材料和试剂

1.500 mL 真空过滤器，0.22 μm PES（TPP，目录号：99500）
2.非无菌，96圆底孔聚苯乙烯板（ ThermoFisher Scientific，目录号：268152）
3.超压缩 eBeads TM补偿珠（ ThermoFisher Scientific，目录号：01-2222-42）
4.组织培养板
a.100 mm组织培养板（Corning，目录号：430167）
b.150 mm组织培养板（Corning，目录号：430599）
c.15 mL离心管（ Sarstedt ，目录号：62.547.205）
d.50 mL离心管（ Sarstedt ，目录号：62.547.205）
5.2 mL 无菌血清移液器
6.无菌 40 µm 细胞过滤器（Corning，目录号：431750）
7.无菌 50 mL 试剂容器（Corning，目录号：4870）
8.10 mL试剂容器（ Vistalab Technologies，目录号：30541012）
9.带盖的无菌96孔半区细胞培养板（VWR，目录号：392-0060）
10.非无菌 U/V 底 96 孔板
11.聚丙烯圆底 FACS 管（Falcon，目录号：352063）
12.7-氨基放线菌素D（Merck，目录号：A9400-5MG）
13.DMSO中的阿糖胞苷10 mM（ Selleckchem ，目录号：U-19920A）
14.二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
15.台盼蓝（Sigma，目录号：T8154）
16.HyClone磷酸盐缓冲盐水（PBS）（GE Healthcare，目录号：SH30256.01）
17.OP9-M2 基质细胞系 (Magnusson et al ., 2013) 或从供应商 (ATCC) 检索的 OP9
18.来自人血清的IgG（Merck，目录号：I4506）
19.不含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基（GE Healthcare，目录号：SH30096.01）
20.EDTA（0.5 M），pH 8.0，无 RNase（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9260G）
21.胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红（ ThermoFisher Scientific，目录号：25200-056）
22.HyClone牛小牛血清（BCS），美国产，500 mL（GE Healthcare，目录号：SH30073.03）
23.Iscove's MDM（BSA）中的 10% 牛血清白蛋白（Stem Cell Technologies，目录号：09300）
24.，经过测试（ ThermoFisher ，目录号：A4766801）
25.HyClone青霉素/链霉素/谷氨酰胺溶液（ Cytiva ，目录号：SV30082.01）
26.不含 L-谷氨酰胺、核糖和脱氧核糖核苷的Hyclone MEM/Alpha 修饰（GE Healthcare，目录号：SH30568.FS）
27.重组人干细胞因子（SCF）20 ng/ μL （ Peprotech ，目录号：300-07）
28.重组人血小板生成素（TPO）20 ng/ μL （ Peprotech ，目录号：300-18）
29.重组人 Flt3-配体（FL）20 ng/ μL （ Peprotech ，目录号：300-19）
30.重组人白细胞介素3（IL3）20 ng/ μL （ Peprotech ，目录号：200-03）
31.重组人白细胞介素6（IL6）20 ng/ μL （ Peprotech ，目录号：200-06）
32.APC/Cyanine7抗人CD34抗体（ Biolegend ，目录号： 343514 ）
33.APC抗人CD38抗体（ Biolegend ，目录号： 303510 ）
34.PE/Cyanine7抗人GPR56抗体（ Biolegend ，目录号： 358206 ）
35.PE抗人CD123抗体（ Biolegend ，目录号：306006）
36.Brilliant Violet 421 TM抗人CD11b抗体（ Biolegend ，目录号：301324）
37.Brilliant Violet 605 TM抗人CD15（SSEA-1）抗体（ Biolegend ，目录号：323032）
38.FITC抗人CD14抗体（ Biolegend ，目录号：367116）
39.APC抗人CD64抗体（ Biolegend ，目录号：305014）
40.APC / Cyanine7抗人HLA-DR抗体（ Biolegend ，目录号：307618）
41.来自鼠骨髓瘤的IgG1，Kappa（Merck，目录号：M7894）
42.PE/Cyanine7抗人CD117（c-kit）抗体（ Biolegend ，目录号：313212）
43.洗涤液（见配方）
44.冷冻培养基（见食谱）
45.解冻培养基（见食谱）
46.OP9-M2 培养基（见配方）
47.LSC 培养基（见食谱）
48.LSC 染色溶液（见配方）
49.7-AAD 解决方案（见配方）

设备

1.血细胞计数器细胞计数室（ Marienfeld Superior，目录号：13444890）
2.冷冻离心机（ Sigma，目录号：4-16KS）
3.FACSCanto II 流式细胞仪（8 色，蓝色/红色/紫色）（BD Biosciences）配备 HTS 单元
4.Heracell 150i CO 2培养箱（Thermo Scientific）
5.细胞辐照器（Precision X-Ray，目录号： CellRad ）
6.多通道步进移液器 - 如果可能，数字化（1 mL 和 200 μL ）
7.轨道振动器（IKA，目录号：KS130）
8.带盖储物盒（VWR，目录号：SEMA0882）

软件

1.FlowJo ( https://www.flowjo.com )
2.Excel ( https://www.microsoft.com )
3.GraphPad PRISM 7 ( https://www.graphpad.com )

程序

A.AML表型

1.恢复活的 AML 细胞
a.从储存中取出一瓶白血病原代细胞，并将其放在干冰或液氮中。
b.用 70% 乙醇小心地擦拭仍然冷冻的小瓶。
c.在 LAF 工作台上，使用 1 mL 无菌尖端将样品的冷冻位直接废弃到 FACS 管中，之前填充有 4 mL 的解冻介质并保持在冰上。
d.在 250 × g和 4 °C下旋转5 分钟，并通过缓慢倾斜管并让液体在管壁上流入吸液管来小心地吸出上清液。
e.在离心过程中，将小瓶转移回储存处。
f.加入 2 mL 洗涤缓冲液，并以 350 × g的速度重复离心步骤。
2.染色细胞
a.添加 50 μL的 LSC 染色溶液。
b.在 4 °C的黑暗中孵育30 分钟。
c.添加 1 mL 的洗涤缓冲液。
d.在 350 × g和 4 °C下旋转5 分钟。
e.在染色期间，用珠子准备补偿控制。
f.FACS 和分析。

B.基质解冻

1.在冰上，在 50 mL 管中冷却 20 mL 的 OP9-M2 介质。
2.在干冰上收集和运输一小瓶冷冻的 OP9-M2（或 OP9）。用 70% 乙醇小心地擦拭仍然冷冻的小瓶。
3.在 LAF 工作台上，在冷冻细胞上吸管约 0.5 mL 的冰冷 OP9-M2 培养基。立即收集细胞并将其移回保存在冰上的解冻溶液管中。
4.重复直到细胞沉淀完全解冻。
5.在 300 × g和 4 °C 下旋转5 分钟。
6.吸出上清液。
7.重悬细胞颗粒，首先使用 1 mL 的 OP9-M2 培养基，然后重悬至 5–10 mL。
8.对于细胞计数，在预先填充 50 μL台盼蓝的 Eppendorf 管中收集 50 μL 。
9.在 350 × g和 4 °C 下旋转5 分钟。
10.在旋转过程中计数细胞。
11.首先用 1 mL 的冰冷 OP2-M2 培养基重新悬浮细胞颗粒。
12.为了播种 10 cm 2盘子，在 15 mL 管中收集约 850,000 个细胞。添加多达 10 mL 的 OP2-M2 培养基。
13.充分混合，播种并转移到培养箱中过夜。
14.第二天检查是否存活。如果细胞超过 50% 汇合，则重新电镀（参见 C 部分）。

C.基质维护

1.通过轻轻地将盘子倾斜到一侧来吸出上清液。避免接触细胞，但尽可能远离盘子的边缘。
2.°C预热时轻轻加入 10 mL 的 PBS，洗去任何 FCS 痕迹。
3.如步骤 C1 中所述吸出。
4.添加 1 mL 的胰蛋白酶 EDTA。转移到孵化器。
5.4-5 分钟后，在显微镜下检查细胞是否变圆。
6.轻轻敲击培养皿的侧面以帮助分离细胞。
7.所有细胞分离后，立即使用 1 mL 移液器快速分解细胞簇。
8.添加 1 mL 的 FCS，并转移到 50 mL 管中。使用 PBS 完成高达 10 mL 的体积。
9.对于细胞计数，在预先填充 50 μL台盼蓝的 Eppendorf 管中收集 50 μL 。
10.在 350 × g和 4 °C 下旋转5 分钟。
11.在旋转过程中计数细胞。
12.为了播种 10 cm 2盘子，在 15 mL 管中收集约 500,000 个细胞。添加多达 10 mL 的 OP2-M2 培养基。
13.充分混合、播种并转移到培养箱中。

D.基质电镀

1.按照步骤 C1–C11 中的说明制备单细胞悬液。
2.吸出上清液。
3.用 1 mL 的冰冷 OP9-M2 介质将颗粒重新悬浮到单细胞悬浮液中，用冰冷的 OP9-M2 介质填充至 2.5 mL，然后转移到 15 mL 管中。
4.保持在冰上并用 2000 rad 辐照。
5.将 OP9-M2 培养基添加到总共10 mL，并通过 40 μm细胞过滤器将重新悬浮的细胞过滤到 50 mL 管中。
6.对于细胞计数，在预先填充 50 μL台盼蓝的 Eppendorf 管中收集 50 μL 。
7.在 350 × g和 4 °C 下旋转5 分钟。吸出上清液。
8.用 1 mL 的冰冷 OP9-M2 介质将颗粒重新悬浮到单细胞悬浮液中。
9.为实验收集适当的细胞数，并用 OP9-M2 培养基调整体积至细胞浓度为 5 × 10 5 个细胞/ mL。
10.将细胞悬浮液转移到无菌水库中，并使用数字多通道步进器，在 96 个半面积孔板中分配 50 μ L /孔。
11.在 37 °C 下孵育4–16 小时。

E.AML电镀

1.解冻细胞，如步骤 B1 - B6 中所述。
2.重悬细胞颗粒，然后填充至 5–10 mL。
3.对于细胞计数，在 Eppendorf 管中收集 50 μL，预填充 50 μL台盼蓝。
4.在 350 × g和 4 °C 下旋转5 分钟。吸出上清液。
5.首先用 1 mL 的冰冷 3 × LIC 培养基将细胞沉淀重悬到单细胞悬浮液中。将体积调整到所需的细胞浓度（0.04 × 10 6 –2 × 10 6细胞/mL）。
6.将细胞悬浮液转移到无菌水库中，并使用数字步进器，在 96 个半面积孔板中小心地分配 25 μ L /孔。
7.培养箱内的潮湿室（通过放置一个装有 PBS 的 10 厘米开口培养皿），并在添加化合物前在 37 °C 下生长36-48 小时，以避免培养冲击（ Magnusson等人， 2013 年）。

F.复合添加

1.在 LSC 培养基中制备文库的连续稀释液，使每种化合物为 4 ×测定浓度。
2.使用多道移液器，分配 25 μ L /孔。
3.将盘子放回潮湿的室内，并将它们放在 37 °C的培养箱中 4 天。

图 1. 基质共培养改变离体健康和恶性造血细胞的行为。
OP9-M2 细胞在 A) 最佳汇合处（左）和一周后（右）拍照。 B) 用 OP9-M2 或 BFC012 细胞和/或上清液 (SN) 培养 10 天的 CD34 +脐带血细胞的造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 标志物的代表性变化。用 t 检验计算统计学显着性。 *P < 0.05，**P < 0.001。 C）造血细胞（箭头）在辐照的 OP9-M2 细胞存在下培养 6 天。 D) 图表显示在存在或不存在经辐照的 OP9-M2 细胞的情况下用阿糖胞苷治疗 4 天后，原发性儿科 AML 细胞的归一化细胞数的非线性拟合回归。通过 FACS 获得体积细胞计数，并使用 Prism 软件计算阿糖胞苷的IC 50 。比例尺：100 μ m 。

G.流式细胞仪

1.准备染色和控制混合物
分析前一天，目视检查对照板上的活细胞，并根据表 1 和表 2 制备染色和对照混合物。
2.样品采集
a.在分析当天，通过使用多通道移液器上下移液收集整个井内容物，到 96 V 形板。仔细标记盖子和收集板。
b.使用多通道步进器，向每个孔中添加 100 μL的冰冷洗涤缓冲液。
c.旋转 350 × g和 4 °C 5 分钟。
d.清空盘子，将盘子放回一次，放在放在生物垃圾箱中的吸水纸上，动作迅速而坚定。
3.样品染色
a.将染色混合物转移到试剂容器中。
b.使用多通道步进器，从 10 mL 试剂库中添加 25 μ L /孔的 LSC 染色溶液。在试管或单独的盘子中准备单一染色和 FMO 控制。
c.在摇床上轻轻摇动板，直到颗粒重新悬浮并在黑暗中在 4 °C下孵育30 分钟。
d.使用多通道步进器，向每个孔中添加 125 μL的冰冷洗涤缓冲液。
e.在 350 × g和 4 °C 下旋转5 分钟。
f.清空盘子，将盘子放回一次，放在放在生物垃圾箱中的吸水纸上，动作迅速而坚定。
g.使用多通道步进器，将 150 μL的冰冷 7AAD 溶液从水库中添加到每个井中。
h.盘子放在冰/4 °C上，直到 FACS。
4.流式细胞仪
设置 HTS 单位时，在非常高的事件 (1,000,000) 上设置停止门以获取相同的体积（连接到 BD 分析仪的 HTS 为 100 μL ），因此在分析时提取体积计数。

数据分析

从FlowJo中，从活细胞门输出细胞计数、白血病干细胞群的百分比（即，CD34 + GPR56 +来自 CD34 + AML），以及分析中包含的不同骨髓标志物的百分比（即， CD11b、CD14、CD15)。此外，从骨髓标记中提取平均荧光强度，因为这些标记通常在诊断时在细胞上表达，但可以在表达中增加作为分化的标志。
接下来，从控制孔中提取数据以突出实验中的变化，尤其是体积细胞计数，这在我们手中是最敏感的参数。电镀的重现性会受到样品细胞异质性、细胞数量和电镀细胞的生长潜力以及个人技能的影响。我们发现，虽然与整个实验相比，每个板中控制的平均值可能会有很大差异，但板内控制井之间的情况并非如此（图 2）。

因此，在 Excel 中，对于每个板块，计算：
•增殖指数（PI = 细胞数孔/平均细胞数对照 × 100),
•白血病干细胞指数（SI = LSC百分比/平均 LSC百分比对照 × 100),
•成熟指数（MI = 骨髓标记孔/骨髓标记对照 × 100)。

图 2. 板间变异性影响体积细胞计数，但不影响细胞表面标记量化。
将每个板（编号为 1 至 6）的对照孔的平均值与所有 6 个板的平均值（exp.）进行比较，用于 A) 体积细胞计数和 B) 3 个不同来源的原代造血细胞的表面标志物表达.用非配对 t 检验计算统计显着性。 *P < 0.05，**P < 0.01。

要识别候选分子，请在 Excel 中对每个相关参数的数据进行排序。显着性阈值主要取决于对照孔的异质性，但我们发现，在这个阶段，假阳性（超过假阴性）是可以接受的，因为它们将在验证步骤（剂量反应实验）中被消除。命中的识别还取决于您的研究目的。例如，我们的实验室主要专注于发现诱导分化的化合物，而不是严重影响细胞数量的分子（PI < 25）。在此过程中，我们消除了细胞计数太低而无法进行可靠 FACS 分析的孔，或含有自发荧光、垂死细胞和非特异性事件的孔。出于说明目的，在Graphpad棱镜中，绘制 PI 与 MI/SI（图 3A）。最后，我们建议专门查看每个候选分子的FlowJo图，以检查门控是否合适（图 3B）以及潜在的自发荧光（图 3C）。

图 3. 多参数分析可以识别影响 AML 生物学的多种化合物。
A) 每个点图显示来自细胞毒物库的大约 180 种化合物（在三个指定浓度下）对原发性儿科 AML 样本的成熟度和白血病干指数的影响。 B) FACS 图显示了 A 中突出显示的候选药物对干细胞（CD34 和 GRP56）和骨髓（CD11b 和 CD15）群体的表面标志物表达谱的影响，说明了干细胞/成熟的减少/增加A.C) 中显示的指数 FACS 图说明了两种化合物处理后 CD15 表达水平的荧光总变化，表明它们在 BV421 通道中的潜在自发荧光（在文献中得到证实）。

笔记

此处描述的抗原面板为大多数 AML 样本提供了全面的表型，但可以根据 FACS 分析仪的能力和诊断时的表型来增加/减少。例如，30% 的 AML 是 CD34 - ，这也意味着 GPR56 可能与干细胞标志物无关，而正在经历（骨髓）分化的细胞预计会获得以前无法检测到的标志物，例如 CD14 或 CD64。 AML 表型因样本而异，冷冻存活率也是如此。例如，死细胞排除试剂盒或淋巴制备上的大小排除是去除多余死细胞的替代方法。总体而言，极低的假阳性计数（在独立的滴定实验中无法重现该效应）表明，尽管 AML 存在细胞异质性，但我们的策略提供了一种可靠的分析方法来识别影响原发性 AML 细胞生物学的化合物。

食谱

1.洗涤液
PBS 补充有 2% 热灭活 FCS 和 2 mM EDTA。

2.解冻介质
RPMI 补充了 20% 热灭活的 FCS。

3.OP9 -M2 培养基
MEM 补充了 20% 测试的 FCS 和 1% PSG。

4.LIC 培养基
OP9-M2 培养基添加了 50 ng/mL SCF 和 25 ng/mL 的 IL3、TPO、FLT3 和 IL6。 “3 × LIC培养基”是指细胞因子浓度应为最终浓度的3倍，其他成分不变。

5.LSC 染色溶液–见表 1 和表 2

表 1. CD34 + AML 样品的 LSC 染色溶液

抗原共轭稀释每更好每 ss / fmo *公司目录＃
CD34AC71：1000.55生物传奇343514
CD38不良资产1：1000.55生物传奇303510
GPR56PC71：2000.252,5生物基因358206
CD123体育1：1000.55生物传奇306006
CD11bBV4211：1000.55生物传奇301324
CD15BV6051:50110生物传奇323032
CD14FITC1：1000.55生物传奇367116
CD64FITC1：1000.55生物传奇305014
IgG不适用1:1000.50.5默克M7894
洗涤液不适用不适用20.25高达 25 μ L不适用不适用

表 2. CD34 + AML 样品的 LSC 染色溶液

抗原共轭稀释每口井每 ss/ fmo *公司目录＃
HLA-DRAC71:1000.55生物传奇307618
CD38不良资产1：1000.55生物传奇303510
CD117PC71：2000.252,5生物基因313212
CD123体育1：1000.55生物传奇306006
CD11bBV4211：1000.55生物传奇301324
CD15BV6051:50110生物传奇323032
CD14FITC1：1000.55生物传奇367116
CD64FITC1：1000.55生物传奇305014
IgG不1：1000.50.5默克M7894
洗涤液不不20.25高达 25 μ L不适用不适用
*在洗涤缓冲液中以 1:10 稀释抗体

6.7-AAD 解决方案
有 10 μg /mL 7- AAD的洗涤溶液。

致谢

这项工作得到了瑞典癌症基金会、瑞典儿童癌症基金会、瑞典研究委员会、瑞典医学研究协会、克拉福德基金会和坎普拉德基金会的支持。上述协议源自Baudet等人。 ( 2016) 和Hultmark等人。（2021 年）。

利益争夺

作者没有要披露的财务和/或非财务竞争利益。

伦理

瑞典隆德伦理委员会批准的伦理许可dnr 826/2004 ，在样本采集前获得所有患者的知情同意。

参考

Baudet, A.、Ek, F.、Davidsson, J.、Soneji, S.、Olsson, R.、Magnusson, M.、Cammenga, J. 和 Juliusson, G. (2016)。小分子筛选可识别针对遗传多样性急性髓细胞白血病的分化促进化合物。 Br J Haematol 175（2）：342-346。
Calvanese, V., Nguyen, AT, Bolan, TJ, Vavilina, A., Su, T., Lee, LK, Wang, Y., Lay, FD, Magnusson, M., Crooks, GM等。（2019）。 MLLT3 控制人类造血干细胞的自我更新和植入。自然576（7786）：281-286。
Cancer Genome Atlas Research, N., Ley, TJ, Miller, C., Ding, L., Raphael, BJ, Mungall, AJ, Robertson, A., Hoadley, K., Triche, TJ, Jr., Laird, PW等。 _ （2013）。成人新发急性髓细胞白血病的基因组和表观基因组景观。 N Engl J Med 368（22）：2059-2074。
Estey, E.、Levine, RL 和 Löwenberg, B. (2015)。 “靶向治疗”临床开发的当前挑战：急性髓性白血病病例。血125（16）：2461-2466。
Hultmark, S., Baudet, A., Schmiderer, L., Prabhala, P., Palma-Tortosa, S., Sanden, C., Fioretos, T., Sasidharan, R., Larsson, C., Lehmann, S. .，等人。（2021 年）。组合分子筛选确定了一种新型二萜和 BET 抑制剂 CPI-203 作为原发性急性髓细胞白血病细胞的分化诱导剂。血液学106（10）：2566-2577。
Kalmanti, L.、Saussele, S.、Lauseker, M.、Muller, MC、Dietz, CT、Heinrich, L.、Hanfstein, B.、Proetel, U.、Fabarius, A.、Krause, SW等。（2015 年）。伊马替尼治疗 CML 10 年的安全性和有效性：来自随机 CML 研究 IV 的数据。白血病29（5）：1123-1132。
Kasi, PM, Litzow, MR, Patnaik, MM, Hashmi, SK 和 Gangat, N. (2016)。 AML 在新型 FMS 样酪氨酸激酶 3 (FLT3) 抑制剂治疗中的克隆进化以及不断进化的可操作靶点。 Leuk Res 代表5：7-10。
Komorowska, K., Doyle, A., Wahlestedt, M., Subramaniam, A., Debnath, S., Chen, J., Soneji, S., Van Handel, B., Mikkola, HKA, Miharada, K.,等人。（2017）。肝白血病因子维持造血干细胞的静止并在再生过程中保护干细胞池。细胞代表21(12)：3514-3523。
Lim, SH, Dubielecka, PM 和 Raghunathan, VM (2017)。急性髓系白血病的分子靶向。医学翻译杂志15（1）：183。
Magnusson, M., Sierra, MI, Sasidharan, R., Prashad, SL, Romero, M., Saarikoski, P., Van Handel, B., Huang, A., Li, X. 和 Mikkola, HK (2013) .尽管重建能力受损，但基质细胞的扩增保留了人类造血干细胞的未分化状态。公共科学图书馆一号8（1）：e53912。
Meads, MB, Hazlehurst, LA 和 Dalton, WS (2008)。骨髓微环境作为肿瘤保护区和耐药性的贡献者。临床癌症研究14（9）：2519-2526。
Pabst, C.、Krosl, J.、Fares, I.、Boucher, G.、Ruel, R.、Marinier, A.、Lemieux, S.、Hébert, J. 和 Sauvageau, G.（2014 年）。离体支持人类白血病干细胞活性的小分子的鉴定。纳特方法11（4）：436-442。
Prashad, SL, Calvanese, V., Yao, CY, Kaiser, J., Wang, Y., Sasidharan, R., Crooks, G., Magnusson, M. 和 Mikkola, HK (2015)。 GPI-80 定义了人类发育过程中造血干细胞的自我更新能力。细胞干细胞16（1）：80-87。
Reya, T., Morrison, SJ, Clarke, MF 和 Weissman, IL (2001)。干细胞、癌症和癌症干细胞。自然 414 (6859): 105-111。
Saultz，JN 和 R. Garzon。（2016 年）。急性髓性白血病：简明综述。临床医学杂志 5 （3）：33。