材料和试剂

1. 移液器吸头（VWR，目录号：613-0239）
2. 载玻片（Brain Research Laboratories，目录号：5075 和 3040）
3. 铜/聚酰亚胺 (Cu/PI) 薄膜 ( Dupont TM Pyralux ® ，目录号：AC181200RY）
4. Wescorp抗静电高温聚酰亚胺胶带（ Desco ，目录号：81270）
5. 光敏电阻（AZ ® ，目录号：AZ1518）
6. 焊接用芯线（多芯，目录号：397952）
7. 电气元件 [以前工作的补充图 1 ( Kim et al ., 2021 )]
8. 纱布（ Medique ，目录号：60673）
9. 6-0丝线（Braintree Scientific，目录号：NC9201232）
10. 3-0 PGA 缝合线（Pro Advantage，目录号：P420493）
11. 5-0 PGA缝合线（ Stoelting ，目录号：50495）
12. 4-0 尼龙缝线（Pro Advantage，目录号：P420661）
13. Betadine（Fisher Scientific，目录号：19-027132）
14. 70％异丙醇（Fisher，目录号：19-027026）
15. 2-丙醇（Fisher Chemical，目录号：190971）
16. 无水甲醇（Macron，目录号：3016-16）
17. 丙酮（Macron，目录号：2440-16）
18. 开发者解决方案（AZ ® , AZ Developer 1:1）
19. 铜蚀刻剂（Alfa Aesar TM ，目录号：Z03E099）
20. 助焊剂免清洗无铅（Chip Quik ，Inc.，目录号：SMD291NL）
21. 聚二甲基硅氧烷 (PDMS) (Dow ® , Sylgard TM 184 Silicone Elastomer Kit)
22. DAPI Fluoromount -G（ SouthernBiotech ，目录号：0100-20）
23. 酮洛芬（Sigma，目录号：K2012-5G）
24. 异氟醚（Piramal NDC 66794-017-10）
25. 材料清洁（见食谱）
26. 电样品清洗（见配方）
27. 光敏电阻旋涂（见配方）
28. 紫外光刻和湿法蚀刻（见配方）
29. PDMS 制备（见食谱）

设备

1. 剪刀（精细科学工具，目录号：14090-09）
2. 磁性牵开器（Fine Science Tools，目录号：18200-20）
3. 抹刀（精细科学工具，目录号：10091-12）
4. Graefe刀（Fine Science Tools，目录号：10059）
5. Graefe镊子（Fine Science Tools，目录号：11153-10）
6. 波恩动脉剪刀，球尖（Fine Science Tools，目录号：14086-09）
7. 环形镊子（Fine Science Tools，目录号：11103-09 ）
8. 32G针头（Hamilton，75SN注射器，目录号：87908）
9. 细尖杜蒙钳（Fine Science Tools，目录号：11251-20）
10. 平头镊子（Fine Science Tools，目录号：11220-21）
11. Dumont镊子（精细科学工具，Dumont #5SF 镊子）
12. 无菌一次性手术刀 ( TruMed ©, 190618)
13. 旋涂 (SCS, G3P-8)
14. Isotemp搅拌加热板 (Fisher Scientific, SP88850200)
15. 紫外光刻（EV Group，EVG610）
16. 立体显微镜（AVEN，SPZT 50）
17. 焊锡机 (Weller, WD1002/WP80)
18. 毫克天平（智能称重技术，PM-300）
19. 真空泵（Across International，EasyVac-9）
20. 真空烤箱（Across International， Accu Temp 1.9）
21. 烤箱（Quincy La, Inc.，30 型实验室烤箱）
22. 射频发生器（FEIG Electronic，ID ISC.LRM2500-A）
23. 动态天线调谐器，匹配板（FEIG Electronic，ID ISC.DAT）
24. Nanoject II 自动纳升注射器（Drummond Scientific Company，3-000-204）
25. 激光扫描共聚焦显微镜（Olympus，FV1200）
26. 荧光显微镜（尼康，Eclipse E600）

软件

1. ISO Start2017 v9.9.10 (FEIG Electronic GmbH)
2. BioDAQ Viewer v. 2.2.01（研究饮食）

程序

A. 洁净室设施的图案准备（视频 1）
1. 准备一个灵活的 Cu/PI 双层薄膜，安装在载玻片上，并用聚酰亚胺胶带固定（图 1A）。
2. 遵循材料清洁配方（参见配方 1）。
3. 使用旋涂机在 Cu/PI 薄膜上沉积 2.5 μ m厚的光刻胶层。
4. 105°C 下烘烤 1 分钟。
5. 等待样品表面冷却至室温 3 分钟。
6. 遵循 UV 光刻和湿法蚀刻配方（图 1B - 1C，参见配方 4）。
7. 遵循材料清洁配方（参见配方 1）。

视频 1. 器件基板的制造

B. 在标准实验室设施中焊接电气元件（视频 2）
1. 使用焊接机将组件安装在图案上 [以前工作的补充图 1（ Kim等人，2021 年） ]。
2. 遵循电气样品清洁配方（参见配方 2）。
3. 使用手术刀从 Cu/PI 双层膜上切割样品的边界（图 1F - 1H）。
4. 确认无线电力传输系统内的设备操作（图 1G）。

视频 2. 设备制造

C. 在标准实验室设施中封装（视频 2）
1. 遵循 PDMS 制备配方（参见配方 5）。
2. 将 PDMS 应用于设备并在室温下使用真空烘箱去除气泡。
制作预弯曲结构时，请参阅 B 部分中的注释（图 1H）。
3. 在 80°C 的烘箱中固化样品 1 小时。
4. 如果需要，使用手术刀修剪封装在 PDMS 中的样品的边界。
5. 在将设备植入动物之前执行设备质量控制（图 1I）。

图 1. 设备制造程序。
A – D. 通过紫外光刻和湿法蚀刻程序，在 Cu/PI 双层膜上定义了包括焊盘和互连的图案。 E – F. 所有电气元件均使用助焊剂和焊锡丝焊接。特别是， μLED系绳被另一个 Cu/PI 双层膜覆盖以增加耐用性。 G. 在封装步骤之前，确认设备使用无线电力操作。 H. 系绳以弯曲结构（预弯曲）涂有 PDMS，有助于减少胃内自然运动的压力。 I. 这产生了一种柔软、灵活且重量轻（约 380 毫克）的无线胃光遗传学植入物。比例尺：1 厘米。

D. 无线电力传输系统设置
1. 设置硬件（图 2A）：
a. 将电源连接到射频发生器（图 2B）。
b. 通过射频电缆将射频发生器连接到匹配板（图 2C）。
c. 将天线连接到匹配板（图 2D）。线圈天线由尺寸为 1 英寸 x 30 英寸的铜板 (Onlinemetats.com) 制成。天线的设计使其以 13.56 MHz 共振。使用矢量网络分析仪测量天线可以匹配 13.56MHz 的天线谐振频率。将电容器并联到线圈，以调整天线的谐振。

图 2. 无线电力传输系统的硬件设置。
A. 无线电力 TX 系统的组件。 B. 射频发生器的电源连接。 C. 通过射频同轴电缆连接射频发生器和匹配板。 D. 将 TX 天线连接到匹配板上。

2. 软件操作（ISO Start2017 v9.9.10）：
a. 通过 USB 电缆将射频发生器连接到 PC（图 3A）。
b. 使用“主机模式”检测天线（图 3B）。
c. 设置 TX 功率电平（图 3C）。
d. 使用动态天线调谐器功能调谐天线，使天线的阻抗在 13.56 MHz 时调整为 50 Ω（图 3D - 3E）。
e. 检查调整状态（图 3F）。
3. 使用示例设备确认无线电力传输系统（图 3G）。

图 3. 软件手册。
A. 首先，将射频发生器连接到PC，通过软件进行控制。 B. 检测通过射频发生器供电的天线。 C. 设置 TX 功率电平。 D. 执行天线调谐以将阻抗调整为 50 Ω，以实现最大功率传输。 E. 用矢量网络分析仪确认 50 Ω 的阻抗。 F. 检查调谐状态。 G. 将设备放入笼子（无线电源传输系统）并确认设备的照明。

E. 结节神经节注射（ Calik 等人，2014）
1. 在手术麻醉下（异氟醚，Piramal NDC 66794-017-10），用小毛发修剪器（Wahl BravMini +）剃毛动物的颈部区域。
2. 皮下给予酮洛芬镇痛剂。
3. 用 3 次交替使用 betadine 和酒精的擦洗剂进行消毒。
4. 将动物放在它的背上，并在脖子上放置无菌悬垂。悬垂应该在中心有一个开口，以允许切口。
5. 使用锯齿钳，提起皮肤，从锁骨到下颌区域做一个 1.5 厘米的中线切口，露出颈部肌肉。
6. 分离颈阔肌、胸骨舌骨肌和omohyoideus肌肉，例如将闭合的剪刀尖端插入结缔组织并打开剪刀，以分解结缔组织。注意不要损坏颈动脉，因为如果动脉被划伤，手术将是终点。
7. 利用磁性牵开器拉开肌肉组织并暴露颈动脉。
8. 迷走神经位于颈动脉鞘内。用小抹刀将神经和血管分开，另一只手用Graefe刀切开鞘。
9. 将神经追踪到颈静脉孔。根据动物的不同，神经节可能位于孔内。将丝线缝合在神经下方，并将缝合线固定在磁性柱上。这将有助于可视化神经节，并为注射病毒提供张力。
10. 可视化神经节后，用连接到Nanoject II的玻璃微量移液器注射病毒（200 nL ）。
11. 取下牵开器并将肌肉组织放回其原始位置。
12. 用间断的针迹关闭皮肤（使用 6-0 丝线缝合）。

F. 胃靶向装置植入（视频 3）
1. BravMini +）剃毛动物的腹侧。
2. 皮下给予酮洛芬镇痛剂。
3. 用 3 次交替的 betadine 和 70% 异丙醇擦洗消毒。
4. 将动物放在它的背上，并在其腹部放置无菌啮齿动物手术窗帘。悬垂应该在中心有一个开口，以允许切口。
5. 使用Graefe钳，提起皮肤并沿腹部中线做一个 2 厘米的切口，以暴露腹部肌肉组织。
6. Graefe镊子提起肌肉层并剪开一个小孔。在用镊子夹住腹部肌肉的同时，插入带球尖的剪刀（以避免损坏底层组织），并从中腹部切开一个切口，延伸到剑突软骨（图 4A）。
7. 使用环钳将胃拉出腹部，并将胃放在用无菌盐水浸泡的纱布上。这样可以保持胃的水分。
8. 利用牵开器保持切口部位开放。
9. 使用 32-G 针在胃底穿刺两个相邻的孔。这些孔需要彼此相距几毫米。需要足够的组织来缝合 LED 系绳入口和出口周围，但不要相距太远，以免限制胃扩张。
10. 使用细尖的 Dumont 镊子将 LED 系绳穿入一个孔并穿出另一个孔（图 4B）。在此步骤中，钝的平头镊子也可用于处理系绳。
11. 将 µLED 置于胃内，用荷包缝合线 (5-0 PGA) 将系绳固定到位（图 4C）。
12. 确保植入区域不会与肝脏接触，否则肝脏会形成疤痕组织并与手术区域融合。
13. 将设备收割机放在下腹腔中，并将胃放回其正常方向。
14. 使用可吸收缝合线（PGA 3-0 缝合线）和不可吸收缝合线（尼龙 4-0 缝合线）的皮肤（图 4D）关闭腹壁。
15. 小鼠在手术和日常术后护理期间接受镇痛剂。

图 4. 设备植入的分步程序。
A. 用于系绳插入的胃外露。 B. 将胃光电装置插入胃的概念图。 C. 将包括μLED在内的系绳插入胃中。 D. 植入手术后检查设备运行情况。

视频 3. 手术过程
（该视频是在贝勒医学院制作的。所有动物护理和实验程序均由贝勒医学院的机构动物护理和使用委员会根据协议 AN-6598 批准。）

视频 4. 术后验证

G. 故障排除
1. 当出血发生时：
我们将设备植入远离血管的地方，不会出现过多出血。如果有血，那是极少的，可以用无菌棉签清洗。定义典型的成功手术包括将动物送回笼子，并且不会发生术后并发症或动物死亡。
我们以前没有经历过胃植入物的严重并发症。与任何外科手术一样，建议术后7-10 天监测体重。如果动物体重减轻或出现不适，则在手术期间和每天提供镇痛剂。如果小鼠体重低于起始体重的 80%，我们会对它们实施安乐死。
2. 手术期间和手术后的动物死亡率：
胃植入物的成功率几乎是 100%（视频 4）。最严重的程序是将病毒注射到结节神经节中。我们建议在单独的手术过程中注射病毒。如果血管被刺破，最常见的死亡原因是手术期间出血。如果小鼠从单侧病毒注射手术中醒来，并且注意不损伤颈部肌肉，则存活率很高 (95%)。双侧病毒注射的死亡率约为 15-20%。我们认为这是由于双侧神经损伤和呼吸困难。

数据分析

A. 在标准实验室设施进行设备测试
1. 打开无线电力传输系统。
2. 检查笼中所有位置和高度的设备操作[以前工作的补充图 11 和 12 （ Kim等人，2021 年） ]。

B. 标准实验室设施的设备质量控制
1. 遵循设备测试步骤（第一次测试）。
2. 将设备浸入 10% PBS 溶液中 24 小时 [以前工作的补充图 6 （ Kim等人，2021 年） ]。
3. 在此浸没条件下执行设备测试步骤（第 2 次测试）。
4. 在电气样品清洁配方之后，按照设备测试步骤（第 3次测试）进行操作。

C. 动物模型中的设备操作
1. 打开无线电力传输系统。
2. 将植入设备的动物放入笼子中。
3. 检查腹腔中的 LED 指示灯。
4. 实验结果在图 3 和图 4 中来自之前的工作 ( Kim et al ., 2021) 。

D. 病毒表达的证明
1. 实验后，麻醉（ Beuthanasia ，320 mg/kg，腹膜内给药）小鼠并用 1 × PBN 或生理盐水进行心内灌注，而不是肝素或 EDTA （Gage等人，2012），然后是 4% 多聚甲醛。
2. 提取大脑、结节神经节和胃，在 4% 多聚甲醛中过夜后固定，并在含有 30% 蔗糖的 PBS 中冷冻保护，直到组织在蔗糖溶液中沉到底部。
3. 收集大脑、结节神经节和胃组织（30、20 和 10 μm厚）的冠状低温恒温器切片，并将它们直接安装在显微镜载玻片上。
4. 使用 DAPI Fluoromount -G 封固剂 ( SouthernBiotech ) 的盖玻片样品。
5. 实验结果在之前工作的图 3c-e 中 ( Kim et al ., 2021) 。

笔记

A. 电气元件的焊接
1. 将焊锡丝涂在图案的焊盘上。
2. 使用少量助焊剂和焊线将组件连接到焊盘上。
3. 在μ LED位置附近制作一个小孔，用于定义的μ LED照明。

B. 预弯曲结构的封装
1. 使用夹子夹住设备，将设备塑造成预先弯曲的设计；然后，使用移液器尖端应用少量 PDMS（图 1H）。
2. μ LED附近的预弯曲结构。
3. 将设备的其余部分浸入 PDMS，然后在烤箱中固化。

食谱

1. 材料清洗
a. 用丙酮冲洗 10 s。
b. 用甲醇冲洗 10 秒。
c. 用异丙醇冲洗 20 秒。
d. 用蒸馏水（单蒸馏，实验室级）冲洗 1 分钟。
e. 在 105°C 的热板上干燥样品直至完全干燥。
2. 电样品清洗
a. 将样品浸入异丙醇中 5 分钟。
b. 将样品浸入蒸馏水中 5 分钟。
c. 用蒸馏水冲洗 1 分钟。
d. 在 80°C 的烘箱中干燥样品直至完全干燥。
3. 光敏电阻旋涂
a. 将 1 mL 的光刻胶放在基板的中心，没有气泡。
b. rpm的速度旋涂。 20 秒。
4. 紫外光刻和湿法蚀刻
a. 仔细对齐样品和图案掩模。
b. 用 100 mJ /cm 2强度的紫外灯照射，以平版印刷图案，用于焊盘和互连。
c. 浸入显影液中 20 s，用蒸馏水洗涤。
d. 浸入铜蚀刻剂中 7 分钟。
e. 遵循材料清洁配方。
5. 聚二甲基硅氧烷制备
a. 以 10:1 的比例轻轻混合 PDMS 套件。
b. 将混合的 PDMS 置于室温下的真空烘箱中，直到所有气泡都被去除。
c. 将空气排放到正常压力值。

致谢

这项工作得到了跨学科 X-Grants 计划的资助，该计划是德克萨斯 A&M 大学总统卓越基金的一部分、大脑与行为基金会 2018 年 NARSARD 青年研究员奖以及国家科学基金会精密先进技术和卫生系统工程研究中心对于服务不足的人群（PATHS-UP；EEC-164851）。我们感谢华盛顿大学的 Carlos Campos 博士进行体内实验。该协议改编自之前的工作（Kim等人，2021）。

利益争夺

手稿的主题受 Texas A&M Technology Commercialization (TTC) Ref. 的保护。和标题（5687TEES21，用于治疗肥胖症的植入设备和技术）。

伦理

所有动物护理和实验程序均由贝勒医学院的机构动物护理和使用委员会根据协议 AN-6598 批准。

参考

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