存

6.胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号： 26140079），等分并储存在-20 °C

7.青霉素-链霉素（P/S；10,000 U/mL；Gibco，目录号： 15140122），等分并储存在-20 ° C

8.台盼蓝溶液，0.4%（Gibco，目录号： 15250061），室温储存

9.Transwell ®插件（Corning，目录号： 3401）

10.生长因子降低（GFR）Matrigel ® （Corning，目录号： 354230），等分并储存在-20 °C 。按照程序部分中的说明进行操作。

11.DPBS（不含Ca 2+ /Mg 2 + ）（Gibco，目录号： 14190359），室温储存

12.TrypLE TM Express（Gibco，目录号： 12604-021，在室温下储存）或 0.05% 胰蛋白酶/EDTA（Gibco，目录号： 15400-054，等分并储存在 -20 °C ）

13.胰蛋白酶中和溶液（Lonza，目录号： CC-5002），仅在使用胰蛋白酶作为分离酶时使用，分装并储存在 -20 °C

14.无酚红培养基（Gibco，目录号： 21063029），4 ℃保存

15.HEPES 缓冲的 Krebs-Ringer 溶液（可选；Alfa Aesar ，目录号： J67795-AP），储存于 4 °C

16.聚乳酸-乙醇酸共聚物 (PLGA) 制备并用 Dy677 荧光染料标记的50–100 nm 大小的纳米颗粒[实验室制造；请检查李等人。 (2021) ]，使用前新鲜配制

17.小鼠血清（Sigma，目录号： M5905），等分并储存在-20 °C

设备

1.层流柜（Baker， SterilGard SG403-Class II Type A/B3）

2.CO 2培养箱（Thermo、Forma 系列 3110 水套培养箱）

3.台式离心机（Eppendorf，型号：5810 R）

4.改进的 Neubauer 细胞计数室（EMS，目录号： 68052-16）

5.EVOM-2 伏特/欧姆表（World Precision Instruments，目录号：3 00523）

6.LSE TM低速轨道振动器（ Corning TM ，目录号： 6780FP）

7.读板器（Tecan，型号：Infinite Pro 200）

软件

1.Tecan i-Control 读板机软件，2.0.10.0

2.GraphPad 棱镜，9.2.0

程序

A.培养物的解冻和维护

1.用 1% 明胶涂抹 T-75 烧瓶（每个 T-75 烧瓶使用 5–6 mL）并在 37°C 下孵育 15 分钟。

2.15 分钟后，吸出明胶，每瓶加入 10 mL 的完整培养基（DMEM，含 10% FBS 和1% P/S）。

3.从液氮中回收 bEnd.3 细胞并将小瓶的下半部分浸入 37°C 水浴中解冻。

4.在完全解冻小瓶的全部内容物之前（当小瓶内有一小块冰时），用消毒溶液（70% 乙醇）擦拭小瓶的外部，然后移至层流培养罩。

5.打开小瓶，将 0.5–1 mL 的预热完全培养基逐滴添加到细胞上。

6.缓慢地上下移取悬浮液，以分散细胞。

7.将它们播种为 0.5 × 10 6 –1 × 10 6 bEnd.3 个细胞/烧瓶，总体积为 15 mL。

8.接种后，旋转烧瓶中的培养基以分布细胞，并将 T-75 培养瓶置于 37°C、5% CO 2的加湿细胞培养箱中。

9.细胞附着后（3-4 小时），用 15 mL 的新鲜完整培养基替换含有 DMSO 的冷冻培养基。

10.在 37°C、5% CO 2的加湿细胞培养箱中培养培养物。

11.每 2-3 天更换一次新媒体。

B.细胞接种到Transwell ®插入物

12.当细胞达到 80-90% 融合时，开始渗透实验。

13.在细胞接种到Transwell ®插入物（Corning）的当天，从冰箱中取出 GFR Matrigel 等分试样并在冰上解冻。

注意：Matrigel ®在室温下会迅速凝胶化。在实验前使用预冷的移液器吸头和预冷的微量离心管制备基质胶等分试样。在冰上工作，避免多次冻融循环。

14.在冷 DMEM（不含 FBS 和抗生素）中稀释 GFR Matrigel，并用 2% GFR Matrigel（200 μL /插入）涂覆 12 mm 聚碳酸酯Transwell插入物。

15.Transwell插入物在 37°C 下孵育1 小时。

注意：细胞必须在此期间结束时立即播种。

16.通过抽吸从 T-75 烧瓶中取出介质。

17.用 5 mL 的 DPBS（不含 Ca 2+ /Mg 2+ ）清洗细胞，并通过抽吸去除溶液。

18.将 3 mL 的预热TrypLE Express 或 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 溶液移入 T-75 烧瓶中。

19.旋转烧瓶以确保溶液覆盖所有细胞。

20.在显微镜下监测室温下的胰蛋白酶化过程。

21.将烧瓶的一侧靠在手掌上，从培养表面释放圆形细胞，直到大部分细胞分离。

22.如果您使用胰蛋白酶，将 6 mL 胰蛋白酶中和溶液或 10% 的含有 FBS 的 DMEM 移液到烧瓶中，以抑制胰蛋白酶活性。如果您使用TrypLE Express，请使用 DMEM 稀释酶。

23.将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中，以 250 × g离心5 分钟以沉淀细胞。

24.在不干扰细胞沉淀的情况下从管中吸出上清液。

25.通过轻轻上下吹打细胞，将细胞重新悬浮在 2 mL 的完整培养基中，并使用细胞计数室对细胞进行计数。使用台盼蓝排除死细胞。

26.从Transwell插入物吸出 Matrigel，并用 DMEM 清洗插入物一次（不含 FBS 和抗生素；使用 300 μL /插入物）。

27.以 80,000 个细胞/插入物的密度将细胞立即铺板到 500 微升。

28.每 2-3 天在基底侧添加 1.5 mL 的介质，并在顶端/基底侧更换介质。

29.监测内皮细胞的跨内皮电阻 (TEER) 。 TEER 是一种广泛使用的测量细胞单层完整性的方法。

30.要测量 TEER，请先用 70% 异丙醇 (IPA) 对 EVOM-2 进行消毒，然后再将其放入层流罩。

31.将探头连接到 EVOM-2 并通过放入 70% IPA 15 分钟对其进行消毒。

32.15 分钟后，将探头放入 DPBS 中清洗。

33.通过将长尖头插入Transwell机库的断裂处来测量 TEER，然后将其降低直到它接触井底（参见图 1）。

34.读取并记录 EVOM-2 屏幕上的值。

35.要计算 TEER (ohm*cm 2 )，请将电阻值乘以表面积（Corning 3401 为 1.12 cm 2 ）。

36.每 1-2 天重复测量一次。

37.一旦 TEER 达到≥ 50 ohm*cm 2 （~ 1 周后），进行渗透性实验。

C.纳米颗粒渗透性实验

38.在实验之前，用 1.5 mL DMEM（不含血清和抗生素溶液）/孔准备一个新的 12 孔板。

注意：建议使用无酚红介质，以防止荧光测量出现问题。如果无酚红介质在商业上没有销售，则在含酚红的介质中使用标记的纳米颗粒制备校准曲线，以查看酚红在测量中的效果。或者，HEPES 缓冲的 Krebs-Ringer 溶液可用于纳米颗粒渗透性实验。

39.HEPES 缓冲的 Krebs-Ringer 溶液- 参见步骤 38）中以所需浓度稀释荧光标记的纳米颗粒。

注意：必须在实验前确定不同纳米颗粒制剂的浓度范围。校准曲线或之前的体外实验可以帮助找到每种纳米颗粒制剂的最佳浓度范围。

40.Transwell插入物转移到步骤 38 中准备的新 12 孔板中。

注意：包括至少两个空过滤器（每个纳米颗粒配方），不含细胞但带有基质胶涂层，以计算最大 (100%) 纳米颗粒渗透。

41.从插入物的顶端部分吸出介质，并将 500 μL的纳米颗粒溶液添加到 DMEM（或HEPES 缓冲的 Krebs-Ringer 溶液）的顶端隔室中。在时间为零时从顶端和基底外侧收集等分试样。

注意：如果您的目标是发现血清对纳米粒子穿透 BBB 的影响，请在 DMEM 中用小鼠血清稀释纳米粒子，并在渗透性实验前孵育 30 分钟。

42.将Transwell板放在 37°C、5% CO 2的轨道摇床上。

43.从接收器隔间中取出Transwell插件。

44.从顶端和基底外侧隔间收集等分试样并测量这些隔间中的体积，用于渗透和质量平衡计算。

45.在渗透性研究中使用的溶液中制备不同浓度的纳米颗粒制剂（参见步骤 38 和 39）以绘制校准曲线。

46.在室温下使用酶标仪对荧光进行定量，并为您的荧光纳米粒子提供适当的激发/发射值。在每个渗透率测量中使用至少三个带细胞的插入物。使用没有细胞的空过滤器来确定体外的最大纳米颗粒渗透（100% 渗透）。

数据分析

1.使用校准曲线计算 NPs 在顶端和基底侧的浓度（图 1）。

2.在实验结束时使用基底外侧/顶端侧的体积值，计算两个隔室中纳米粒子的数量（质量）（NPs 的质量 = NPs体积的浓度）。

3.为了评估对塑料的可能吸附和对细胞的非特异性结合，计算质量平衡 (%) — 将实验结束时在两个隔室中回收的 NP量除以在时间为零时添加到供体隔室中的总量。质量平衡值应在80–120% 之间以进行可靠计算。

4.计算在空过滤器中穿透基底外侧隔室的 NP数量（无细胞；参见步骤 40）。将此值视为 100% 穿透（穿透过滤器，无内皮细胞屏障）。

5.使用来自空过滤器的值（100% 渗透率）对不同条件下的数据（渗透率百分比）进行标准化。

6.使用 GraphPad Prism 执行统计分析和绘图。将P <0.05的值视为具有统计学意义。

7.有关可以使用此协议获得的结果的示例，请参阅Li等人。（2021 年）。

图 1. 用于计算顶端和基底外侧 NP 浓度的协议示意图。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院赠款 HL095722（给 JMK）和Fundação para a Ciência ea Tecnologia通过 MIT-Portugal-TB/ECE/0013/2013（给 JMK）的支持。方案是使用 BioRender.com 创建的。

原始研究论文— Li等人。 (2021)：脑外伤性脑损伤中独立于 BBB 病理生理学的 siRNA 递送。 DOI：10.1126/ sciadv.abd 6889。

利益争夺

JMK 一直是多家生物技术公司的付费顾问和/或股权持有人（在此处列出： https ://www.karplab.net/team/jeff-karp ）。 JMK 的利益经过审查，并受其机构根据其利益冲突政策监督的管理计划的约束。 JMK、NJ、SA 和 WL 拥有一项基于本手稿中介绍的纳米粒子工作的正在申请的专利。

参考

1.Aday, S.、Cecchelli, R.、Hallier-Vanuxeem, D.、Dehouck, MP 和 Ferreira, L. (2016)。用于药物发现和递送的基于干细胞的人类血脑屏障模型。趋势生物技术34（5）：382-393。

2.Cecchelli, R.、Aday, S.、Sevin, E.、Almeida, C.、Culot, M.、Dehouck, L.、Coisne, C.、Engelhardt, B.、Dehouck, MP 和 Ferreira, L. (2014 ）。一种源自造血干细胞的稳定且可重复的人血脑屏障模型。公共科学图书馆一号9(6)：e99733。

3.Li, W., Qiu, J., Li, XL, Aday, S., Zhang, J., Conley, G., Xu, J., Joseph, J., Lan, H., Langer, R., et人_ （2021 年）。外伤性脑损伤中 siRNA 的 BBB 病理生理学独立递送。科学进阶7（1）。

4.帕德里奇，WM（2003 年）。血脑屏障药物靶向：脑药物开发的未来。摩尔访谈3(2)：90-105、151。

5.帕德里奇，WM（2005 年）。血脑屏障：脑药物开发的瓶颈。 NeuroRx 2（1）：3-14。

6.佩利文，SB（2013 年）。基于纳米技术的药物输送系统，用于神经退行性疾病的靶向、成像和诊断。医药水库 30(10)：2499-2511 。

7.van Rooy, I.、Cakir-Tascioglu, S.、Hennink, WE、Storm, G.、Schiffelers, RM 和 Mastrobattista, E. (2011)。研究纳米颗粒进入大脑的体内方法。医药水库 28（3）：456-471 。