材料和试剂
A.人类诱导的多能干细胞培养和扩增
1.用于制定本方案的人类诱导多能干细胞：

a、 NL9-一种来自健康个体的成纤维细胞衍生的hiPSC系，可广泛获得（Baghbaderani等人，2016），从国家心肺血液研究所（NHLBI）iPSC核心获得（有关NL9 hiPSC系来源的更多信息，请参阅确认部分）
b、 KOLF_2——一种来自健康个体的皮肤组织衍生hiPSC细胞系，由桑格研究所产生，作为HipSci倡议的一部分
(https://www.hipsci.org/lines/#/lines/HPSI0114i-科尔夫2号)

2.完整的Essential 8基础培养基（赛默飞世尔，目录号：A1517001）

3.Vitron（Vtron-4700）产品目录号

4.Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS），不含Ca2+/Mg2+500 mL（赛默飞世尔，目录号：14190144）（储存条件：15-30°C。保质期：自生产之日起36个月）

5.岩石抑制剂（ROCKi）（Y-27632二盐酸盐）（西格玛，目录号：Y0503-1MG）

6.10 cm或6孔组织培养处理板（康宁，目录号：430167或3516）

7.0.22 µm过滤器steri杯（默克密理博，目录号：1578019）

8.15 mL和50 mL猎鹰管（猎鹰，目录号：352097和352098）

B.在无饲养系统中产生胚状体
1.0.5 M超纯乙二胺四乙酸（EDTA）（Invitrogen，目录号：

15575020），100毫升

2.冷冻保存/冷冻培养基：敲除血清置换（KSR）（Gibco，目录号：10828028），500毫升

3.二甲基亚砜（DMSO）（西格玛，目录号：D2438），50毫升

4.Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS），含Ca2+/Mg2+，500 mL（赛默飞世尔，目录号：14040091）（储存条件：2-8°C。保质期：自生产之日起36个月）

5.牛血清白蛋白（BSA）低内毒素组织培养级（西格玛，目录号：A9543-5G）

6.重组人BMP-4蛋白10µg（研发系统，目录号：314-BP-010）

C.胚状体转移、培养和巨噬细胞分化
1.胚胎移植用无菌水（Sigma，目录号：W1503）

2.猪皮明胶（西格玛，目录号：G1890）

3.X-VIVO 15无血清造血细胞培养基500 mL（Lonza，目录号：LZBE02060F）

4.L-谷氨酰胺（200mM），100mL（Gibco，目录号：25030181）

5.青霉素链霉素（10000 U/mL），100 mL（Gibco，目录号：15140122）

6.2-巯基乙醇（西格玛，目录号：M3148）

7.重组人M-CSF（Peprotech，目录号：300-25）

8.重组人IL-3（Peprotech，目录号：200-03）

9.RPMI 1640中等浓度500毫升（西格玛，目录号：R0883）

10.超低粘性U型底部96孔板（Costar，目录号：7007）

11.10 cm组织培养皿或6孔板

12.70-100 µm细胞过滤器（猎鹰）

13.完整的8种基本培养基（见配方）

14.卵黄连蛋白1毫升小瓶（见配方）

15.岩石抑制剂（ROCKi）（见配方）

16.0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（见配方）

17.冷冻保存/冷冻介质（见配方）

18.牛血清白蛋白（BSA）（见配方）

19.重组人BMP-4蛋白（见配方）

20.用于胚胎移植的无菌水（见配方）

21.猪皮制成的明胶（见配方）

22.EB髓样前体基础培养基（见配方）

23.重组人M-CSF（见配方）

24.重组人IL-3（见配方）

25.巨噬细胞分化基础培养基（见配方）

本方案中使用的流式细胞仪抗体

1.CD14（BV605，Biolegend，目录号：301834）

2.CD16（APC，eBioscience，目录号：17-0168-42）

3.CD80（BV711，Biolegend，目录号：305236）

4.CD86（PE-Dazzle594，Biolegend，目录号：374217）

5.CD206（PerCP/Cynine 5.5，Biolegend，分类号：321122）

6.CD204（PE/Cyanine7 Biolegend，目录号：371908）

本协议中使用的引物序列

1.TATA结合蛋白（TBP）（F:GGGAGGCATATTTG，R:CCAGAGCAGGTA）。

2.CD68（F:GGAAATGCCAGGTTCATCCA，R:TGGGGTTCAGATACAGAGATGC）

3.CSFR1（F:TCCAACATGCCGGCAACTA，R:GCTCAAGTCAAGTCTCT）

4.CD163（F:TTTGTCaactTGAGTCTCTC，R:TCCGCTACTCTTTTTCAC）

5.SOX2 F:GCTACAGCATGATCAGACCA，R:TCTGCGAGCGGTCATGGAGTT）

6.NANOG（F:CTCCACATCTGACTGACTCACG，R:CGTCACACATGCTATTCTCG）

7.十月四日（F:CCTGAGAGAGAGATCACC，R:AAAGCGAGAGATGGTCGTTTGG）

设备

1.使用无菌技术的2级微生物安全罩或柜

2.37°C培养箱，含5%二氧化碳

3.离心机

4.相衬显微镜（4倍、10倍、40倍放大）

5.水浴温度设置为37°C

6.-80℃储存

7.液氮储存

8.细胞冷冻容器（“Frosty先生”）

9.移液管控制器和不同容量条带（5毫升、10毫升）的选择，这些条带通常有大口径孔

10.移液管（P1000、P200、P20、P2）和相应的无菌尖端。

11.ParafilmTM

程序

一般考虑：

1.所有细胞培养、培养基制备、组织培养容器和其他实验室工作均应使用无菌技术在2级微生物罩内进行。

2.使用前，应使用3%的Distel（或同等消毒剂）和70%的乙醇彻底清洁发动机罩。

3.在室温（RT）下准备所有介质、溶液和试剂。有关详细信息，请参见“食谱”部分

更多关于媒体准备的详细信息。

A.人类诱导的多能干细胞培养和扩增
1.按照“材料和试剂”或“配方”部分中的说明，准备所有细胞维护基础培养基和试剂。

2.准备卵黄连蛋白板。卵黄连蛋白是一种糖蛋白，用于覆盖细胞培养板表面，促进hiPSC附着和扩散。将一份60μL小份解冻至RT，并稀释至不含Ca2+/Mg2+的6 mL DPBS中。如果使用6孔板，每孔添加1-1.5毫升；或者，在一个10厘米的盘子中加入6毫升。确保卵黄连蛋白覆盖整个表面，并在室温下在罩中培养1-2小时。卵黄连蛋白板可使用ParafilmTM密封，并在4°C下储存5天。Allow to warm to RT for 1–2 h prior to use.

3. 通过添加解冻的补充剂并让培养基升温至 RT 来制备 E8 基础培养基。我们建议在 E8 基础培养基中培养和扩增解冻的 hiPSC，并尽早冷冻和储存大量的 hiPSC 系。

4. 用 9 mL E8 培养基加 0.312 µM ROCKi 设置 15 mL Falcon，将一瓶冷冻的 1 mL hiPSC，即 1 µL ROCKi 放入最终体积为 10 mL。虽然 ROCKi 允许 hiPSC 的附着和恢复，同时防止细胞凋亡和自发分化，但必须在 24 小时后将其从培养基中取出，以防止干扰集落扩展。

5. 使用 37°C 的水浴快速部分解冻冷冻的 hiPSC，直到刚刚解冻，小瓶中残留一些冰块（解冻应该快速，以避免与 DMSO 长时间接触；但是，不要将整个小瓶加热至37℃）。将 1 mL 的 E8 以逐滴方式添加到小瓶中，然后使用大口径移液器尖端或条纹轻轻地将细胞转移到 15 mL Falcon。倒置管子以混合和稀释 DMSO。

注意：冷冻管中的确切细胞数量或密度通常在冷冻时是未知的，也无法确定，以避免产生单细胞悬液，并提高解冻后的恢复率，以便后续培养。从一个先前 70-80% 汇合的 10 厘米 hiPSC 板产生 6-10 个冷冻管。

6. 在 290 × g 和 20°C 下旋转 3 分钟。弃去上清液。

7.从板表面吸出稀释的玻连蛋白。一个解冻的冷冻管在离心后应在 15 mL Falcon 中提供一个小的 5–20 µL 细胞沉淀。将颗粒轻轻重悬在所需体积的 E8 培养基中，辅以 3.12 μM ROCKi（1 μL：1，000 μL），避免过度移液。

注意：ROCKi 以前曾在 10 µM 的早期改编协议中使用过，但我们有

进一步滴定，并在 3.12 µM 的较低浓度下看到有效的 hiPSC 附着和恢复。

8. 6 孔板每孔 2 mL 细胞悬液或每 10 cm 培养皿 8 mL；旨在使用最少的媒体量来提高依从性。一瓶冷冻的 hiPSC（相当于 6 孔板的 1 个孔，或 70-80% 汇合度时 10 cm 培养皿的十分之一），可以分成 6 孔板的 2-3 个孔，或者如果hiPSC 系表现出良好的恢复，然后细胞可以

直接播种到 10 厘米的培养皿中。当多个小菌落在播种后 24 小时附着在玻连蛋白板上时，恢复被描述为良好（参见图 1），并且在接下来的几天内发生菌落扩张（参见图 2）。

9. 将培养板置于 37°C 加湿 5% CO2 的培养箱中。确保板最初轻轻搅动，使菌落均匀分布在玻连蛋白上。

10. 24 小时后在相差显微镜下检查附件（见图 1）。

11.每 24 小时更换一次培养基，用吸管或吸管去除未附着的菌落、死细胞和用过的培养基。如果有很多死细胞或碎片，则在更换 E8 介质之前用 DBPS 清洗板。轻轻更换新鲜的 E8 基础培养基，在容器侧壁上使用条纹（前 24 小时后不需要补充 ROCKi）。 hiPSCs 难以在培养中维持，并且容易分化、培养基细胞因子和维持多能性的因素，需要每天更换培养基。

12.继续每天更换培养基，直到细胞达到 70–80% 融合并准备好

传代。不要让簇/菌落融合在一起（参见图 3、4 和 5），这有助于避免自发分化。一旦建立解冻的 hiPSC，后续步骤、培养系统和进一步分化应在 1-2 次传代后进行。

图 1. 第 1 天 hiPSC 附着并在玻连蛋白上紧密相邻的小菌落中生长。

使用带有 10 倍物镜的 Olympus CKX41 倒置显微镜拍摄的图像。

图 2. 在玻连蛋白上生长和扩展的异源 hiPSC 菌落示例。

使用带有 4 倍物镜的 EVOSTM XL Core 成像系统拍摄的图像。

图 3. 在 EVOSTM XL Core 成像系统的屏幕上，用 4 倍物镜成像的 70–80% hiPSCs 汇合板，在几乎相互接触的菌落中生长。

图 4. 70–80% 汇合板的特写图像，其中多个大菌落肉眼可见。

图 5. 传代前 70–80% 融合的 hiPSC。使用配备 20 倍物镜的 Olympus CKX41 倒置显微镜获得的图像。

B.hiPSC的传代和冷冻
1. 像以前一样准备玻连蛋白板。

2. 从具有 70–80% 融合度的 hiPSC 板中取出用尽的培养基，并用不含 Ca2+/Mg2+ 的 DPBS 清洗板/孔两次（10 cm 培养皿约 6 mL）。

3. 除去 DPBS，加入 6 mL 0.5 mM PBS-EDTA 溶液，使板面完全覆盖。

4.在相差显微镜下观察细胞
每 2 分钟最多 4 分钟，以监测细胞形态变化和脱离（明亮的光晕和集落边缘增强），但不要让细胞完全脱离和分离成单个细胞。

5. 倾斜平板轻轻取出并丢弃 PBS-EDTA，但不要去除菌落。

6. 使用条带将 8 mL E8 培养基添加到 10 cm 板中，目的是分离和洗涤小团块和簇中的菌落，使其悬浮，使用相同的 8 通过条带反复抽吸和冲洗培养基多达四次毫升体积。将培养基和细胞收集到新的 50 mL Falcon 中。重复此步骤最多两次，以最大限度地恢复菌落，同时避免过度搅拌和移液，这将导致单细胞。

7. 在 290 × g 和 20°C 下旋转细胞 3 分钟。弃去上清液。

8. 将菌落重悬在补充有 3.12 mM ROCKi 的新鲜 E8 基础培养基中，并以所需的分裂比例（1:5–1:30，取决于 hiPSC 系的生长速率）。

9.从预先准备好的板中吸出玻连蛋白溶液。将分裂的菌落转移并播种到新的玻连蛋白板/孔中。

10.hiPSC的冷冻保存/冷冻：

要冷冻 hiPSC 细胞，请在 RT 处新鲜制备冷冻培养基（KSR 中的 10% DMSO）。收获 hiPSC（步骤 B2-B7）后，将细胞颗粒重新悬浮在 10% DMSO-KSR 中，并在每个冷冻管中转移 1 mL 的细胞悬浮液。重要的是，细胞在 RT 存在 DMSO 时花费最少的时间。冷冻管应立即放入 Mr. Frosty 或适当的冷冻容器中，然后放入 -80°C 冰箱中，然后在 24 小时后放入液氮中，以便长期储存。注意：准备冷冻培养基的体积取决于要储存的冷冻管的数量。我们建议在 70-80% 的汇合度下，每个冷冻管 1 mL 冷冻培养基和 6 孔板每孔 2 个冷冻管和每 10 cm 培养皿 6-10 mL 或 6-10 个冷冻管。

C.利用无饲养系统形成胚体
1. 收获 hiPSC 后（如步骤 B2-B7 中所述），加入 1 mL 新鲜 E8 培养基并比平时更多地上下移取 hiPSC（3-4 次移液），以打散团块并创建一个细胞悬液。

2.使用血细胞计数器，加入10 µL台盼蓝（稀释因子=2）后，在10 µL细胞悬液中计数细胞，测定细胞密度：

（3 个方格中的细胞数 / 3）× 稀释倍数 × 10,000 = 细胞数/mL

3. 使用超低粘附性 U 型底 96 孔板（每孔 1 个 EB）制备单个、均质且大小相同的 EB。有了上面收获的总细胞数的知识，可以计算所需的 EB 大小（细胞数）和要制造的单个 EB 的总数。例如，如果收获 3 × 106 hiPSC = 100 × 可以制作 3 × 104 大小的单个 EB。

注意：可能需要为每个 hiPSC 线确定 EB 的大小。然而，在我们手中，1 × 104–5 × 104 细胞之间的 EB 大小为该协议生成中使用的两个 hiPSC 系产生最高产量的骨髓前体（高达 1 × 105 细胞的 EB 也可以很好地工作） .

4. 每个单独的 EB 由 100 µL 的 E8 培养基组成，辅以 50 ng/mL 重组 BMP-4 和 3.12 µM ROCKi。根据所需的 EB 大小，创建每毫升 1 × 105–10 × 105 个细胞的细胞悬浮液。

对于上面计算的示例，应创建 3 × 105 细胞/mL 的细胞悬浮液，以在超低粘附 U 底 96 孔板的每孔 100 μL 补充 E8 中生成 3 × 104 大小的单个 EB。

5. 将 100 µL hiPSC 细胞悬液转移到超低贴壁 U 型底 96 孔板的每个孔中。

6. 将板以 800 rpm 转速旋转 1 分钟，然后转移到 5% CO2 的 37°C 加湿培养箱中。

7. 让这些 EB 不受干扰 48 小时，在培养的第 2 天，去除 50 µL 用过的培养基，小心地更换为 50 µL 的 E8 培养基，仅补充 50 ng/mL BMP-4，目的是不干扰正在形成的 EB .重复第 3 天（参见图 6）。 ROCKi 可以干扰晚期 EB 和胚层的形成。

8.每口井发现一个以上的EB是不常见的（见图7和图8）；但是，如果一个井中每个 EB 的外观与图 6 中看到的相似，具有清晰的边缘和 3D 结构，则可以转移井内的所有 EB。每当发现多个小团块或破碎和破碎的 EB 外观时，应丢弃孔和细胞材料。

9.第 4 天，准备涂有明胶的 10 厘米盘子。在 10 cm 培养皿中加入 6 mL 0.1% 明胶溶液，在通风橱中孵育 1-2 小时，使明胶覆盖整个表面并加热至室温（板可预先制备并在 4°C 下储存5天）。

10. 在 EB 转移之前从板上除去明胶溶液。

11.使用宽口径 P1000 滤芯吸头（或者，可以用手术刀将 P1000 滤芯吸头向上切割，以形成大口径或
Měi 2 fēnzhōng zuìd
ifice), 小心吸出容易看到的单个 EB, 并将它们转移到明胶涂层板上 (图 9)。每 cm2 的 EB 数量可能需要确定每个 hiPSC 系，然而，根据我们的经验，每 10 cm 培养皿高达 35× EB 可提供高产量的骨髓前体。

图 6. 胚体在培养 24 小时后应具有这种外观。

这是 96 孔超低粘附板的一个孔中的 EB，在转移到明胶板之前的第 4 天。 EB 大小为 3 × 104 hiPSC。使用带有 4 倍物镜的 EVOSTM XL Core 成像系统拍摄的图像。

图 7. 肉眼可见 96 孔超低粘附板的每个孔中心的单个 EB。

图 8. 近距离的单个 EB 并用箭头标记。

图 9. 将单个 EB 吸入大口径移液器中以转移到下方的明胶涂层板中。

12. 转移后，轻轻倾斜板并从板中取出用过的 EB 培养基，不要去除 EB。

13.慢慢加入 10–12 mL 新鲜的 EB-骨髓前体培养基，辅以 50 ng/mL M-

CSF，对骨髓分化至关重要，25 ng/mL IL-3，对造血规范和增殖至关重要。

14. 小心地将这些板移至 37°C 加湿 5% CO2 的培养箱中。静置 1 周，让 EB 附着在明胶上（见图 10）。

15.在第 7 天，小心地取出带有大孔条纹的用过的 EB 培养基，以避免损坏任何未连接的 EB。注意不要移动任何附着的 EB，并将介质通过 50 mL Falcon 管上的 70-100 μm 过滤器，以捕获并保留所有未连接的悬浮 EB。

16. 将过滤器中的 EB 放回原盘中，将过滤器倒置在 10 cm 培养皿上，轻轻加入补充有 50 ng/mL M-CSF 和 25 ng/mL IL-3 的新鲜 EB 培养基，加热至 RT倒置的过滤器。继续注意不要将附加的 EB 移出板中。

17. 更换 EB 培养基并将 EB 放回培养皿后，将 50 mL Falcon 在 290 × g 和 20°C 下旋转 3 分钟。在第 3 周，该管将包含悬浮的收获的骨髓前体。弃去上清液。

18. 向细胞沉淀中加入 1 mL 巨噬细胞分化培养基，在显微镜下观察细胞外观，用血细胞计数器计数（见步骤 C1）。

19.EB 培养基应继续按照步骤 C14-C17 中的说明每周更换。根据 hiPSC 线，应从 EB 培养的第 3-4 周收获骨髓前体。

20.EBs 可以在培养物中维持数月。在我们手中，骨髓前体的产量从 12-16 周开始下降。

图 10. 胚体附着：转移到明胶板上 1 周后。

使用带有 4 倍物镜的 EVOSTM XL Core 成像系统拍摄的图像。

D.巨噬细胞分化
1.如步骤 C14–C17 中所述收获骨髓前体。计数后，将收获的骨髓前体重新悬浮在所需体积的巨噬细胞分化培养基中，并辅以高浓度 100 ng/mL M-CSF。

2. 将细胞接种到所需的培养板中，理想情况下为 0.5 × 106-1 × 106，大约 8-10

每 10 cm 培养皿中加入 mL 巨噬细胞分化培养基，或者 6 孔板每孔 3 mL 中加入 1.5 × 105，或者在 96 孔板上每孔加入 1.5 × 104 × 150 µL（参见图 11a）。

3.将细胞转移到 37°C 加湿 5% CO2 的培养箱中，静置 5–7

天（见图 11b）。

4. 然后可以用 0.5 mM EDTA 溶液提起细胞，有或没有细胞刮刀的帮助。 0.5 mM EDTA 溶液应覆盖细胞 10 分钟。应重新计数细胞并通过流式细胞术或 qPCR 或随后的功能表征细胞表型（参见图 12 和 13）。

注：巨噬细胞数量应与骨髓前体细胞数量相近

接种到板上，但这个数字可能因细胞系而异，也取决于 EB 大小。

5. 收获后培养 10-14 天的细胞往往会变成成纤维细胞样（图 11c）。

图 11. 骨髓前体外观 (a) 收获后的骨髓前体 (b) 7 天后分化的附着巨噬细胞。使用带有 20 倍物镜的 EVOSTM XL Core 成像系统拍摄的图像。 (c) 收获后 14 天的成纤维细胞样细胞。使用带有 20 倍物镜的 Olympus CKX41 倒置显微镜拍摄的图像。

数据分析

图 12. 显示巨噬细胞标志物 CD14 (BV605)、CD16 (APC)、CD80 (BV711)、CD86 (PE-Dazzle594)、CD206 阳性的代表性流式细胞仪图

(PerCP/Cyanine 5.5) 和 CD204 (PE/Cyanine7) 在分化的 iMACS 中。（黑色 = 未染色的 iMAC，红色 = iMAC）。

图 13. 展示 iMAC 巨噬细胞特征的代表性 qPCR 数据。相对表达是常态

化为 TATA-Bing 蛋白 (TBP)。

与 iMACs 相比，iMACs 中泛巨噬细胞标志物的表达增加：CD68、CSFR1 和 CD163，并且与 iMACs 相比，hiPSCs 中的多能标志物 SOX2、NANOG 和 OCT4 的表达增加。

食谱

所有培养基制备和实验室工作都将使用无菌技术在 2 级微生物罩内进行。在 RT 准备所有介质、溶液和试剂。

1.Complete Essential 8 基础培养基由两部分组成：

490 mL 培养基（储存于 2–8°C 并避光）和 10 mL 补充剂 (50×)（储存于 - 5 至 -20°C。保质期：12 个月）。

要重组，解冻补充 RT 并添加到 490 mL 的媒体。

或者，将补充剂分装到较小的体积中，以便在 -20 至 -80°C 下长时间储存，并根据需要解冻。

旋转或倒置混合。

将重构的基础培养基储存在 2–8°C，保质期 2 周。允许在使用前升温至 RT。

2.Vitronectin：1 mL 小瓶（-80°C 保存。保质期：24 个月）分成 60 µL 无菌等分试样。

涂板：将 60 µL 稀释到 6 mL 不含 Ca2+/Mg2+ 的 DPBS 中，或以 2.5–10 µg/mL 的浓度使用。

反转混合。

确保在储存前使用封口膜密封板的边缘，用于任何预先准备好的板。

3.ROCK抑制剂（ROCKi）（储存在2-8°C）

准备 3.12 mM 工作浓度库存，即用 1 mL 无菌超纯水重组 1 mg。

分成 10 µL 等份（-20°C 储存）。

用于 0.312 µM 或 3.12 µM 最终浓度。

解冻后，ROCKi 原液可在 2–8°C 下保存 7 天。

4.0.5 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液（室温储存）

在 50 mL 的 DPBS 中稀释 50 μL，不含 Ca2+/Mg2+，工作浓度为 0.5 mM，储存在 RT，并在制备当天使用。

5. 冷冻保存/冷冻培养基（-5 至 -20°C 保存，避光。保质期 18 个月）分装成小体积。

将 1 mL 的 DMSO 添加到 9 mL 的解冻敲除血清替代物 (KSR) 中，使最终浓度为 10% 的 DMSO 进行冷冻。

在制备当天使用，并在液氮中长期储存 hiPSC。

6.牛血清白蛋白（BSA）（储存在2-8°C）

将 100 mg BSA 添加到 100 mL 含有 Ca2+/Mg2+ 的 DPBS 中，混合，然后置于 37°C 水浴中直至 BSA 溶解。

过滤除菌（储存在 2–8°C，保质期 4 个月）。

7.重组人BMP-4蛋白（-20至-70°C保存。保质期12个月）

重组为 50 µg/mL 工作浓度库存（10 µg 在 200 µL 的 4 mM HCl 和 0.1% BSA 中）。分装成小体积。

最终浓度为 50 ng/mL（储存在 -20 至 -80°C）。

8.胚胎移植用无菌水（室温储存）

9.来自猪皮的明胶（储存于室温）

配制 0.1% 明胶溶液：将 500 mg 明胶加入 500 mL 水中，加热至 56°C 溶解，过滤除菌（4°C 酸痛长达 4 个月）。

10.EB-骨髓前体基础培养基：

向 500mL X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基中添加： 2 mM (5 mL) L-谷氨酰胺（储存于 -5 至 -20°C。保质期 24 个月），

100 IU/mL (5 mL) 青霉素-链霉素（-5 至 -20°C 储存。保质期 12 个月）

0.1 mM (3.5 µL) 2-巯基乙醇（室温储存）过滤除菌（2–8°C 储存）。

11.重组人M-CSF

复溶：将 500 µL 0.1% BSA 溶液添加到 0.5 mg 冻干 rhM-CSF 中，以达到 1 mg/mL 储备浓度（在 -20 至 -80°C 下以 5 µL 等分试样储存。保质期 12 个月）。

使用前解冻添加到新鲜培养基中（以 50ng/mL 最终浓度使用）。避免重复的解冻循环。

12.重组人IL-3

复溶：将 1 mL 的 0.1% BSA 溶液添加到 0.5 mg 冻干的 rhIL-3 中，以达到 0.5 mg/mL 的储备浓度（在 -20 至 -80°C 下以 5 µl 等分试样储存。保质期 12 个月）。

在使用前解冻以添加到新鲜培养基中（用于 25 ng/mL 最终浓度）。避免重复的解冻循环。

13.巨噬细胞分化基础培养基向500mL RPMI 1640培养基中加入：10%（50mL）胎牛血清

2 mM (5 mL) L-谷氨酰胺过滤灭菌（储存在 2–8°C）。

致谢

由医学研究委员会、英国肾脏研究中心、国家健康研究所、皇家学会和威康信托基金提供的研究资金。

用于开发该协议的 NL9 hiPSC 由 Claudia Kemper 教授和国家心肺血液研究所 (NHLBI) iPSC 核心 (https://www.nhlbi.nih.gov/science/ipsc-core/) 慷慨捐赠研究），巴塞斯达，马里兰州，美国。

还要感谢伦敦国王学院的 Anthony Dorling 教授的耐心指导，

监督和持久的鼓励。

该协议源自先前发布的协议（van Wilgenburg 等人，2013 年；Mukherjee 等人，2018 年；Lopez-Yrigoyen 等人，2020 年）。

利益争夺

没有需要申报的财务或非财务竞争利益。

参考文献

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