材料和试剂

1.黄油纸
2.卫生纸/ Kimwipes
3.15 mL螺帽锥形管（ Sarstedt ，目录号：NC1377856）
4.96孔微孔板（Greiner CELLSTAR ® ，目录号：655180）
5.硝酸（65%）（Merck，目录号：1.00456.1000，室温储存）
6.过氧化氢溶液（30%）（Merck，目录号：1.07209.1000，室温储存）
7.ddH 2 O
8.Bathophenanthrolinedisulfonic acid disodium salt hydrate（Sigma，目录号： B1375-5G，室温储存）
9.乙酸钠（Sigma，目录号： S8750-500G，室温储存）
10.盐酸羟胺（Alfa Aesar ，目录号： A15398.36，室温储存）
11.氯化铁（III）六水合物（Merck，目录号：1.03943.0250 ，室温下储存在干燥柜内）
12.检测溶液（见配方）
13.Fe 标准溶液（见配方）

设备

1.万纳斯剪刀
2.烘箱（热风烘箱，PREMA ® ）
3.涡流混合器（Vortex-Genie 2，科学工业）
4.热块（精英干浴培养箱，主要科学）
5.微孔板分光光度计（Power Wave XS2， BioTek仪器，安捷伦科技）

软件

1.第 5代 BioTek仪器（安捷伦科技）
2.GraphPad 棱镜版本 9

程序

A.采样
1.Estelle 和 Somerville (ES)播种营养培养基（ Estelle 和 Somerville， 1987 年），并在 4°C 的黑暗中分层至少两天，然后转移到生长室。在 21 – 22°C 下连续光照 (50 μmol m 2 s -1 ) 培养幼苗两周。
2.要将幼苗分离成芽和根以进行样品采集，请使用Vannas剪刀在下胚轴连接处的介质上切割幼苗。
3.对于芽样，在黄油纸中收集 25 - 30 个两周龄幼苗的芽。
4.对于根部样本，在黄油纸中收集 30 – 36 根两周大的幼苗。在将根放入黄油纸之前，请确保根不包含任何残留介质，其中也包含 Fe。用纸巾/ Kimwipes从根部去除任何培养基，然后用 ddH 2 O 清洗两次。然后用纸巾/ Kimwipes轻轻擦干根部。
5.– 65°C的烘箱中干燥样品至少两天。
6.确定每个样品的干重。
7.称重后，将样品转移到 15 mL 锥形管中。

B.样品消解
1.在每个管中加入 225 μL 的硝酸（65%），并拧紧瓶盖。
2.在 95°C 的加热块上孵育 6 小时，每1-2 小时涡旋一次试管。确保样品不会粘在管壁上并且不存在沉淀物，因为这些可能会影响测量。
3.小心拧开管盖，将 150 μL 的 H 2 O 2 (30%) 添加到每个管中，然后将盖子拧紧。
4.在 56°C 的加热块上孵育 2 小时，每 30-60 分钟涡旋一次，以确保没有形成沉淀物，因为这也会影响测量。
5.加入 225 µL 的 ddH 2 O。完全消化的样品应呈淡黄色，理想情况下不应有白色沉淀。
6.为了便于在以下步骤中移液，请小心地将消化的样品转移到 1.5 mL 微量离心管中。此时，样品已准备好立即用于程序 C 中的 Fe 定量，或者可以在 4°C 的黑暗中储存长达 1 个月以供以后分析。

C.标准品和样品制备，以及光谱读数
1.准备检测溶液（见配方 1）和 Fe 标准溶液（见配方 2）。
2.在微孔板中添加 5 μL 的标准/样品。为每个标准/样品运行三个技术复制。
3.将 245 μL 的测定溶液添加到每个带有标准/样品的孔中。
4.在分光光度测量之前，盖上微孔板并在黑暗中在室温下孵育 5 分钟。孵育后，标准品将变为粉红色/红色，随着Fe 含量的增加，颜色饱和度增加（图 1A），样品将根据 Fe 含量变为淡黄粉红色/橙红色。
5.在 535 nm 处测量吸光度。使用 0 Fe 标准品作为空白，将读板器归零。

数据分析

1.通过绘制平均空白校正 535 nm 吸光度值与标准浓度的关系，在 Excel 表中创建标准曲线。确保决定系数 (R 2 ) 值≥ 0.990。
2.使用从标准曲线导出的方程来计算样品中的 Fe 浓度。表 1显示了根样品中 Fe 浓度的计算。
3.将样品的 Fe 浓度除以它们各自的干重 (DW), 以获得每 g DW 的最终 Fe 浓度 (表 1 )。
4.在 Excel 或任何合适的软件中绘制最终图形。图 1B所示的代表性图是使用 GraphPad Prism 9 生成的。显示的样本数据仅代表一个生物复制品，具有三个技术复制品。一个完整的实验应该至少有三个生物学重复。

桌子。 1 根样品中 Fe 的量化计算。
标准品的分光光度读数用于绘制校准曲线。使用从斜率导出的方程计算样品中的 Fe 浓度。野生型 (Col-0) 植物、香豆素缺乏突变体 ( f6'h1-1 ; Schmid等人, 2014)和铁过度积累基因型 ( IMA2ox ; Gautam等人, 2021)生长在养分上含有 50 µM Fe-EDTA 的介质用于表示 Fe 量化。数据代表分光光度计读数的三个技术重复的标准偏差。用于进行分光光度读数的微孔板布局显示在顶部。 STD，标准； S，样品；绝对值，吸光度； DW，干重；平均，平均； SD，标准偏差。

数字。 1 Fe 2+ (BPDS) 3配合物的Fe含量依赖性颜色模式及其分光光度定量。
A.代表图显示了 Fe 2+ (BPDS) 3配合物随着 Fe 含量梯度的增加而发生的颜色变化。将等体积的测定溶液添加到 96 孔板微孔板中，其中包含不同量的 Fe（0、2.5、5、10、20 和 40 µg），重复三次。将微孔板置于暗处室温孵育 5 分钟，然后立即拍照。 B.图表显示不同样品（基因型）中的 Fe 浓度。野生型 (Col-0) 植物、香豆素缺乏突变体 ( f6'h1-1; Schmid et al. , 2014)和 Fe 过度积累基因型 ( IMA2ox ) (Gautam et al. , 2021)含有 50 μM Fe-EDTA 的营养培养基用于表示 Fe 量化。数据代表分光光度计读数的三个技术重复的标准偏差。 DW，干重。

笔记

1.该方法可用于量化在土壤和营养培养基上生长的样品中的 Fe。
2.步骤 B 到 C 需要在具有适当保护的通风柜内进行，包括防腐蚀手套、安全眼镜、实验室外套和鞋子。
3.应减少样品体积或调整试剂体积以完全消化样品。
4.仅使用高级耐酸 falcon、PTFE 或 Teflon TM管进行酸消解。确保在湿酸消化步骤期间盖紧管子。
5.虽然消化样品的体积仅为 600 µL，但出于安全原因使用 15 mL Falcon 管，并避免在热辅助消化步骤期间由于气体积聚的压力而损坏管。

食谱

1.检测溶液（100 mL）
不。试剂工作浓度添加金额
1.Bathophenanthrolinedisulfonic acid disodium salt hydrate (MW: 590.53 g/mol)1毫米0.06 克
2.乙酸钠（分子量：82.03 g/mol）0.6M4.92 克
3.盐酸羟胺（分子量：69.49 g/mol）0.48 万3.34 克
4.ddH 2 O-调整至 100 毫升
注意：在遮光瓶中制备新鲜的检测溶液，并在 4 ° C 下储存直至使用。

2.铁标准溶液
准备 50 mM FeCl 3库存溶液（50 mM FeCl 3含有 2.79 µg/µL 的 Fe）。使用此库存溶液，在 1.5 mL 微量离心管中制备 Fe 标准品，如下所示：
标准空白的性病1性病2性病3性病4性病5性病6
铁含量 (µg)01.252.55.010.020.040.0
要添加的库存量 (µL)00.450.901.793.587.1714.34
硝酸 (65%)每管 225 µL
H 2 O 2 (30%)每管 150 µL
ddH 2 O每管 225 µL

致谢

这项工作得到了科技部对 WS 的资助（资助号：108-2311-B-001-033-MY3）。用于创建代表性图形和表格的数据是从先前发表的作品中提取的（Gautam等人，2021 年）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

1.Freinbichler, W.、Misini, B.、Colivicchi, MA、Linert, W.、Tipton, KF 和 Della Corte, L. (2020)。红菲咯啉在微透析样品中与 hROS 平行测定游离铁的应用。 J神经科学方法331：108530。
2.Gautam, CK, Tsai, HH 和施密特, W. (2021)。 IRONMAN 可根据环境 pH 值调节对缺铁的反应。植物生理学187（3）：1728-1745。
3.Hirayama, T. 和 Nagasawa, H. (2017)。用于检测 Fe 离子的化学工具。 J Clin Biochem Nutr 60（1）：39-48。
4.Pré , J. 和 Benlatrèche, C. (1977)。在甲酸盐缓冲系统中使用红菲咯啉磺酸盐快速测定血清铁浓度。 Pathol Biol（巴黎） 25（3）：203-205。
5.Estelle, MA 和 Somerville, C. (1987 年)。具有改变形态的拟南芥生长素抗性突变体。 MGG 分子基因基因 206 ：200-206。
6.Schmid, NB, Giehl, RF, Doll, S., Mock, HP, Strehmel, N., Scheel, D., Kong, X., Hider, RC 和 von Wiren, N. (2014)。 Feruloyl-CoA 6'-Hydroxylase1-dependent coumarins 介导拟南芥碱性底物的铁获取。植物生理学164（1）：160-172。
7.施密特，W. (1996)。铬(III)对车前子根相关Fe(III)还原酶的影响。 J Exp Bot 47：805-810。
8.Schmidt, W.、Thomine, S. 和 Buckhout, TJ (2020)。社论：植物中的铁营养和相互作用。前植物科学10：1670。
9.Tangerås ，A . （1983 年）。从载铁大鼠分离的肝线粒体中铁含量和脂质过氧化程度。 Biochim Biophys Acta 757（1）：59-68。
10.Tsai, HH, Rodriguez-Celma, J., Lan, P., Wu, YC, Velez-Bermudez, IC 和 Schmidt, W. (2018)。东莨菪碱8-羟基化酶介导的fraxetin生产对于铁的流动至关重要。植物生理学177（1）：194-207。