材料和试剂
1.1.7毫升微管（Axygen，目录号：GEN-MT-175-C）
2.15毫升离心管（Axygen，目录号：GEN-CT-15毫升）
3.手套（Tarsons，目录号：370110）
4.移液管头（Axygen，目录号：T-300[10µL]、T-200-Y[200µL]、T-1000-B[1000µL]）
5.实验室围裙（Medifit
6.Zeba旋转脱盐柱，7K MWCO，5毫升（热电科学公司，目录号：89892）

7.ActiveX Desthiobiotin FP丝氨酸水解酶（Thermo Scientific，目录号：88317）
8.高容量链霉亲和素琼脂糖（Thermo Scientific，目录号：20357）
9.二甲基亚砜，二甲基亚砜（西格玛，目录号：D2650）
10.二硫苏糖醇，DTT（西格玛，目录号：D9779）
11.碘乙酰胺（西格玛，目录号：I6125）
12.来自猪胰腺的MS级胰蛋白酶（Sigma，目录号：T6567）
13.三氟乙酸，TFA（西格玛，目录号：T6508-10AMP-KC）
14.LC-MS级水（J.T.Baker，目录号：39253）
15.LC-MS级乙腈，ACN（J.T.Baker，目录号：9829-03）

16.尿素（MP生物医学，目录号：194857）

17.磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）

18.NP-40（西格玛，目录号：NP40S）

19.乙二胺四乙酸，EDTA（MP生物医学，目录号：194822）

20.Tris（Himedia，目录号：MB029-500G）

21.氯化钠，氯化钠（西格玛，目录号：S3014-500G）

22.蛋白质提取缓冲液（见配方）

23.分析缓冲液（见配方）

24.洗涤缓冲液（见配方）

25.洗脱缓冲液（见配方）

26.溶剂A（见配方）

27.溶剂B（见配方）

设备

1.-80°C冷冻柜（新不伦瑞克省，U410型超低温冷冻柜），用于长期储存探头

2.-20°C冷冻柜（牛蒡子）

3.单通道移液管（Eppendorf，型号：Research Plus，目录号：K31824D[10µL容量]、L24004D[100µL容量]、L25129D[1000µL容量]）

4.冰剥落机（CB 246 HC型）

5.冰桶

6.用于蛋白质定量的紫外分光光度计（Jasco，V-630Bio）

7.ROTOSPINTM–端到端试管旋转器（Tarsons，型号：3071）

8.水浴（Grant，SAP5，序号UD1541001）

9.AccuBlock数字干浴（Labnet，型号：D1100）

10.离心机（Eppendorf，型号：5418）

11.离心机（Eppendorf，型号：5810R），带15毫升适配器

12.超离心机（贝克曼·库尔特，型号：Optima XPN-100）

13.Shaker（新不伦瑞克科学公司，序号SE24FG001727）

14.集中器升级版（Eppendorf，代码：E5305000363）

15.旋涡混合器（Velp Scientifica，代码F202A0176）

16.称重天平（Sartorius，型号：CP423S）

17.Thermo Scientific LTQ或LTQ Orbitrap XL质谱仪（用于分析）

18.柱前（75µm×2cm；纳米毒蛇C18，3µm；100Å)

19.液相色谱分析柱（RSLC C18 3µm；50 cm×75µm；100Å）

程序

A.活性部位肽富集
1.在1.7毫升的微管中等分1毫克蛋白质，并用分析缓冲液（如配方部分所述）将体积补充至500μL。

2.添加10μL（20µM）脱硫菌素-FP丝氨酸水解酶探针或DMSO（无探针对照）作为对照，并在37°C下培养1小时。

3.通过添加500μL 10 M尿素停止反应。接下来，添加10μL 500mM DTT，并将样品在65°C下培养30分钟。

4.让样品冷却至室温（RT）。Add 40 μL of 1 M iodoacetamide and incubate protected from light at RT for 30 min.

5.Desalt the protein using a Zeba spin desalting column, to reduce the urea to a suitable concentration for trypsin digestion (as per the manufacturer’s instruction).

6.Digest the desalted protein with 20 μg of MS grade trypsin at 150 rpm and 37°C for 7 h.

7.Affinity captur the labelled peptides on 75 μL of 50% high capacity streptavidin agarose, by incubating the matrix with the digested peptides at constant rotation at RT for 1 h.

8.Pellet the labelled peptides bound to streptavidin agarose beads by centrifugation at 1,000 × g at RT for 1 min .

9.Wash the beads three times with 1.5 mL of washing buffer (see Recipes). Mix the beads by briefly vortexing after the addition of the buffer. Centrifuge the sample at 1,000 × g at RT for 1 min to collect the beads, and carefully remove the supernatant without disturbing them. This precaution was followed for all the subsequent steps of washing.

10.Wash the beads three times with 1.5 mL of PBS buffer (pH 7.4, see Recipes) followed by three washes with 1.5 mL of LC-MS grade water.

11.Elute the captured peptides by adding 100 μL of elution buffer (see Recipes) and incubating the sample at RT for 3 min. This step was repeated two additional times and the eluted fractions were pooled together and lyophilized by vacuum concentration.

B.Mass spectrometry analysis of enriched probe targets
1.Suspend the lyophilized and labelled peptides in 0.1% TFA and inject them directly onto a coupled with an EASY nano LC1200 system (Agilent).Thermo LTQ Orbitrap

2.Set the column temperature to 35°C and limit the flow rate to 250 nL/min.

3.The LC solvent system consists of two mobile phases, such as Solvent A (see Recipes) and Solvent B (see Recipes).

4.Separate the peptides on the analytical column“[EASY SPRAY PREAMP (RSLC C18 3 µm; 50cm × 75µm; 100Å) silica column]”, by running a 180 min gradient of solvents A and B (Start with 10% B for 2 min, gradient 10–45% for 166 min, gradient 45–95% for up to 172 min).

5.Set the mass spectrometer in positive ion mode with the following parameters: precursor ion scanning in an orbitrap analyzer in the range of 375–1,700, at a resolution of 120,000, with a maximum ion injection time of 50 ms; 产生MS/MS光谱时，碰撞能量（CID）高达30%；MS2扫描范围（m/z）至100–2000，最大离子注入时间为35毫秒。

数据分析

A.肽和蛋白质鉴定
1.将原始数据文件转换为吉祥物通用文件（MGF）文件。

2.使用吉祥物搜索引擎（版本2.7.1.0）搜索MS/MS光谱数据。

3.研究参数包括：甲酰胺甲基的固定化改性（57.02146 Da）；乙酰基的可变修饰（蛋白质N-端）（42.01057 Da）；蛋氨酸氧化（15.99492 Da）；生物素：Thermo-88317（S）（443.2913Da）。将酶特异性设置为胰蛋白酶/P，并允许最大2次缺失切割。

4.将肽质量耐受性设置为10 ppm，片段质量耐受性设置为0.6 Da，离子评分截止值设置为30，显著性阈值设置为0.05。

统计分析

数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。p<0.01时的差异显著性由使用IBM SPSS统计软件的Tukey事后检验的单因素方差分析确定。

食谱

1.蛋白质提取缓冲液

50毫米Tris-Cl（pH值8.0）

150毫米氯化钠

2.0毫米氯化钾

2.0毫米氯化镁

10%甘油

在121°C下高压灭菌20分钟，然后在4°C下储存。

2.分析缓冲液

50毫米Tris-Cl（pH值8.0）

50毫米氯化钠

10%甘油

在121°C下高压灭菌20分钟。

3.洗涤缓冲液

25毫米Tris-Cl（pH值7.4）

350毫米氯化钠

1%NP-40

5%甘油

4.活性位点肽洗脱缓冲液

50%ACN

TFA的0.2%

用5.0毫升ACN和5.0毫升LC-MS级水稀释20μL TFA。

5.溶剂A

HPLC级水中0.1%甲酸

6.溶剂B

HPLC级水中80%乙腈和0.1%甲酸

致谢

这项工作得到了印度新德里科技部DST-INSPIRE教师计划（IFA14-LSPA28）的支持。AKD得到了CSIR-UGC-JRF的支持。M.L.由UGC拉吉夫·甘地国家奖学金（RGNF）赞助。

竞争利益

作者声明没有相互竞争的利益。

工具书类

1.Bürkle，A.（2001年）。翻译后修饰。In:Brenner，S.和Miller，J.H.（编辑部）。遗传学百科全书。学术出版社，纽约，纽约，美国，第1533页。

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3.Dolui，A.K.和Vijayaraj，P.（2020a）。功能组学鉴定了在水稻种子萌发期间调动贮藏脂质的丝氨酸水解酶。植物生理学184（2）：693-708。

4.Dolui，A.K.和Vijayaraj，P.（2020b）。一种用于脂肪酶功能验证的无溶剂脱脂方法。3生物技术10（8）：343。

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