材料和试剂

1.Tris-HCl（Dot Scientific Inc.，目录号：DST60040-5000）
2.CaCl 2 （Fisher Bioreagents，目录号： C79-500）
3.5'-三磷酸腺苷（ATP）（New England Biolabs，目录号：P0756S）
4.DTT（Ro c he，目录号：3483-12-3）
5.MES游离酸一水合物（Gold Biotechnology，目录号：M-090-500）
6.MgCl 2 （Fisher Bioreagents，目录号：BP-214-500）
7.3'，5'-二甲氧基-4'-羟基苯乙酮（乙酰丁香酮）（Acros Organics，目录号：115540050）
8.P19质粒
9.液氮
10.NaCl（Fisher Bioreagents，目录号：BP358-10）
11.EDTA，pH 8.0（VWR，目录号：BDH4528-500GP）
12.苯基甲烷磺酰氟（PMSF）（Acros Organics，目录号：215740100）
13.过硫酸铵（Acros Organics，目录号：327085000）
14.TEMED（Invitrogen，目录号：15524-010）
15.甘氨酸（Fisher Bioreagents，目录号： BP381-5）
16.SDS微丸（Fisher Bioreagents，目录号： BP8200-500）
17.KCl（Micron Fine Chemicals，目录号： 6858-04）
18.Na 2 HPO 4 （Dot Scientific Inc.，目录号： DSS23100-1000）
19.KH 2 PO 4 （Fisher Bioreagents，目录号： P285-500）
20.溴酚蓝游离酸（Gold Biotechnology，目录号： B-092-5）
21.2-巯基乙醇（Acros Brganics，目录号： 125472500）
22.甘油（Fisher Bioreagents，目录号： G31-500）
23.Tween 20（Fisher Bioreagents，目录号： BP337-500）
24.Halt TM蛋白酶抑制剂混合物，100 × （Thermo Fisher Scientific，目录号：78430）
25.泛素激活酶E1（ Enzo Life Science，目录号：BML-UW9410-0050）
26.泛素结合酶 E2（重组人 Ubc5b/UBE2D2；R&D Systems，目录号：E2-622-100）
27.重组人Myc-泛素蛋白（R&D System，目录号：U115）
28.抗泛素（P4D1）抗体（Santa Cruz，目录号： SC-8017）
29.抗GFP抗体（Roche，目录号： 1181446001）
30.麦芽糖结合蛋白多克隆抗体（Invitrogen，目录号： PA1-989）
31.山羊抗小鼠IgG（H + L）二抗，HRP（Invitrogen，目录号： 31430）
32.山羊抗兔IgG-HRP二抗（Santa Cruz，目录号： sc-2030）
33.Pierce TM Magnetic A/G 琼脂糖珠（Thermo Fisher Scientific，目录号： 88802）
34.SDS-PAGE 凝胶（遵循 Bio-Rad 配方）
35.PageRuler 预染蛋白梯，10 至 180 kDa（Thermo Scientific，目录号： 26617）
36.Amersham Protran Western印迹膜夹层，硝酸纤维素（Amersham，目录号： 19240725）
37.磷酸盐缓冲盐水 (PBS)
38.含 0.05% Tween 20 (PBS-T) 的磷酸盐缓冲盐水
39.脱脂奶粉（ MP Biomedicals，目录号： 0290288705）
40.化学发光 HRP 底物试剂盒（ Thermo Scientific，目录号： 34094）
41.5 × SDS 样品缓冲液（参见配方）
42.1 × SDS 运行缓冲液（参见配方）
43.1 ×传输缓冲器（见配方）
44.1 ×磷酸盐缓冲盐水（含 0.05% Tween-20 的 PBS-T）（参见配方）
45.3% 封闭缓冲液（参见配方）
46.烟草浸润缓冲液（见配方）
47.免疫沉淀缓冲液（见配方）

设备

1.冷冻离心机（Labnet，型号：C2500-R）
2.超声仪（Fisher 品牌，型号：F1350）
3.蛋白质电泳仪（Bio-Rad、Mini-PROTEAN tetra handcast 系统和 PowerPac 电源）
4.蛋白质转移系统（Trans-Blot Turbo System，型号：1704150）
5.台式摇床（Labnet，型号：orbit1000）
6.台式管旋转器（Fisher品牌，型号：88861051）

程序

A.MBP-SINAT2的自泛素化分析

1.制备总体积为 30 μL 的泛素化反应混合物，包括 40 mM Tris-HCl、pH 7.5、5 mM CaCl 2、2 mM ATP、2 mM DTT、50 ng E1、250 ng E2、1 μg 泛素和 500 ng 纯化的重组蛋白（MBP、MBP-SINAT2 或 MBP-SINAT2 C63S ）。为麦芽糖结合蛋白 (MBP)、MBP-SINAT2 或 MBP-SINAT2 C63S设置两个泛素化对照反应，通过添加没有 E1 或 E2 的泛素化反应混合物（图 1）。

2.通过将含有反应混合物的 Eppendorf 管放在台式试管旋转器上，将混合物在 30°C 下搅拌孵育 1 小时。
3.加入 5 × SDS 样品缓冲液以停止反应。
4.将反应和预染蛋白标记 (2.5 µL) 应用到 8% SDS-PAGE 凝胶上。通过在 120 V 的 1 × SDS 运行缓冲液中电泳分离反应样品150 分钟。
5.使用 Bio-Rad Transblot Turbo 转移系统在室温和 25 V 下将 SDS-PAGE 凝胶中的蛋白质转移到 1 ×转移缓冲液中的硝酸纤维素膜 30 分钟。
6.从传输系统中取出膜并将其放入塑料容器（7 cm × 9 cm）中。简而言之，用 1 × PBS-T清洗膜。
7.在室温下用 3% 的封闭缓冲液封闭膜，并使用摇床轻轻搅拌 1 小时，然后将初级抗 MBP 或抗泛素抗体添加到封闭缓冲液中，稀释度如下：1:10,000抗 MBP，抗泛素抗体为 1:3,000。在室温下使用摇杆轻轻搅拌，将膜与一抗溶液一起孵育 1 小时。
8.在室温下用 1 × PBS-T 在摇杆上轻轻搅拌冲洗膜四次，每次 10 分钟。
9.要检测抗 MBP 和抗泛素，请将膜放入含有 3% 阻断缓冲液的塑料容器中。加入稀释度为 1:5,000 的二抗，在室温下在摇床上轻轻摇动孵育膜 50 分钟。
10.在室温下用 1 × PBS-T 在摇杆上轻轻搅拌冲洗膜四次，每次 10 分钟。
11.将膜置于保鲜膜上，均匀涂抹化学发光溶液，孵育3 min。
12.从膜上去除多余的化学发光溶液，用保鲜膜包裹膜，并将其放入 X 射线盒中。
13.将 X 射线胶片添加到暗盒中，并使用胶片处理器显影胶片。

图1 。 SINAT2 的自动泛素化。
MBP-SINAT2 E3 连接酶在 E1、E2 和泛素蛋白存在的情况下自动泛素化，而游离 MBP 和非活性 MBP-SINAT2 C63S无法自动泛素化（根据Lee等人，2021 年修改）。

B.免疫沉淀底物蛋白的底物泛素化分析

1.用用YFP-ACS5质粒 DNA 和 P19转化的根癌农杆菌浸润在生长室（ 16 小时光照/8 小时黑暗循环；28°C/28 °C ）中生长的烟草 ( Nicotiana benthamiana )，并在28°C 3 天。
2.用激光刀片切除一部分渗透的烟叶, 并使用荧光显微镜观察 YFP-ACS5 的 YFP 荧光。如果在整个渗透的叶子中广泛观察到 YFP 荧光，请继续执行步骤 3；否则，重复步骤 1，直到观察到 YFP 荧光（图 2）。
3.从两片渗透的烟叶中提取总蛋白质，方法是使用液氮研磨叶子，然后在 300 μL 的共免疫沉淀缓冲液中均匀化接地的组织粉末（参见食谱）。
4.在 12,400 × g和 4°C 下离心 15 分钟，然后将 200 μL含有总蛋白提取物的上清液转移到新的微量离心管中。
5.底物泛素化反应在 50 μL 的总体积中进行，由40 mM Tris-HCl、pH 7.5、5 mM CaCl 2组成， 2 mM ATP、2 mM DTT、50 ng E1、250 ng E2、1 μg 泛素、总共 40 μL来自步骤 4 的含有 YFP-ACS5 蛋白的蛋白质提取物和 500 ng 纯化的 MBP-SINAT2 （或 MBP，或 MBP-SINAT2 C63S ）。游离 MBP 和非活性 MBP-SINAT2 C63S用作阴性对照。用于输入分析的每个反应的等分 10 μL（图 3）。
6.使用台式实验室旋转器在 30°C 下轻轻旋转孵育混合物 1 小时。
7.从步骤 6 开始，将 5 µg 抗 GFP 和蛋白 A/G 琼脂糖磁珠 (20 µL) 添加到泛素化反应管中，并在 4°C 温和搅拌下孵育过夜。
8.使用磁性支架收集蛋白 A/G 磁珠，并用免疫沉淀缓冲液洗涤反应混合物 3 次（参见配方）。
9.× SDS 样品缓冲液从蛋白质 A/G 琼脂糖磁珠中洗脱结合的蛋白质。
10.如 MBP-SINAT2 的自动泛素化分析（步骤 4 至 13）中所述执行电泳和西方印迹，并使用抗 MBP、抗泛素和抗 GFP 抗体检测泛素化 YFP-ACS5 和输入蛋白。

图 2. YFP-ACS5 在本氏烟草叶片中的表达。
YFP-ACS5质粒转化的农杆菌浸润N.benthamiana叶并孵育 3 天。通过共聚焦显微镜在整个叶片中广泛观察到 YFP-ACS5 的荧光。比例尺，50 µm。

图 3。 SINAT2 E3 连接酶介导的 ACS5 底物泛素化。
YFP-ACS5 的泛素化仅在存在活性 MBP-SINAT2 E3 连接酶蛋白的情况下检测到。游离 MBP 和 MBP-SINAT2 C63S是一种非活性形式的 SINAT2，是阴性对照。空心三角形表示游离 MBP 和 MBP 融合的 SINAT2 蛋白（修改自Lee等人，2021）。

食谱

1.5 × SDS 样品缓冲液
10% SDS
30% 甘油
0.02% 溴酚蓝
250 mM Tris-Cl，pH 6.8
5% 2-巯基乙醇

2.1× SDS 运行缓冲液
25 毫米三
192 毫米甘氨酸
0.1% SDS
酸碱度 8.3

3.1× 传输缓冲器
25 毫米三
192 毫米甘氨酸
20% 甲醇 (V/V)
0.05% SDS

4.1× 磷酸盐缓冲液（含 0.05% Tween-20 的 PBS-T）
137 毫米氯化钠
2.7 毫米氯化钾
10 毫米钠2 HPO 4
1.8 毫米 KH 2 PO 4

5.3% 封闭缓冲液
PBS-T 中 3% 脱脂奶粉 (w/v)
6.烟草浸润缓冲液
10 毫米 MES，pH 5.6
10 毫米氯化镁2
100 µM 乙酰丁香酮

7.免疫沉淀缓冲液
25 mM Tris，pH 7.5
150 毫米氯化钠
5 mM EDTA，pH 8.0
1 毫米 DTT
1 毫米 PMSF
1 ×蛋白酶抑制剂混合物

致谢

这项工作得到了普渡大学启动基金和 NSF (MCB 1817286) 对 GMY 的支持。该协议改编自 Lee等人的研究文章。（2021 年）。

利益争夺

作者声明对这项研究没有竞争利益。

参考

Cappadocia, L. 和 Lima, CD (2018)。泛素样蛋白偶联：结构、化学和机制。化学修订版 118（3）：889-918。
Lee, HY, Park, HL, Park, C., Chen, YC 和 Yoon, GM (2021)。 E3连接酶的相互拮抗调节控制ACC合酶的稳定性和对压力的反应。 Proc Natl Acad Sci USA 118(34): e2011900118。
Sharma, B.、Joshi, D.、Yadav, PK、Gupta, AK 和 Bhatt, TK (2016)。泛素介导的降解系统在植物生物学中的作用。前植物科学7：806。