材料和试剂
1.Falcon TM圆底聚苯乙烯试管（ Falcon TM ，目录号： 352054）
2.Falcon 50 mL锥形离心管（Corning，目录号： 352070）
3.Falcon 15 mL锥形离心管（ Falcon TM ，目录号： 352097）
4.植物血凝素（PHA）（Sigma-Aldrich，目录号： L8902-5MG）
5.Benzonase ® （Sigma-Aldrich，目录号： Nuclease E1014）
6.CD4 + T 细胞分离试剂盒（MACS， Miltenyi-Biotec ，目录号： 130-096-533）
7.HIV-1 JR-CSF 传染性分子克隆 ( pYK -JRCSF) NIH 试剂程序
8.IL-2（Prometheus Proleukin ， Aldesleukin ，目录号： 407682M）
9.IL-7（ PeproTech ，目录号： 200-07-10UG）
10.聚凝胺（Santa Cruz Biotechnology，目录号： NC9840454）
11.RPMI（康宁® ，目录号： 10-040-CV）
12.FBS（VWR Life Science，目录号： 97068-091）
13.L-谷氨酰胺（ Corning TM ，目录号： 25005CI）
14.丙酮酸钠（ Corning TM ，目录号： 25-000-CIR）
15.青霉素-链霉素（ Gibco TM ，目录号： 15070063）
16.HEPES（ Corning TM ，目录号： 25-060-CI）
17.PBS（ Corning TM ，目录号： 21-030-CM）
18.BSA（Sigma，目录号： A8412）
19.EDTA（ Corning TM ，目录号： 46-034-CI）
20.溶血卵磷脂（Sigma，目录号： L4129-25MG）
21.多聚甲醛（PFA）（Santa Cruz Biotechnology，目录号： sc-281692）
22.甲醇（Sigma，目录号： 34860-1L-R）
23.Nonidet P-40（ Biotang Inc，目录号： BTBB914）
24.Zombie NIR Fixable Viability Kit（ Biolegend ，目录号： 423106）
25.p24-FITCKC57-FITC（目录号： 6604665，Beckman）
26.CD3-BV421（BD Biosciences，目录号： BDB562426）
27.CD4-AF488（ Biolegend ，目录号： 317434）
28.CD8-BV510（ Biolegend ，目录号： 344732）
29.抗小鼠Ig，κ 补偿珠（BD TM ，目录号： 552843）
30.PBMC：从接受抗逆转录病毒治疗 (HIVART) 的 PLWH 和血清阴性个体（健康供体 (HD)）中分离出来
31.R-10+（见食谱）
32.R-20+（见食谱）
33.细胞分离缓冲液（见配方）
34.50% 甲醇/PBS（见配方）
35.0.1% NP-40/PBS（见配方）

设备
1.离心机（Thermo Scientific，ST40R TX-1000，目录号：50144036）
2.Muse 细胞分析仪（EMD Millipore Corporation，目录号：0500-3115 ）
3.培养箱（Thermo Scientific，目录编号：190408340396 ）
4.MACS 磁铁（ Miltenyi Biotech， OctoMACS分离器，目录号：130-042-108）
5.流式细胞仪（BD LSRFortessa ）
6.FINNPIPETTE F1 GLP（Thermo Scientific，目录编号：4700850N）

软件
1.Excel（微软）
2.Flow Jo ( Flow Jo, LLC / FlowJo_v10.8.0 ， https: //www.flowjo.com/ ）

程序
第 0 天：为 CD4 + T 细胞目标解冻 PBMC
1.在 R-10+ 中配制 25 个单位/mL Benzonase，并在 37 °C培养箱中加热此溶液。每瓶 (1 mL) 冷冻 PBMC 准备约 10 mL，以洗掉 DMSO。
2.°C水浴中快速解冻 PBMC ，然后将细胞内容物转移到用苯甲酸酶(25 单位/mL) 预热的 R10+ 中（1 瓶装入 10 mL），用 R-10+ 洗涤 3 次，在500下旋转 × g和室温 (RT) 5 分钟，然后计数。在 R-20+ 中以 2 × 10 6 个细胞/mL 重新悬浮，并置于 37 °C加湿 CO 2培养箱中过夜。第 0 天的程序参见图 1 ，PBMC 要求参见表 1 。

图 1. 第 0 天的程序

表 1 。 PBMC 对VIA的估计

VIA PBMC 要求b1 个时间点4个时间点c
目标10 73 – 4 × 10 7
效应器 (2:1)10 710 7 /时间点

a基于 JRCSF 感染范围 1-10% 和 PBMC 存活率 >85% 的估计，每次重复使用 0.1 × 10 6 CD4 + T细胞，总共 4-6 个重复。
b假设6 个 CD4-HIV 和 6 个 CD4-HIV:CD8 共培养物和 1 个未感染的对照。
c一组仅 CD4-HIV 和 1 个未感染的 CD4 对照将用于计算多个时间点的抑制百分比。

第 1 天：分离 CD4 + T 细胞靶标
1.按照制造商的说明，使用 MACS 珠从解冻的 PBMC 中负隔离 CD4 + T 细胞。典型的分离提供 >96% CD4 + T 细胞纯度。
2.含有 IL-2 (20 IU/mL)、IL-7 (5 ng/mL) 和 5 μ g /mL PHA (PLWH ± ART )的 R-10+ 培养基中以 2 × 10 6 /mL计数和悬浮细胞) 或 3 μ g /mL（HIV 血清阴性供体）。第 1 天的程序参见图 2 。
3.将列出的细胞板，并在 37 °C培养箱中培养 72 ± 3 小时， CO 2为 5% ：
6 孔板中5 × 10 6 个细胞/孔（2.5 – 3.0 mL/孔）
3 × 10 6 个细胞/孔在 12 孔板中（在 1.5 – 2.0 mL/孔中）
<1.5 × 10 6 个细胞/孔，在 24 或 48 孔板中（在 1.0 – 1.5 mL/孔中）

图 2.第 1 天的程序

第 3 天：为 CD8 + T 细胞效应器解冻 PBMC
1.在 R-10+ 中制作 25 单位/mL Benzonase，并在 37 °C培养箱中加热。
2.°C水浴中快速融化 PBMC ，然后将细胞内容物转移到用苯佐纳酶(25 单位/mL) 预热的 R-10+ 中，用 R-10 + 在500下旋转洗涤 3 次 × g和 RT 5 分钟，然后计数。在 R-20+中以 2 × 10 6 /mL 重悬并置于 37 °C 、加湿的 CO 2培养箱中过夜。参见表1了解 PBMC 需求。

第 4 天：目标 CD4 + T 细胞的 HIV 感染
1.72 ± 3 小时后，使用无菌一次性移液器从孔中收获丝裂原活化的 CD4 +靶标，并用 >10 mL 的 R-10+ 洗涤 3 次，以去除培养物中的 PHA。
2.在 R-10+ 中添加 IL-2 的 20 IU/mL 的 15 mL Falcon 管中计数细胞并重悬至 10 7 个细胞/ mL。

3.将 10 5 个细胞转移到流式细胞仪管中，用作未感染的对照。
4.用 HIV-1 JRCSF （最终 MOI 为 0.03）感染剩余的 CD4 + T 细胞。
a.用 20 IU/mL 的 IL-2 和 8 μg 的聚凝胺补充 R- 10 + /毫升。
b.将 Polybrene/IL-2/R-10+ 培养基中的病毒原液稀释至 2 ×最终浓度。
c.将等体积的 2 ×病毒添加到 CD4 +目标中，最终细胞浓度为 5 × 10 6 / mL。每 15 mL Falcon 管 (0.4 mL) 的细胞数不要超过 2 × 10 6个。
d.在 1,200 × g和 27 °C 下旋转2 小时，带刹车。
e.旋转接种后，用 R-10+ 洗涤 3 次以去除残留的病毒和聚凝胺。
5.通过添加以 20 IU/mL 补充 IL-2 的 R-10+，以 1 × 10 6 / mL计数和重悬细胞。

第 4 天：准备 CD8 + T 细胞效应器
1.当 CD4 + T 细胞进行旋转接种时，使用 CD8 +从休息过夜的 PBMC 中分离 CD8 + T 细胞 MACs微珠（正选择），遵循制造商的说明。
2.× 10 6 /mL计数和重悬分离的 CD8 + T 细胞， IL-2 为 20 IU/ mL。
图 3.第 4 天的程序
第 4 天：效应器：目标共培养
1.允许的细胞数，设置以下标记的流式细胞仪管：
6 管含有 10 5 CD4 +目标 (100 μ L ) + 100 μ L R-10+
6管含有 10 5 CD4 +靶标 (100 μ L ) + 2 × 10 5 (100 μ L ) CD8 + T 细胞效应器
1 管含有 10 5 个未感染的 CD4 +细胞 (100 μL ) + 100 μL R - 10+
2.将共培养物置于 37°C、加湿的 CO 2培养箱中 3 天。第 4 天的程序参见图 3 。
第 7 天：细胞内 HIV 特异性 p24 染色方案
表 2 。 p24 染色的样品/对照
管子细节复制品
活死控制°C水浴中加热杀死细胞10 分钟1
控件推荐使用 CD4 FMO，因为感染会降低 CD4 表达1
非染色对照1
测试样品未感染对照 CD4-only a1
受感染的 CD4 +目标6乙
共培养：受感染的 CD4 +靶标 + 效应器 CD8 + 6乙

a用于定义 p24 +门；在 PLWH 中，这种控制对于检查内源性病毒复制也很关键。在未经治疗的 HIV 感染中，应考虑重复。
b见主要手稿文本（Xu et al ., 2021; DOI: 10.3389/fimmu.2021.666991 ）有关重复数计算的更多详细信息。

1.在 500 × g和 RT 下旋转细胞 5 分钟。
2.用 2 mL 的 PBS 洗涤细胞，在 500 × g和 RT 下旋转细胞 5 分钟，然后在 100 μ L的 PBS 中重新悬浮细胞。
3.添加 0.2 μ L Zombie NIR TM 。用箔纸包裹管子，在 RT 下孵育 20-30 分钟。
4.在这个孵化过程中
a.将溶血卵磷脂固定剂带到 RT。
b.准备一个冰桶。
c.使离心机温度达到 4 °C 。
5.每管加入 2 mL 的 PBS，并在 500 × g和 RT 下离心 5 分钟。将多余的上清液倒在纸巾上。
6.在 4% 多聚甲醛中添加 1 mL 的 20 μ g /mL 溶血卵磷脂来固定细胞。
7.涡流。在 RT 孵育 2 分钟。
8.500 离心机 × g和 4 °C 5 分钟。倒出或吸出上清液。涡流。
9.添加 1 mL 的冷 50% 甲醇（-10 至 -20 °C ）。
10.涡流。在冰上孵育 15 分钟。
11.500 离心机 × g和 4 °C 5 分钟。倒出或吸出上清液。涡流。
12.添加 1 mL 的 0.1% NP-40（2–8 °C ）。
13.大力旋涡。在冰上孵育 5 分钟。
14.500 离心机 × g和 4 °C 5 分钟。倒出或吸出上清液。涡流。
15.配制抗体预混液。每管加入p24 (5 μ g /mL)、CD3 (2 μ g /mL)、CD4 (2 μ g /mL) 和 CD8 (2 μ g /mL) 抗体各 2 μ L。
16.将抗体mastermix添加到试管和涡旋中。在 RT 孵育 15分钟。
17.添加 2 mL 的 PBS。 500 离心机 × g和 RT 5 分钟。倒出或吸出上清液。涡流。
18.为每种荧光染料准备补偿控制。
19.在 6 小时内获取流式细胞仪。有关门控方案，请参见图 4 。

图 4. 门控方案。
感染 CD4 + T 细胞的频率定义为活的单个 CD3 + CD8 -淋巴细胞中 HIV-1 p24 +细胞的百分比，使用未感染的 CD4 +细胞培养物，在所有测定中p24 +频率 <0.1。

数据分析
VIA 的实际变化，例如流式细胞仪管中的细胞培养（上面的详细协议），提高了检测通量，这可能有利于临床测试。在我们手中，独立培养物的引入和收购大大提高了检测的信心。本手稿提供了一个 Excel 模板，以方便计算病毒抑制百分比和相应的 95% CI（VIA 复制计算器， https://github.com/glab-hiv/via ）。这些计算在流式细胞术中具有更广泛的应用，其中重复测定获得不同的细胞数。我们建议研究人员考虑使用提供的模板通过加权平均值和 95% CI 计算抑制百分比。加权平均值和 95% CI 也可用于分析标准功能性细胞内细胞因子染色 (ICS) 中的独立重复。
提供了简单的表格（表 3 和表 4），以帮助确定所需的 HIV 感染水平以及在检测 CD8 + T 细胞介导的 HIV 复制抑制时达到 90% 统计能力所必须获得的 p24 +细胞的最小数量.同样，在这些表格的模拟中产生的值在流式细胞术中具有更广泛的应用，其中低频细胞被测量以定义最小细胞数和/或复制所需的具有统计能力以检测功能响应差异（例如，频率产生细胞因子的细胞）。

表3。 90% 统计功效所需的 p24 +细胞的最小百分比。
+细胞（在 HIV-CD4 T 细胞培养物中）的最小百分比需要观察2-6 次重复的 5-30%的阈值病毒抑制。 8% 抑制的阈值是研究数据中特定 CD8 + T 细胞介导的病毒抑制的接受者操作特征 (ROC) 确定的截止值。 p24 +细胞的百分比是根据来自真实数据的参数使用模拟（500 次迭代）生成的。 HIV 感染的最低允许百分比为 0.5%。

病毒抑制(%)
重复次数581015202530
214.997.494.781.981.050.610.5
311.844.633.161.30.670.50.5
48.913.692.30.950.50.50.5
57.793.171.880.790.50.50.5
66.972.431.570.660.50.50.5

表 4。 90% 统计功效所需的最小 p24+ 细胞数。
+细胞的最小数量（20,000 个 CD4 + T 细胞的分母）需要观察 2-6 次重复的 5-30% 的阈值病毒抑制。 HIV 感染的最低允许百分比为 0.5%。

病毒抑制 (%)
重复次数581015202530
229991498957397209122100
32367926632259135100100
41783738459191100100100
51559635375159100100100
61393486314133100100100

食谱
1.R-10+（储存在 2–8 °C ，限制光照）
RPMI-1640
10% 胎牛血清
2 nM L-谷氨酰胺
1 mM 丙酮酸钠
1 ×青霉素-链霉素
10 毫米 HEPES

2.R-20+（储存在 2–8 °C ，限制光照）
RPMI-1640
20% 胎牛血清
2 nM L-谷氨酰胺
1 mM 丙酮酸钠
1 ×青霉素-链霉素
10 毫米 HEPES

3.细胞分离缓冲液（储存在 2–8 °C ）
PBS
0.5% BSA
2 毫米乙二胺四乙酸

4.20 μ g /mL 溶血卵磷脂，溶于 4% PFA # （储存于 2–8 °C ）
在 500 mL 的 4% PFA 溶液中溶解 10 mg 溶血卵磷脂。

5.50% 甲醇/PBS # （-20 °C储存）

6.0.1% NP-40/PBS*（储存于 2–8 °C ）
将 0.5 mL 的 NP-40 添加到 499.5 mL 的 PBS 中。

°C的一次性等分试样中。
#注意：上述试剂溶液的最短保质期为 6 个月，如果按照说明进行储存的话。

致谢

资金：这项工作得到了美国国家过敏和传染病研究所、U01 AI131310-01 (NG) 和北卡罗来纳大学教堂山分校艾滋病研究中心 (P30 AI050410) 的支持。
我们感谢 Robert Ferris 的技术援助，感谢 Taylor Krajewski对本手稿中提出的统计方法的深思熟虑的审查。使用Biorender创建的图形。该协议主要改编自徐等人的出版物。（2021 年； DOI： 10.3389/fimmu.2021.666991 ）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理
从接受抗逆转录病毒治疗 (HIVART) 和血清阴性个体（健康供体 (HD)）的 PLWH 中分离出外周血单个核细胞 (PBMC)。所有 HIVART 参与者都在接受稳定的护理标准 ART 并维持血浆 HIV-1 RNA < 50 拷贝/mL 和 CD4 T 细胞计数 > 300/ μL至少在入组前 6 个月。所有实验方案均经当地机构生物医学审查委员会批准（伦理编号：14-0741、11-0228、13-3613、12-1660 和10-01330），并按照相关指南执行。用于测定标准化的 HD 由 UNC CFAR HIV/STD 实验室核心（ IRB 96-0859， http ://unccfar.org/portfolio/hiv-std-laboratory-core/ ）和纽约血液中心（ https:// /nybloodcenter.org ）。

参考
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