材料和试剂

1. 过滤移液器吸头 10、20、200 和 1,000 µL [例如，移液器吸头 RT UNV F（RAININ，目录号：30389172、30389189、30389186 和 30389165）]
2. 1.5 mL管[例如，DNA LoBind Tube 1.5 mL（Eppendorf，目录号：0030108051）]
3. PCR 管 [例如., Temp Assure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips, Att.光学帽（USA Scientific，目录号：1402-4700 ）]
4. Mag Attract HMW DNA 试剂盒（QIAGEN，目录号：67563）
5. g-TUBE（ Covaris ，目录号：520079）
6. 乙醇（例如，FUJIFILM WAKO Pure Chemical Corporation，目录号：057-00456）
7. 无核酸酶水（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9930）
8. 甲酰胺（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：064-00423）
9. NEBNext Enzymatic Methyl-seq 试剂盒（New England Biolabs，目录号：E7120S）
10. KOD One PCR Master Mix（TOYOBO，目录号：KMM-101）
11. 连接测序试剂盒（Oxford Nanopore Technologies，目录号：SQK-LSK110）
12. PromethION 流通池（Oxford Nanopore Technologies，目录号：FLO-PRO002）
13. NEBNext Ultra II End Repair/ dA -Tailing Module（New England Biolabs，目录号：E7546）
14. NEBNext FFPE DNA Repair Mix（New England Biolabs，目录号：M6630）
15. NEBNext 快速连接模块（New England Biolabs，目录号：E6056）
16. Qubit ds DNA HS Assay 试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32854）
17. Agilent DNA 12000 试剂盒（Agilent Technologies，目录号：5067-1508）
18. 阿让库尔 AMPure XP（Beckman Coulter，目录号：BC-A63880）
19. DNA Clean & Concentrator-5（ Zymo Research，目录号：D4013）
20. ProNex大小选择性 DNA 纯化系统（Promega，目录号：NG2001）
21. TET2 反应缓冲液（见配方）
22. 70% 和 80% (v/v) 乙醇（见配方）
23. ProNex大小选择性 DNA 纯化系统 (NG2001) 的洗涤缓冲液（参见配方）

设备

1. PromethION测序装置（Oxford Nanopore Technologies，目录号：PRM48BasicSP）
2. 2100 Bioanalyzer Instrument（Agilent Technologies，目录号： G2939BA ）
3. 热循环仪[例如，T100热循环仪（Bio-Rad，目录号：1861096）]
4. Qubit 4 荧光计（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q33238）
5. 涡流混合器[例如，Vortex-Genie 2（Scientific Industries，目录号：SI-0236）]
6. 高速离心机（例如，MDX-310 with rack for 2 mL × 24 管，TOMY SEIKO）
7. 用于1.5 和 0.2 mL管的台式离心机 [例如， MyFuge迷你离心机（Benchmark Scientific，目录号：C1008-B）]
8. 1.5 和 2 mL管的磁性支架[例如，DynaMag-2（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）]
9. 用于 0.2 mL 管的磁性支架 [例如，10 × Magnetic Separator（10 × Genomics，目录号：120250）]
10. 适用于 10、20、200 和 1,000 μL 吸头的移液器
11. 用于 0.2 mL PCR 管和 1.5 mL 管的架子

软件

1. Python3（版本 3.8.6 ， https: //www.python.org/downloads/ ）
2. pysam （版本 0.17.0， https://github.com/pysam-developers/pysam ）
3. minimap2（2.22 版）（李，2018）
4. 桑巴巴（0.7.1 版）（Tarasov等人， 2015 年）
5. samtools (1.9 版) (Li et al ., 2009)
6. 集成基因组查看器 (IGV)（版本 2.5.3）（ Thorvaldsdóttir 等人， 2013)

程序

A. DNA提取
MagAttract HMW DNA 试剂盒用于根据制造商的说明从培养细胞（<2 × 10 9 个细胞）和/或临床标本（<25 mg 组织）中提取 DNA，无需修改（注 1）。

B. DNA片段化
对于基因组 DNA 的片段化，将用无核酸酶水 (NFW) 稀释的 150 µL DNA (<4 µg) 添加到g-TUBE 中，并在 4,700 × g和室温 (RT) 下离心两次1 分钟。使用带有安捷伦 DNA 12000 试剂盒的生物分析仪，按照制造商的方案（注 2）测量片段化 DNA 的浓度和长度分布。将 10 – 50 ng 片段化 DNA 用于下一步，用 NFW 稀释至 50 µL 体积。

C. 末端修复和适配器结扎
1. 在热循环仪中设置步骤 3、5 和 12 的程序。
2. 将 50 μL 的片段 DNA、7 μL 的NEBNext Ultra II End-Prep 反应缓冲液和 3 μL 的NEBNext Ultra II End-Prep 酶混合物混合在 PCR 管中。通过移液混合。
3. 在 20°C 孵育30 分钟，在 65°C 孵育 30 分钟，然后在热循环仪中保持 4°C，加热盖设置为 75°C。
4. 添加 2.5 μL 的NEBNext EMseq适配器、1 µL NEBNext Ligation Enhancer 和 30 µL NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 加入样品。通过移液混合。
5. 在 20°C 下孵育 15 分钟，然后在热循环仪中保持 4°C，并关闭加热盖。
6. 将 110 μL 的NEBNext样品纯化珠添加到样品中。通过移液混合。在 RT 孵育 5 分钟。
7. 将管子放在0.2 mL 管子的磁性支架上，直到变得清晰（大约需要 2 分钟）（图 2）。取出并丢弃上清液。
8. 在管中加入 200 μL 的 80% 乙醇。 30 秒后，取出并丢弃上清液。
9. 重复步骤8 一次。
10. e上向下旋转（在 RT下约为2,000 × g ）。将管子放在磁性支架上。完全去除并丢弃剩余的上清液。
11. 将颗粒风干 1 分钟。
12. 从磁性支架上取下管子。加入 EMseq 试剂盒中的 29 µL 洗脱缓冲液，在 37°C 的热循环仪中孵育 10 分钟，从珠子中洗脱 DNA。
13. 将管子放在磁性 st 上，直到它变得清晰（大约需要 2 分钟）（图 2）。将 28 μL 的上清液转移到新的 PCR 管中。

图 2.通过磁力架分离珠子。
(A) 磁分离前的悬浮珠。 (B)珠子分离不足。溶液略微混浊。 (C) 珠子的充分分离。解决方案很明确。

D. 5 mC's /5 hmC's 的氧化
1. 在热循环仪中设置步骤 5、7 和 14 的程序。
2. EMseq试剂盒中添加 10 μL 的 TET2 反应缓冲液、1 μL 的氧化补充剂、1 μL 的 DTT、1 μL 的氧化增强剂和 4 μL 的 TET2 。通过移液混合。
3. 在新的 1.5 mL 管中，将 EMseq 套件中的1 μL 的 500 mM Fe ( II) 溶液稀释到 1，249 μL的 NFW 中。
4. 中加入 5 μL 的稀释Fe ( II) 溶液。通过移液混合。
5. 在热循环仪中 37°C 孵育，加热盖设置为 45°C 1 小时。
6. 在样品中加入 1 μL 的停止试剂。通过移液混合。
7. 将加热盖设置为 45°C ，在热循环仪中 37°C 孵育30 分钟。
8. 90 μL NEBNext样品纯化珠添加到样品中。通过移液混合。在 RT 孵育 5 分钟。
9. 将管子放在0.2 mL 管的磁性支架上，直到变得清晰（大约需要 2 分钟）（图 2）。取出并丢弃上清液。
10. 在管中加入 200 μL 的 80% 乙醇。 30 秒后，取出并丢弃上清液。
11. 重复步骤 10 一次。
12. 从磁性支架上取下试管并在台式离心机上旋转。将管子放在磁性支架上。完全去除并丢弃剩余的上清液。
13. 将颗粒风干 1 分钟。
14. 从磁性支架上取下管子，直到它变得清晰（大约需要 2 分钟）（图 2）。通过添加 EMseq 试剂盒中的 17 µL 洗脱缓冲液并在热循环仪中于 37°C 下孵育 10 分钟，从珠子中洗脱目标 DNA。
15. 将管子放在磁性支架上，直到它变得清晰（大约需要 2 分钟）（图 2）。将 16 μL 的上清液转移到新的 PCR 管中。

E. 胞嘧啶的变性
1. 在热循环仪中设置步骤 3 的程序。
2. 在样品中加入 4 μL 的甲酰胺。通过移液混合。
3. 在加热盖设置为 95°C 的热循环仪中在 85°C 下孵育10 分钟，然后立即置于冰上。

F. 胞嘧啶脱氨
1. 在热循环仪中设置步骤 3 和 10 的程序。
2. 从 EMseq 试剂盒中将68 μL 的 NFW、10 μL 的 APOBEC 反应缓冲液、1 μL 的 BSA 和 1 μL 的 APOBEC添加到样品中。通过移液混合。
3. 在 37°C 下孵育 3 小时，然后在 4°C 下保持在热循环仪中，加热盖设置为 45°C。
4. 将 EMseq 套件中的100 μL NEBNext样品纯化珠添加到样品中。通过移液混合。在 RT 孵育 5 分钟。
5. 将管子放在0.2 mL 管子的磁性支架上，直到变得清晰（大约需要 2 分钟）（图 2）。取出并丢弃上清液。
6. 加入 200 μL 的 80% 乙醇。 30 秒后，取出并丢弃上清液。
7. 重复步骤 6 一次。
8. 从磁性支架上取下试管并在台式离心机上旋转。将管子放在磁性支架上。完全去除并丢弃剩余的上清液。
9. 将颗粒风干 1 分钟。
10. 从磁性支架上取下管子。加入 41 µL NFW 并在 37°C 的热循环仪中将目标 DNA 从珠子中洗脱下来，加热盖设置为 45°C 10 分钟（注 3）。
11. 将管子放在磁性支架上，直到它变得清晰（大约需要 2 分钟）（图 2）。将 20 μL 的上清液转移到两个 PCR 管（每管包含上清液）。

G. PCR扩增
1. 在热循环仪中设置步骤 3 的 PCR 程序。
2. 在每个管中添加 5 μL 的自定义底漆混合物（每个 10 μM，如表 1 中所述）和 25 μL 的 KOD ONE PCR 主混合物。通过移液混合。
3. 使用以下 PCR 程序对两个试管进行 PCR 扩增：13 – 16 个循环，94 °C 15 秒，57°C 5 秒，68°C 15 分钟，然后保持在 4°C。 PCR 循环的数量取决于输入 DNA 的数量（10 ng DNA 输入 16 个循环，50 ng DNA 输入 13 个循环）和 DNA 质量。

表 1. PCR 程序
温度时间循环
94 ℃ 15 秒
1 3–16
57 ℃ 5 秒
68 ℃ 15 分钟
4 ℃ 旧_ 1

4. 将单独放大的样品合并到一个管中。根据制造商的说明，使用 DNA Clean & Concentrator-5 纯化柱纯化样品。加入 52 µL 在 70°C 下预孵育的 NFW，从柱中洗脱 DNA。通过将 52 μL 的流通液添加回色谱柱来重复洗脱步骤。使用 Agilent DNA 12000 试剂盒测量纯化 DNA 的质量（图 3A）。

表 2. 自定义引物序列
底漆
正向引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
反向底漆 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

H. 尺寸选择
1. 在热循环仪中设置步骤 8 的程序。
2. 将 41 – 45 µL ProNEX Chemistry (0.82 – 0.9 × ) 添加到 50 µL DNA 中。在 RT 孵育 10 分钟。
3. 将管子放在0.2 mL 管子的磁性支架上，直到变得清晰（大约需要 2 分钟）（图 2）。取出并丢弃上清液。
4. 加入 200 μL 的洗涤缓冲液。 30 秒后，取出并丢弃上清液。
5. 重复步骤4 一次。
6. 从磁性支架上取下试管并在台式离心机上旋转。将管子放在磁性支架上。完全去除并丢弃剩余的上清液。
7. 将颗粒风干 1 分钟。
8. 从磁性支架上取下管子。通过添加 51 μL从珠子中洗脱目标 DNA NFW 并在热循环仪中在 37°C 下孵育，加热盖设置为 45°C 10 分钟。
9. 将管子放在磁性支架上，直到它变得清晰（大约需要 2 分钟）（图 2）。转移 50 µ L 将上清液转移到新的 PCR 管中。使用 Agilent DNA 12000 试剂盒（注 2）和 Qubit ds DNA HS 检测试剂盒（图 3B）（注 4）评估纯化 DNA 的质量和数量。

图 3. 碱基转换 DNA 的扩增子。
(A 和 B) 碱基转换 DNA (A) 在大小选择之前和 (B) 之后的扩增子分布。使用 Agilent DNA 12000 试剂盒对 DNA 进行定量。使用来自乳腺癌细胞系 BT-474 ( Lasfargues ) 的 50 ng 片段 DNA 进行反应。等人， 1978 年）。使用 KOD ONE PCR Master Mix 和表 1 中描述的引物，通过 13 个聚合酶链反应循环进行扩增。使用 0.82 ×体积的ProNEX Chemistry 进行扩增 DNA 的大小选择。

I. 纳米孔测序文库制备
1. 在热循环仪中设置步骤 3 和 22 的程序。
2. 将 48 µL 样品、3.5 µL NEBNext FFPE DNA 修复缓冲液、3.5 µL Ultra II End-Prep Reaction Buffer、2 µL NEBNext FFPE DNA Repair Mix 和 3 µL Ultra II End-Prep Enzyme Mix 混合在一个新的PCR 管。通过轻弹试管混合并在台式离心机上旋转。
3. 在 20°C 孵育5 分钟，然后在 65°C 孵育 5 分钟。
4. 加入 60 μL 的AMPure XP 珠子。通过轻弹试管混合并在台式离心机上旋转。
5. 在 RT 孵育5 分钟。
6. 将试管放在 0.2 mL 试管的磁性支架上，直到变得清晰（大约需要 2 分钟）（图 2）。取出并丢弃上清液。
7. 在管中加入 200 μL 的 70% 乙醇。 30 秒后，取出并丢弃上清液。
8. 重复步骤7 一次。
9. 从磁性支架上取下试管并在台式离心机上旋转。将管子放在磁性支架上。完全去除并丢弃剩余的上清液。
10. 将颗粒风干 1 分钟。
11. 从磁性支架上取下管子。通过添加 61 µL NFW 并在 37°C 的热循环仪中孵育珠子中的 DNA，将加热盖设置为 45°C 10 分钟。
12. 将管子放在磁性支架上，直到它变得清晰（大约需要 2 分钟）（图 2）。将 61 μL 的上清液转移到新的 PCR 管中。使用 1 µL 的样品通过 Qubit ds DNA HS 检测试剂盒进行定量。
13. 加入 25 μL 的结扎缓冲液、10 μL 的NEBNext Quick T4 DNA 连接酶和 5 μL 的适配器混合 F。通过轻弹试管混合并在台式离心机上旋转。
14. 在 RT 孵育10 分钟。
15. 中加入 40 μL 的AMPure XP 珠子。通过轻弹试管混合并在台式离心机上旋转。
16. 在 RT 孵育5 分钟。
17. 将管子放在0.2 mL 管子的磁性支架上，直到变得清晰（大约需要 2 分钟）（图 2）。取出并丢弃上清液。
18. 从磁性支架上取下管子。通过在管中加入 250 μL 的长片段缓冲液来清洗珠子。轻弹珠子以重新悬浮后，将样品放回磁性支架。溶液澄清后，取出并丢弃上清液。
19. 重复步骤 18 一次。
20. 取下试管并在台式离心机上离心。将管子放在磁性支架上。完全去除并丢弃剩余的上清液。
21. 风干颗粒 30 s。
22. 从磁性支架上取下管子。通过从连接测序试剂盒中加入 25 µL 洗脱缓冲液从珠子中洗脱 DNA，并在 37°C 的热循环仪中孵育，加热盖设置为 45°C 10 分钟。
23. 将管子放在磁性支架上，直到它变得清晰（大约需要 2 分钟）（图 2）。将 25 μL 的上清液转移到新的 PCR 管中。使用 1 µL 的样品通过 Qubit ds DNA HS 检测试剂盒进行定量。通过在文库制备前用 DNA 的摩尔和质量浓度校正文库的质量浓度来估计制备文库的摩尔浓度。将 5–50 fmol的洗脱文库应用于下一步（注 5）。如果24 µL 文库中含有超过 50 fmol 的DNA ，用Ligation Sequencing 试剂盒中的洗脱缓冲液稀释 5–50 fmol文库至 24 µL

J. 启动和加载PromethION 流通池
1. 将 30 μL 的冲洗系绳 (FLT) 添加到一管冲洗缓冲液 (FB) 中。通过涡旋混合。
2. 将流通池设置为PromethION测序仪。通过移液去除流通池入口处的空气，以避免引入气泡。
3. 用 500 μL 的 FB/FLT 混合物为流通池注入底料。孵育 5 分钟后，用 500 μL 的 FB/FLT 混合物重新启动。
4. 将 75 μL 的测序缓冲液 II 和 51 μL 的重新悬浮加载珠 II 添加到库中。
5. 通过轻轻吹打混合。立即将 150 μL 的库加载到流通池并运行程序。 Oxford Nanopore Technologies 的社区网站上提供了用于启动和加载 PromethION 流通池的视频 ( https://community.nanoporetech.com/protocols/genomic-dna-by-ligation-sqk-lsk110/v/gde_9108_v110_revl_10nov2020/启动和加载流动池？devices=promethion ）。

数据分析

通过 Guppy 的实时碱基调用生成两个包含 1d pass reads 或 1d fail reads 的 fastq 文件， Guppy是集成到PromethION测序仪的MinKNOW软件中的碱基调用器。 fastq文件包含序列读取的碱基序列和每个碱基的质量。我们推荐使用 1d pass reads 的fastq文件，它通过了碱基质量过滤器，用于数据分析。通过亚硫酸氢盐或EMseq碱基转换后的 DNA 序列由原始链中的 A、G、T（原始 T 和未甲基化 C）和 C（甲基化 C），或PCR产生的互补链。因此，很难将序列与正常参考序列对齐。为了将 nanoEM 数据映射到参考基因组数据，我们采用了三字母比对方法——这也被用于对于Bismark ( Krueger and Andrews, 2011 )——长读对齐。在三字母方法中，为了能够比对碱基转换读取，计算准备了两种类型的读取，其中所有 C 转换为 T 或所有 G 转换为 A，以及两种类型的参考基因组序列，其中所有 C 转换为 T 或所有 G 转换为 A。在将读数与参考基因组对齐后，可以确定是否每次读取源自原始链或互补链，通过参考 reads 的原始序列和参考基因组，选择每个 read 的最佳比对组合和最佳比对组合，并检测每个C的甲基化状态。数据分析的流程图如图 4 所示。为了正确执行操作，所有信息，包括生物信息学脚本和解释，都可以在以下链接的 GitHub 存储库中获得： https : //github.com/yos-sk /纳米EM。本协议中使用的软件可以通过miniconda ( https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html ) 或 anaconda ( https://www.anaconda.com/products/individual ) 的conda命令轻松安装）。

图 4. 数据分析流程图。

1. 转换参考基因组的碱基
从参考基因组（例如人类基因组 hg38）的 fasta 文件 (ref.fa) 生成修改后的参考基因组的fasta文件( output.fa ) ，表示参考基因组，其中 Cs 转换为 Ts，并且Gs 在反向链上转换为 As。

$ python src/convert_ref.py ref.fa > output.fa

2. 转换 nanoEM数据的基础
nanoEM读取的压缩fastq文件(1d_pass.fq.gz)中，生成两个修改后的fastq文件：一个将 Cs 转换为 Ts (1d_pass_CT.fq.gz)，另一个将 Gs 转换为As (1d_pass_GA.fq.gz ）。

$ python src/convert_reads.py 1d_pass.fq.gz

3. nanoEM读数（1d_pass_CT.fq.gz 和 1d_pass_GA.fq.gz）映射到转换后的参考基因组（ output.fa ）。使用带有“ mapont ”选项的 minimap2 将处理后的 nanoEM 读数映射到处理后的参考基因组。然后，生成两个 bam 文件（1.sorted.bam 和 2.sorted.bam）和两个各自的索引文件（1.sorted.bam.bai 和 2.sorted.bam.bai）。

$ minimap2 -t 8 –split-prefix temp_sam1 -ax map- ont output.fa 1d_pass_CT.fq.gz – eqx | samtools视图-b | samtools排序 -@ 8 -o 1.sorted.bam
$ samtools索引 1.sorted.bam
$ minimap2 -t 8 –split-prefix temp_sam2 -ax map- ont output.fa 1d_pass_GA.fq.gz – eqx | samtools视图-b | samtools排序 -@ 8 -o 2.sorted.bam
$ samtools索引 2.sorted.bam

4. C选择最佳对齐方式
从对齐结果（1.sorted.bam 和 2.sorted.bam）中，根据对齐分数选择最合适的对齐组合。然后，生成两个 bam 文件（ output_CT.sorted.bam和output_GA.sorted.bam ）和两个对应的索引文件（ output_CT.sorted.bam.bai和output_GA.sorted.bam.bai ）。

$ python src/best_align.py --bam1 1.sorted.bam --bam2 2.sorted.bam -- fastq nanoEM_read.fq.gz
$ samtools视图-b output_CT.sam | samtools排序 -o output_CT.sorted.bam
$ samtools视图-b output_GA.sam | samtools排序 -o output_GA.sorted.bam
$ rm输出_*。山姆
$ samtools索引output_CT.sorted.bam
$ samtools索引output_GA.sorted.bam

5. 调用甲基化
使用桑巴舞 mpileup命令，检测参考基因组（ ref.fa ） CpG 位点胞嘧啶的甲基化频率。通过 python 脚本 ( src /call_methylation.py)处理后，生成甲基化频率 ( frequency_methylation.tsv )的tsv文件。

$桑巴巴堆积 output_CT.sorted.bam -L cpg_sites.bed -o pileup_CT.tsv -t 8 -- samtools -f ref.fa
$桑巴巴堆积 output_GA.sorted.bam -L cpg_sites.bed -o pileup_GA.tsv -t 8 -- samtools -f ref.fa
$ python src/call_methylation.py pileup_CT.tsv 堆积_GA.tsv >频率_甲基化.tsv

6. IGV的亚硫酸氢盐模式下可视化
为了在 IGV 的亚硫酸氢盐模式下可视化，将 G 到 A 转换的读取序列 ( output_GA.sorted.bam ) 更正为互补链的序列，并将其 ( output_GA_vis.sorted.bam ) 与 C 的 bam 文件合并-to-T-converted 读取 ( output_CT.sorted.bam )。排序后，合并后的 bam 文件（ output_merge.sorted.bam ）可以在 IGV 的亚硫酸氢盐模式下可视化。可以从右键单击弹出菜单中激活亚硫酸氢盐模式选项。选择“颜色对齐方式” ，“亚硫酸氢盐模式”，然后选择“CG”。典型 nanoEM 结果的可视化如图 5 所示。

$ python 脚本/vis_GA_utilities.py -b output_GA.sorted.bam | samtools视图-b | samtools排序 -@ 4 -o output_GA_vis.sorted.bam
$ samtools index output_GA_vis.sorted.bam
$ samtools合并output_merge.bam output_CT.sorted.bam output_GA_vis.sorted.bam
$ samtools排序 -@ 4 -o output_merge.sorted.bam output_merge.bam
$ samtools索引output_merge.sorted.bam

图 5. nanoEM 读数的可视化。
在基因 PGR 的启动子周围的区域中，代表性 nanoEM 的可视化导致 IGV 的亚硫酸氢盐模式。甲基化和未甲基化的 CpG 分别以红色和蓝色显示。 CpG 岛的注释是从 UCSC 表格浏览器（ Karolchik 等人， 2004）。

笔记

1. 我们已经成功地将这个协议用于哺乳动物细胞系和人类肺和乳腺的临床标本。
2. 2100 Bioanalyzer Instrument的附件 Chip Priming Station 将预过滤的 Gel-Dye 混合物填充到 DNA 芯片后，在芯片孔中加入 9 µL Gel-Dye mix 和 5 µL Marker制造商的说明。分别将 1 μL 的梯子和1 μL 的样品添加到梯子井和样品井中。涡旋1分钟后，将芯片设置为2100 Bioanalyzer Instrument并开始测量。
3. 在此步骤中，请勿使用EMseq试剂盒中的洗脱缓冲液，因为它不利于后续的 PCR 反应。
4. 我们建议使用至少 200 ng DNA 用于随后的纳米孔测序文库制备。
5. 当库加载量过高或过低时，测序数据的产量都会降低。

食谱

1. TET2 反应缓冲液（含补充剂）
将 100 μL TET2 Reaction Buffer 添加到一管 TET2 Reaction Buffer Supplement 中，并通过涡旋混合。含添加剂的 TET2 反应缓冲液可在 -20°C 下保存 4 个月。
2. 70% 和 80% (v/v) 乙醇
混合乙醇和 NFW。这些试剂是在使用时新鲜制备的。
3. ProNex大小选择性 DNA 纯化系统 (NG2001)的洗涤缓冲液
在一瓶洗涤缓冲液中加入 75 mL 乙醇。

致谢

该协议基于我们之前的出版物（ Sakamoto等人， 2021）。我们得到了 JSPS KAKENHI [JP21K15074, JP19K16108] 的支持； MEXT KAKENHI [JP16H06279 (PAGS), JP17H06306, JP20H05906]; JSPS 藤田医学研究纪念基金；国家癌症中心研究与发展基金 (29-A-6)。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

参考

1. Akbari, V., Garant , JM, O'Neill, K., Pandoh , P., Moore, R., Marra , MA, Hirst, M. 和 Jones, SJM (2021)。使用纳米孔长读数和 NanoMethPhase 进行兆碱基规模的甲基化定相。基因组生物学22（1）：68。
2. Goerner-Potvin, P. 和 Bourque, G. (2018)。用于揭示可转座元素的计算工具。 Nat Rev Genet 19（11）：688-704。
3. Greenberg, MVC 和Bourc'his , D. (2019)。 DNA甲基化在哺乳动物发育和疾病中的不同作用。 Nat Rev Mol 细胞生物学20（10）：590-607。
4. Karolchik , D., Hinrichs, AS, Furey , TS, Roskin , KM, Sugnet , CW, Haussler, D. 和 Kent, WJ (2004)。 UCSC 表浏览器数据检索工具。 Nucleic Acids Res 32（数据库问题）：D493-496。
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