材料和试剂
1.费雪牌 Superfrost TM Plus 显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：22-037-246）
2.6孔玻璃底板（ CellVis ，目录号：P06-1.5HN）
3.斑马鱼品系野生型斑马鱼胚胎是从 AB 成虫的自然产卵中获得的，根据既定的方案进行分期和维持 (Kimmel et al ., 1995)
4.斑马鱼胚胎在 28.5 °C 0.3 × Danieau 的胚胎培养基 (Zhao et al ., 2021)。
5.毛细管，外径 1.2 毫米，内径 0.9 毫米，带灯丝（ World Precision Instruments，目录号：1B120F-6）
6.三卡因（Sigma-Aldrich，CAS 号：886-86-2，目录号：E10521）
7.酚红（Sigma-Aldrich，目录号：P0290）
8.本研究中使用的一抗：
(1)小鼠抗Dld （Abcam ，目录号：ab73331；RRID，目录号：AB_1268496；批次，目录号：GR115501 -3，1 :200稀释用于免疫染色）
(2)鸡抗 GFP（Abcam ，目录号： ab13970； RRID：AB _300798，批次 GR3190550-20，1:500 稀释用于免疫染色）
(3)兔抗 Par-3（Millipore 07-330； RRID：AB _2101325；批次 3322358，1:500 用于免疫染色）（在本研究中验证）
(4)豚鼠抗 DLIC1-Cter（T. Uemura博士的礼物，1:100 用于免疫染色）（Satoh等人，2008）
9.用于免疫荧光标记的二抗：
(1)Alexa ® -缀合的山羊抗兔（Alexa 568，Invitrogen ，目录号： A11011，RRID.AB_143157，批次 792518，1:2,000 稀释）
(2)山羊抗鸡（Alexa 488，Invitrogen ，目录号： A11039， RRID：AB _142924，批次 2020124，1:2,000 稀释）
(3)山羊抗小鼠（Alexa 488，Invitrogen ，目录号： A11002， RRID：AB _2534070，批次 1786359，1:2,000 稀释）
(4)山羊抗豚鼠（Alexa 488，Invitrogen ，目录号： A11073， RRID：AB _2534117，批次 46214A，1:2,000 稀释）或驴抗豚鼠（Alexa 647，Jackson Labs ，目录号： 706-605-148 , RRID:AB_2340476, 批号 102649-478, 1:2,000 稀释）
10.抗小鼠 IgG-Atto647N（Sigma-Aldrich，目录号：50185，1 mg/mL）
11.ExM中用于三功能接头偶联的二抗是：
(1)山羊抗豚鼠IgG（H+L）未偶联二抗（Invitrogen ，目录号： A18771， RRID：AB _2535548）
(2)山羊抗兔IgG（H + L）交叉吸附的未偶联二抗（Invitrogen ，目录号： 31212， RRID：AB _228335）
(3)山羊抗鸡IgY （H+L）未偶联二抗（Invitrogen ，目录号： A16056， RRID：AB _2534729）
12.NHS-MA-生物素缀合的抗鸡IgY 、NHS-MA-生物素缀合的抗兔 IgG 和NHS-MA-DIG 缀合的抗豚鼠 IgG（施博士的礼物）（施等人，2021）
13.DAPI 溶液（1 mg/mL）（Thermo Scientific TM ，目录号：62248）
14.Tween 20 （ Sigma-Aldrich，CAS 号：9005-64-5，目录号：P-9416）
15.Triton TM X-100（Sigma-Aldrich，CAS 编号：9036-19-5）
16.二甲基亚砜 (DMSO)（Sigma-Aldrich，CAS 编号：67-68-5）
17.天然山羊血清（Invitrogen，目录号：31872）
18.甘油（Sigma-Aldrich，CAS 号：56-81-5G，目录号：9012）
19.磷酸盐缓冲盐水（PBS）10 ×溶液，pH 7.4（ Gibco TM ，目录号：70011044）
20.蔗糖（Sigma-Aldrich，CAS 编号：57-50-1）
21.Tissue - Plus TM OCT 化合物（Fisher Scientific，目录号：23-730-571）
22.UltraPure TM低熔点琼脂糖（Invitrogen，目录号：16520050）
23.丙烯酸钠（Sigma-Aldrich，CAS 编号：7446-81-3）
24.丙烯酰胺（Sigma-Aldrich，CAS 号：79-06-1，目录号：A9099）
25.氯化钠（Sigma-Aldrich，CAS 编号：7647-14-5，目录号：204439）
26.N,N ,N',N'-四甲基乙二胺，TEMED（Sigma-Aldrich，CAS 编号： 110-18-9，目录号：1.10732）
27.过硫酸铵，APS（Thermo Scientific TM ，目录号：17874）
28.蛋白酶 K（Sigma-Aldrich，CAS 号：39450-01-6，目录号：P4850）
29.N,N'-亚甲基双-丙烯酰胺（Sigma-Aldrich，CAS 号：110-26-9，目录号：M7279）
30.30 × Danieau 的胚胎培养基（见食谱）
31.用于免疫染色的封闭缓冲液（参见配方）
32.洗涤缓冲液（见配方）
33.LR- ExM凝胶缓冲液和消化缓冲液（参见配方）
34.凝胶缓冲液（见配方）
35.单体溶液（见配方）
36.消化缓冲液（见配方）
37.消化后染色缓冲液（参见食谱）

设备

1.立体解剖显微镜（Zeiss Stemi 2000，最大放大倍数为 50）
2.气压注射器（ Narishige IM 300 微型注射器）
3.显微操作器 (WPI M3301R, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)
4.Flaming-Brown P897 拔针器（Sutter Instruments，Novato，CA，USA）
5.尼康 CSU-W1 转盘/共聚焦显微镜
6.Leica CM1850 低温恒温器

软件

1.Micro-Manager 2.0 gamma（ μManager TM ，加利福尼亚大学）， https: //micro-manager.org/
2.斐济（Schindelin等人，2012 年）， https://imagej.net/software/fiji/
3.棱镜 9，GraphPad， https: //www.graphpad.com/

程序

A.一天(1dpf) 斑马鱼脑中的抗Dld抗体摄取测定
1.抗体偶联：将1 μL抗Dld抗体 (0.5 mg/mL) 与 2.5 μL抗小鼠 IgG-Atto647N 抗体 (1 mg/mL) 混合，室温孵育 30 分钟，或在冰上孵育 2 – 3小时。从这一步开始，混合物应避光。
2.封闭未偶联抗体：加入 2.5 μL封闭缓冲液（10 mg/mL 小鼠 IgG 和 5 mM叠氮化物，由 Sigma-Aldrich 提供，顺序为 anti-Mouse-Atto647N）和 0.5 μL 0.5 % 酚红 (Sigma P0290 ) 用于阻断未偶联的 Anti-Mouse-IgG-Atto647N 。彻底涡旋，并在室温下孵育混合物 5 – 10 分钟。不含抗Dld抗体的混合物用作对照。
3.Danieau培养基中对受精后 24-26 小时 ( hpf ) 胚胎进行麻醉，然后嵌入 1.2%低熔点琼脂糖中。斑马鱼显微注射平台与之前描述的相同(Dong et al. , 2011) 。将10 nL标记的Dld抗体注入后脑室。从琼脂糖中释放注入的胚胎，并在Danieau培养基中培养 3-4 小时。
4.在进行固定和免疫染色之前，在旋转盘共聚焦显微镜下监测抗体摄取测定的效果。

B.斑马鱼胚胎的固定和冷冻切片
1.从最后一步收集胚胎，在 PBS 中清洗两次，然后将它们转移到含有 4% 多聚甲醛 (PFA) 的 Eppendorf 管中，在 4°C 的 1 × PBS 缓冲液中过夜。
2.清洗固定的胚胎3次用 1 × PBS （每次 5 分钟）并在 4°C 下将它们在含有 30% 蔗糖的 1 × PBS 缓冲液中孵育过夜。
3.将胚胎转移到塑料模具中以制备带有软尖端的冷冻样品，去除蔗糖缓冲液，并添加 OCT (Tissue- tek )。将胚胎定向到模具中的适当位置后，将块冷冻在干冰上。块可以在 -80°C 下储存长达数月。
4.冷冻块切成 20 μm的部分。将切片放在Superfrost Plus 载玻片（Fisher Scientific）上后，将这些载玻片在室温下干燥2-3小时，然后在-80 °C 下储存直至使用。

C.全装荧光免疫染色
1.在 PBS-T 中清洗冷冻的冷冻切片 5 分钟，然后在 4°C 的封闭缓冲液中预孵育过夜或更长时间。
2.封闭后，将冷冻切片与封闭缓冲液中的一抗在 4°C 下孵育过夜。
3.对于那些不继续使用LR- ExM的样品，用 PBS-T 彻底清洗冷冻切片 5 次× 10 分钟，并与 Alexa ® -结合山羊抗兔 (Alexa 568)、山羊抗鸡 (Alexa 488)、山羊抗小鼠 (Alexa 488) 或山羊抗豚鼠 (Alexa 647) 二抗（按 1:1,000 稀释）在封闭缓冲液中，室温作用 2 小时以上或 4°C 过夜。
4.用 PBS-T 清洗样品两次，然后用 PBS 清洗 3 次（每次 10 分钟）。
5.在 PBS 中用 50% 甘油孵育样品 1 小时，然后在成像前在 80% 甘油/PBS 中渗透过夜。

D.标签保留扩展显微镜 ( LR-ExM )
1.对于用于LR-ExM的冷冻切片，在如上所述孵育一抗后，将它们与三功能接头[NHS-MA-生物素缀合的抗鸡（或抗兔）IgG-用于可视化 Par-3 和NHS-MA-DIG 偶联的抗豚鼠 IgG — 用于在 4°C 黑暗中在封闭缓冲液中观察 Dlic1（200 mg/mL 原液，使用前稀释 1:100）]。
2.在黑暗中在 PBS（每次 5 分钟）中洗涤后，将 40 μL新鲜制备的凝胶溶液添加到每个部分以覆盖整个组织样本。在加入 TEMED 和 APS 之前，通过使用真空泵将凝胶单体溶液脱氧 15 分钟以上来制备凝胶溶液，以增强三功能接头的作用。
3.将切片避光，在湿度箱中孵育，并在37°C 下凝胶化 1 小时。
4.凝胶化样品在玻片上的消化缓冲液（参见配方）中在 37°C 下孵育4 小时或在室温下过夜。使用了至少 10 倍过量的消化缓冲液（每张载玻片 > 5 mL）。充分消化可使嵌入凝胶中的切片从玻璃表面滑落。
5.在每孔至少 5 mL 的 6 孔板中，用 150 mM NaCl 的过量体积清洗凝胶嵌入样品四次（每次20-30 分钟）。
6.洗去消化缓冲液后，用 3 – 5 μM Alexa Fluor ® 488-Streptavidin、3 – 5 μM山羊抗地高辛/地高辛Dylight ® 594、抗小鼠 Atto647N (1:500) 和 DAPI (1:1,000) 在黑暗中在 4°C 下放置 24 小时。
7.在 4°C 的黑暗中，用 Milli-Q 水（每次洗涤 30 分钟）洗涤凝胶嵌入样品四次。样品在洗涤后膨胀到其原始大小的大约四倍，然后就可以进行成像了。

E.共聚焦显微镜
使用共聚焦显微镜（Nikon CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield confocal microscope，Nikon Imaging Core at UCSF）以 0.26 μ m z 步长，使用 100 × Oil 物镜扫描没有 LR- ExM的免疫染色样品。使用相同的共聚焦显微镜以 0.26 μ m z 步长扫描LR-ExM样品，使用 60 ×水浸 (WI) 物镜。

数据分析

我们最近的出版物 (Zhao et al ., 2021)中描述了胞浆 Par-3 与 Dlic1 和Dld内体在有丝分裂 RGP 中的共定位。我们选择了两个新生子细胞核之间的中心平面区域作为感兴趣区域 (ROI)，用于对获取的图像中的 Par-3、Dlic1 和Dld内体进行共定位分析。

A.对斑马鱼胚胎前脑免疫染色的 RGP 细胞图像进行分割，生成覆盖细胞中央细胞质区域的 10 个连续 z 平面的最大强度投影（0.26 μ m z 步长间隔，最大 Z 平面覆盖 2.6 μ m厚度）。
1.对于免疫染色样品的图像，将 RGP 子细胞分裂的两个细胞核之间的 60 × 100 像素（1 像素 = 0.065 μm ）区域裁剪并保存用于斐济的共定位分析（斐济只是 ImageJ）（图 1A ）。
2.对于LR-ExM处理样品的图像，选择核之间的中央细胞质区域中 120 × 200 像素（1 像素 = 0.11 μ m ）的区域用于JACoP共定位分析。

B.JACoP （Just Another Co-localization Plugin）被安装到 FIJI 中，如果它不在插件列表中的话。然后，我们拆分裁剪图像的通道，并选择这三个通道进行共定位分析以显示在桌面上（图 1B）。
可以从https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop2.html找到并下载JACoP

C.运行JACoP进行共定位分析
1.打开从步骤 A裁剪出来的图像。
2.如果它们被合并，则将通道拆分为一个综合 tiff 文件（图 1B)。
a.图像>颜色>分割通道
3.打开JACoP
a.插件> JACoP （图 1C）。
b.单击它以在 FIJI 下打开一个新的JACoP插件窗口（图 2）。

图 1. 为共定位分析准备分段 RGP 图像。
一个。切割并保存分裂细胞核之间的中央细胞质区域（图像中的白色矩形为 60 × 100 像素。大小由在斐济突出显示 w 和 h 的红线显示）。乙。图像被分成三个单通道图像。 C.在 FIJI 的“插件”中定位并选择JACoP 。

图 2. 选择通道、M1 & M2 系数、阈值和Costes自动阈值的界面。
C1 和 C2 中的两个图像说明了设置阈值后的效果。

4.在窗口顶部，选择并比较已由 FIJI 在“图像 A”和“图像 B”下打开的两个不同通道（C1 和 C2）的图像（左侧面板在图2）。
5.在“Just Another Colocalisation Plugin”窗口中选择 M1 & M2 系数（ Manders的系数）分析（图 2 中的左面板）。
6.在应用分析之前，请检查红色选项卡以获取所需的设置。在JACoP中选择正确的函数进行分析，请参考插件介绍（ Cordelieres 和博尔特，2008）。在我们的研究中，我们只对Manders系数感兴趣。 CCF（互相关系数）不用于我们的研究，这里不做讨论。
a.阈值（在图 2 中左面板的底部）
i.这是为独立实验设置的阈值。为了消除潜在的背景噪声，在JACoP中使用图像上的空白区域（即，没有组织样本）作为阴性对照来设置每个通道的阈值。
ii.图 2的右面板）使用预定的自动阈值。
iii.Costes的自动阈值通常应用于每次测量，这是一种使用从分析图像生成的随机图像的散点图来识别和去除噪声的算法 ( Costes 等人，2004）。它将生成另一对自动量化的 M1 和 M2 系数。
iv.对于阴性对照图像，使用两个阈值时，M1 和 M2 系数将为“0”。
b.微。
i.这是有关您的显微镜的信息（图3A）。
ii.如果您使用从 Bio-imaging 软件（OME.TIF 或.nd 2等）获取的图像，则该信息应自动与您的图像关联（ xy 校准纳米，65； z calib nm，260，用于 100 ×物镜）。
iii.输入波长激发信息。
c.科斯特兰° _
i.最小“ xy块大小”可以设置为 2。“z 块大小”始终设置为 1，因为我们分析了图像堆栈的 Max-Z 投影（图 3B）。
ii.您可以对此进行估计，例如：
1).共聚焦显微镜采集的所有图片大小相同，均为 2048 × 2048 像素，图像像素大小约为 65 nm。
2).通常，内体的大小大于 200 nm。
3).为了覆盖 200 nm 的距离，我们需要来自两个通道的至少 2 个像素。
4).当使用来自LR-ExM样本的图像时，最小“ xy块大小”通常设置为 4。由于样本扩大了大约 4 倍，样本中内体的最小尺寸扩大到超过 800 nm。由于我们使用 60 × WI 物镜扫描LR-ExM样本，这将图像的像素大小增加到约 110 nm。因此，要覆盖 800 nm 的距离，我们需要来自两个通道的至少 4 个像素。
d.对象。是检查参数设置的选项卡。无需更改。
7.完成每个步骤后，单击底部的“分析”（图 3 ）。结果在新窗口中生成。

图 3.选择不同选项卡时的JACoP界面演示。
A. 微。显示显微镜信息。 B. Costes ' rand° 显示xy块大小的选择以供分析。

D.为了比较所有三个通道，上述步骤应成对重复两个通道。来自同一样本的所有结果一起保存在一个 txt 中。文件。为了获得足够的重复次数以进行统计分析，对来自所有细胞的每张图像重复上述步骤。

E.Prism 9评估了每组样本中Par-3、Dlic1和Dld内体共定位的统计数据。对于同一实验的图像，还使用了Costes自动阈值的M1和M2系数进行比较。对于来自独立实验的所有图像，我们仅使用预定阈值的 M1 和 M2 系数进行比较。

F.LR-ExM样品更清楚地证明了这三种蛋白质的共定位关系。如图 4 所示，经过LR-ExM的 RGP 的大小几乎是图 1 所示正常免疫染色RGP 的四倍。共定位分析表明，从两组数据中都发现了三种蛋白质的相似共定位系数（赵等，2021）。

LR-ExM的分段图像。
A. 分裂细胞核之间的中央细胞质区域被裁剪并保存（图像中的白色矩形为150 × 250 像素。大小在 FIJI 中由 w 和 h 显示。本图改编自(Zhao et al. , 2021) ，保留部分权利；独家被许可人AAAS。根据 CC BY-NC 4.0 许可证 ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ ) 分发。 B. A中白色矩形区域的图像被分割成三个单通道图像，没有显示DAPI。分割区域的大小已显示在每帧的顶部。

笔记

1.LR-ExM的凝胶缓冲液只能新鲜制备以达到稳定的效果。
2.将所有与荧光团缀合的二抗离心并分装（每管 20 μL ）到遮光的 Eppendorf 管中，并储存在-80 ° C 冰箱。
3.LR-ExM的三功能链接器只能存储在 4 °C ，避光。

食谱

1.30 × 丹尼奥胚胎培养基
1740 mM NaCl、21 mM KCl 、12 mM MgSO 4 · 7H 2 O、18 mM Ca( NO 3 ) 2、150 mM HEPES 缓冲液
2.用于免疫染色的封闭缓冲液
0.1% Tween 20、0.25% Triton X-100、1% 二甲基亚砜 (DMSO) 和 5% 正常山羊血清，溶于 1 × PBS，pH 7.4。
3.洗涤缓冲液
1 × PBS 含 0.05% Tween 20
4.消化后染色缓冲液
10 mM HEPES，150 mM NaCl 的MilliQ水，pH 7.5
5.单体溶液：
丙烯酸钠 0.86 g/mL，丙烯酰胺 0.25 g/mL， N,N'-亚甲基双-丙烯酰胺 0.015 g/mL，氯化钠 1.17 g/mL，PBS 溶液 (1 × )。

LR-ExM凝胶缓冲液和消化缓冲液按照原始出版物(Shi et al ., 2021)中的说明制备：
6.凝胶缓冲液
190 μL单体溶液， 5 μL 8 % TEMED和 5 μL 8% APS。
7.消化缓冲液
50 mM Tris pH 8.0、1 mM EDTA、 1 M NaCl、 0.5% Triton X-100中 8 单位/mL 蛋白酶 K

致谢

该协议改编自之前发表的论文(Zhao et al. , 2021) 。我们感谢DeLaine Larsen、Kari Herrington 和 UCSF 尼康成像中心在成像和数据分析方面的帮助。我们也感谢 Tadashi Uemura博士和Xiaoyu Shi 博士分别分享了免疫染色和LR-ExM所需的 DLIC 抗体和三功能接头。该项目得到了 NIH R01NS120218 和 UCSF Mary Anne Koda -Kimble Seed 创新奖的支持。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

所有动物实验均由美国旧金山加利福尼亚大学的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准。

参考

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