材料和试剂
质粒文库构建
1. 基因脉冲器/微脉冲器电穿孔比色皿，0.1 cm 间隙（Bio-Rad，目录号：1652089 ）
2. pNTI743双条形码gRNA亲本载体（ Addgene ，目录号：164915），-20 °C储存
3. pNTI757 P(PGK1)-citrine P(HIS4)-mCherry （ Addgene ，目录号：164917），储存于-20 °C
4. 定制CRISPRi gRNA 寡核苷酸池，（Custom Array Inc；约 60,000 个 60 个核苷酸寡核苷酸的寡核苷酸池），储存温度- 20 °C，之前发表于McGlincy 等。 (2021)
5. 用于扩增 gRNA 池的引物（IDT，25 nmole DNA Oligo，标准脱盐），储存在 -20 °C
对于这项特定的研究，我们使用了 NM636： ggctgggaacgaaactctgggagctgcgattggca和 NM637： gccttattttaacttgctatttctagctctaaaac
6. Zymo DNA clean and concentrator-5 kit（ Zymo ，目录号：D4013）
7. Q5聚合酶（NEB，目录号：M0491L），储存在-20 °C
8. 限制酶：
a. AvrII （NEB，目录号：R0174S），储存于-20°C
b. AscI （NEB，目录号：R0558S），储存在 -20°C
c. HindIII -HF（NEB，目录号：R3104S），储存在-20°C
d. PmeI （NEB，目录号：R0560S），储存于-20°C
e. BglII （NEB，目录号：R0144S），储存于-20°C
f. XhoI （NEB，目录号：R0146S），储存于-20°C
g. BciVi （NEB，目录号：R0596S），储存于-20°C
9. HiFi DNA 组装 2 × master mix（NEB，目录号：E2621L），储存在 -20°C
10. MegaX DH10B T1R Electrocomp TM电池（Invitrogen，目录号：C640003），储存在-80 °C
11. NEB ® 10-beta Competent E.coli （高效）（NEB，目录号：C3019H ），储存在-80 °C
12. LB-羧苄青霉素琼脂平板和液体培养基（50 µg/mL 羧苄青霉素）：
a. Luria Bertani 中等胶囊（MP Biomedicals，目录号：3002031）
b. 羧苄青霉素（Gold Bio，目录号：C-103-5），储存于-20°C
c. SuperPure TM Agar Bacteriological Grade Type A（US BioTech Sources，目录号：A01PD-500）
d. 10厘米聚苯乙烯培养皿（Fisher Scientific，目录号：08-757-100D）
13. 你好快速中提试剂盒（Qiagen，目录号：12643）
14. Monarch Plasmid Miniprep Kit（NEB，目录号：T1010L）
15. T5核酸外切酶（NEB，目录号：M0663S），储存在-20°C
16. 双条形码寡核苷酸（IDT，25 nmole DNA 寡核苷酸，标准脱盐），-20°C 储存
a. RM720：CCACATGTGCATTGCCTCGGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCACGT GCTAACAGTGAGGCGCG
b. RM721: GCTCGATCCAGTCACTCTGGACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTAAGTGACTCGACTG GCGCGCCTCACTGTTAGCACGTG
17. Sanger 测序引物（IDT，25 nmole DNA Oligo，标准脱盐），-20°C 储存
a. RM377: taacatggtagttacatatactagtaatatggttcgg
b. KS533: gggaaacgcctggtatcttt
c. RM336: gttgacaatgattacaggttaaaagg

用于条形码-gRNA 分配的 PacBio 文库构建

1. 条形码 gRNA 质粒库：从本协议的“质粒库构建”部分生成，或从Addgene作为混合质粒库购买（酵母全基因组双条形码 CRISPRi gRNA 库， Addgene #166966）
2. 限制酶
a. HindIII -HF（NEB，目录号：R3104S），储存在-20°C
b. PmeI （NEB，目录号：R0560S），储存于-20°C
c. BglII （NEB，目录号：R0144S），储存于-20°C
d. XhoI （NEB，目录号：R0146S），储存于-20°C
3. 用于 DNA 大小选择和纯化的 1% 琼脂糖凝胶
a. 琼脂糖 LE（Gold Bio，目录号：A-201-500）
b. Tris-Borate-EDTA（TBE）缓冲液，10 × （National Diagnostics，目录号：EC-860）
4. Zymoclean Gel DNA Recovery Kit（ Zymo ，目录号：D4001）
5. SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0（Pacific Biosciences，目录号：100-938-900），-20°C 储存
6. AMPure XP珠子（Beckman Coulter，目录号：A63881），储存在4°C
7. 乙醇 (VWR-A #TX89125-170SFU)
8. 无核酸酶水（Fisher Scientific，目录号：UPW012548）
9. 无核酸酶微量离心管（ Ambion ，目录号：AM12450）
10. 高灵敏度 D1000 样品缓冲液（Agilent Technologies，目录号：5067-5603），储存于 4°C
11. 高灵敏度 D1000 ScreenTape （Agilent Technologies，目录号：5067-5584），在 4°C 下储存
12. High Sensitivity D1000 Ladder（Agilent Technologies，目录号：5067-5587），4°C 储存
13. 基因组 DNA试剂（Agilent Technologies，目录号： 5067-5366），储存于 4°C
14. 基因组 DNA ScreenTape （ Agilent Technologies，目录号：5067-5365），储存于 4°C

RNA条形码测序文库构建

1. Phasemaker TM管（可选）（ ThermoFisher Scientific，目录号：A33248）
2. UltraPure TM SDS 溶液，10%（ ThermoFisher Scientific，目录号：15553027）
3. 醋酸钠3 M pH 5.5（ Ambion ，目录号：AM9740）
4. EDTA 0.5 M pH 8.0（ Ambion ，目录号：AM9260G）
5. 苯酚-氯仿-异戊醇（PCA）pH 6.6（ Ambion ，目录号：AM9730），4°C储存
6. 氯仿（Fisher Chemical，目录号：C607SK-1）
7. 乙醇，100% 和 70%，稀释于无核酸酶 H 2 O (VWR-A #TX89125-170SFU)
8. GlycoBlue （ Ambion ，目录号：AM9515），储存在-20°C
9. 无核酸酶水（Fisher Scientific，目录号：UPW012548）
10. 无核酸酶微量离心管（ Ambion ，目录号：AM12450）
11. 来自文库实验的酵母沉淀，对应于至少 1,000 ×质粒文库的覆盖率（如果使用包含 240,000 个条形码 gRNA 的质粒文库，则至少 2.4 亿个细胞），在液氮中快速冷冻并储存在 -80°C。

12. Protoscript II逆转录酶试剂盒（NEB，目录号：M0368L），储存在-20°C
13. NEB-next 双标引物（NEB，目录号：E7600S），-20°C 储存
14. Primer-RM511：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGTCCAGTCTTGTTACCAGACAACC（IDT，25 nmole DNA Oligo，标准脱盐），-20°C 储存
15. Primer-RM810：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（IDT，25 nmole DNA Oligo，标准脱盐），-20°C 储存
16. Primer-RM812： GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTcCGGCGCCTACAACGTCAACATC （IDT，25 nmole DNA Oligo，标准脱盐），-20°C 储存
17. RNase A（Thermo Scientific，目录号：EN0531），储存在-20°C
18. RNase H（NEB，目录号：M0297S），储存于-20°C
19. Turbo DNase I（可选）（Invitrogen，目录号：AM2238），储存于-20°C
20. Zymo RNA clean and concentrator-25 试剂盒（可选）（ Zymo ，目录号：R1017）
21. Zymo DNA clean and concentrator-5 kit（ Zymo ，目录号：D4013）
22. Q5聚合酶（NEB，目录号：M0491L），储存在-20°C
23. AMPure XP 微珠 (#A63881)，储存于 4°C
24. 高灵敏度 D1000 样品缓冲液（Agilent Technologies，目录号：5067-5603），储存于 4°C
25. 高灵敏度 D1000 ScreenTape （Agilent Technologies，目录号：5067-5584），在 4°C 下储存
26. High Sensitivity D1000 Ladder（Agilent Technologies，目录号：5067-5587），4°C 储存
27. AE 缓冲液（见配方）

DNA条形码测序文库构建

1. 来自文库实验的酵母细胞沉淀，对应于至少 2,000 ×质粒文库的覆盖率（至少 4.8 亿个细胞，如果使用包含 240,000 个条形码 gRNA 的质粒文库），在液氮中快速冷冻，并在 -80°C 下储存。

2. Zymo酵母小量制备试剂盒（ Zymo ，目录号：D2004）
3. T7 HiScribe套件（NEB，目录号：E2040S），储存于 -20°C
4. 限制性酶
a. MfeI -HF （如果记者使用黄水晶表达盒）（NEB，目录号：R3589S），储存在-20°C
b. PvuII -HF（如果记者使用mCherry表达盒）（NEB，目录号：R3151S），储存在 -20°C
5. 如果使用定制的表达盒，请选择一种限制性内切酶，该内切酶可以线性化质粒库，而不会在 T7 聚合酶结合位点和本节材料 10 中提到的定制设计引物的退火位点之间进行切割。有关相关线性化和体外转录步骤的图表，请参见图 9 。
6. Protoscript II 逆转录试剂盒（NEB，目录号：M0368L），-20°C 储存
7. NEB-next 双标引物（NEB，目录号：E7600S），-20°C 储存
8. 引物：511DNA_IVT_RT：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT TGGTCCAGTCTTGTTACCAGACAACC（如果报告基因使用黄水晶表达盒）（IDT，25 nmole DNA Oligo，标准脱盐），储存在 -20°C
9. 底漆：546mcherIVT_RT：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT TCAAGTTGGACATCACCTCCCAC（如果报告基因使用mCherry表达盒）（IDT，25 nmole DNA Oligo，标准脱盐），储存在 -20°C
10. 对于定制的带条形码的 ORF 质粒文库，使用定制设计的引物，带有 5' 接头 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT（为 i7 NEB 添加兼容的引物位点，目录号：E7600S 双索引引物）和特定于给定 ORF 的 3' 末端，将引物对具有大约 150nt 插入序列的随机核苷酸条形码的逆转录反应。（这确保您将获得约 300 nt 长的最终双索引序列，该序列足够短，可以在 Illumina 测序仪上很好地聚集，但足够长，可以有效地从引物和引物二聚体中选择大小）
11. RNase A（ ThermoFisher ，目录号：EN0531），储存在-20°C
12. RNase H（NEB，目录号：M0297S），储存于-20°C
13. Zymo DNA clean and concentrator-5 kit（ Zymo ，目录号：D4013）
14. Zymo RNA clean and concentrator-25 kit（ Zymo ，目录号：R1017）
15. Q5聚合酶（NEB，目录号：M0491L），储存在-20°C
16. AMPure XP 微珠（目录号：A63881），4°C 储存
17. 高灵敏度 D1000 样品缓冲液（Agilent Technologies，目录号：5067-5603），储存于 4°C
18. 高灵敏度 D1000 ScreenTape （Agilent Technologies，目录号：5067-5584），在 4°C 下储存
19. High Sensitivity D1000 Ladder（Agilent Technologies，目录号：5067-5587），4°C 储存

设备

质粒文库构建

1. 分光光度计（Bio-Rad，型号： SmartSpec TM 3000）
2. 热循环仪（Bio-Rad，型号：T100 TM ）
3. ThermoMixer （Eppendorf，型号： ThermoMixer C）
4. 培养箱摇床（New Brunswick Scientific，型号： Innova TM 4080）
5. 4 L Pyrex Erlenmeyer 烧瓶（Corning，目录号：F3620-4L）
6. 14 mL聚丙烯圆底管（Corning，目录号：352059）
7. 1.5 mL 管离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5430）
8. 15 和 50 mL 锥形管离心机（ Eppendorf，型号：Centrifuge 5810R 15 amp 版本）
9. 固定式培养箱（Thermo Scientific，型号：HERATHERM 培养箱）
10. 电穿孔仪（Bio-Rad，型号：Gene Pulser ® II）

PacBio 条形码-gRNA 分配

1. NanoDrop分光光度计（Thermo Scientific，型号：NANODROP 2000 分光光度计）
2. 磁带站（Agilent Technologies，型号：2200 TapeStation ）
3. 1.5 mL 管式离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5430）
4. 凝胶电泳装置（Thermo Scientific，型号：OWL Easycast TM B1A）
5. DynaMag TM -2 Magnet，1.5 mL 管磁架（ ThermoFisher Scientific，目录号：12321D）

RNA条形码测序文库制备

1. 离心管帽夹（Benchmark Scientific，目录号：C1005-T5-LOCK）
2. 热循环仪（Bio-Rad，型号：T100 TM ）
3. ThermoMixer ( Eppendorf , 型号：ThermoMixer C)
4. TapeStation （安捷伦科技，型号：2200 TapeStation ）
5. NanoDrop （Thermo Scientific，型号：NANODROP 2000 分光光度计）
6. 1.5 mL 管离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5430）
7. 温度调节的 1.5 mL 管离心机（Eppendorf，型号： Centrifuge 5430R）

DNA 条形码测序文库制备

1. 热循环仪（Bio-Rad，型号：T100 TM ）
2. ThermoMixer （Eppendorf，型号： ThermoMixer C）
3. TapeStation （安捷伦科技，型号：2200 TapeStation ）
4. NanoDrop （Thermo Scientific，型号：NANODROP 2000 分光光度计）
5. 1.5 mL 管式离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5430）

程序

使用条形码表达记者询问遗传网络的整体工作流程如图 1 所示。提供的协议集详细说明了创建报告表达质粒库、生成长读测序库以及准备 RNA 和 DNA 条形码测序库的步骤。这些协议没有详细说明酵母文库的转化、酵母连续培养的实验装置、生成条形码到 gRNA 分配的计算步骤，或量化 RNA 和 DNA 条形码的计算步骤。这些步骤的协议和指南已在早期工作中提供如下。适用于引入质粒文库的高效醋酸锂酵母转化，先前已被描述（ Gietz 和席斯特尔，2007）。较早的出版物（ McGeachy等人，2019 年）中描述了酵母连续培养的推荐系统。所有计算管道都在之前和引入CiBER -seq 的原始出版物中进行了描述（ Myint 等人，2019；穆勒等人。 , 2020 )，源代码可在https://github.com/ingolia-lab/CiBER_seq获得。

图 1. 本协议中描述的四个子协议的概述。
红色八边形表示协议中方便的停止点。 Addgene上提供酵母条形码 gRNA 质粒库，等待内部处理 ( Addgene #166966 )。彩色框表示在四个部分中的每个部分中描述的工作流程的步骤。此协议中未描述未包含在彩色框中的工作流程步骤。

1. 质粒库建设

Addgene可应要求提供准备好的带条形码的 gRNA 质粒库（Muller等人，2020），其中包含约 60,000 个 gRNA，针对几乎所有约 6,000 个酵母蛋白编码基因和约 240,000 个条形码 - 每个 gRNA 平均约 4 个条形码.使用此库时，直接进入发散启动子插入步骤（C 部分，步骤 27），跳过 gRNA 库和条形码库插入步骤（A 和 B 部分）。该库中特定 gRNA 的详细信息先前已发表（ McGlincy 等。 , 2021)。创建自定义条形码 gRNA 库时，从本协议的开头开始质粒组装。对于由酵母RPR1启动子驱动的定制 gRNA 文库，可以使用相同的侧翼序列设计定制 gRNA 寡核苷酸库，如图 2 所示。20 个核苷酸的gRNA 靶序列两侧各有 20 个核苷酸，与目标向量。图 2 所示的侧翼序列在此处以文本格式提供，以便在定制设计中使用。
左翼序列： tctgggagctgcgattggca ；右侧序列： gttttagagctagaaatagc

图 2. CRISPR gRNA 寡核苷酸库的 PCR 扩增。
可以使用 NM636 和 NM637 放大包含以红色显示的侧翼序列的自定义 gRNA 寡核苷酸池。

A. 将 gRNA 文库组装成Addgene亲本载体 pNTI743
1. 扩增 100 pg 使用引物 NM636 和 NM637 的CRISPRi gRNA 寡核苷酸池。图 1 显示了CRISPRi寡核苷酸池的设计和 PCR 扩增后的最终扩增子。
使用 Q5 聚合酶设置两个 PCR 反应：一个使用标准缓冲液条件的 7 ×缩放 350 µL PCR 反应，以及一个使用可选 Q5 High GC Enhancer 的 50 µL PCR 反应，详见制造商协议（NEB，目录号：M0491L ）。 7倍比例的反应可以均匀分布在 7 个 PCR 管中，以确保热循环仪内的样品加热均匀。这两个 PCR 反应的扩增子将在下游步骤中混合，以减轻最终 gRNA 文库中富含 GC 的 gRNA 的丢失。每 50 μL PCR 反应使用 100 pg的CRISPRi Oligo Pool 作为模板。

热循环仪条件：
初始变性 98°C 30 秒
9个周期 98°C
58°C
72°C 10 秒
15 秒
10 秒
最终扩展 72°C 2 分钟
抓住 4–10°C

2. 根据制造商的说明（ Zymo ，目录号：D4013），使用 DNA 清洁和浓缩试剂盒纯化 PCR 反应。将使用标准缓冲液条件扩增的 PCR 产物与使用 High GC Enhancer 制备的产物分开。
3. 使用 nanodrop 分光光度计来量化纯化的 PCR 产物。以 9:1 的摩尔比混合标准和高 GC PCR 产品。使用 High-GC Enhancer 扩增的 10% PCR 产物的加入减少了最终 gRNA 文库池中高 GC 含量的向导的丢失，从而改善了 gRNA 在文库中的分布。
4. 使用制造商指定的缓冲条件，用AvrII消化 5 µg 父载体（Addgene 提供的pNTI743双条形码 gRNA 父载体）。消化4小时，以确保完全消化。使用Zymo DNA Clean & Concentrator 试剂盒纯化消化的载体。
5. 根据 HiFi DNA 组装（NEB，目录号：E2621L）制造商的说明，将 1 μg 的消化主干与步骤 3 中放大的 gRNA 库池的 12 倍摩尔过量组装在一起。将此装配反应缩放到 100 μL 的体积。在 50 ° C 下孵育 1 小时。

6. 根据 DNA Clean & Concentrator 试剂盒说明纯化组装反应，并在 12 μL 的无核酸酶水中洗脱。
7. MegaX电感受态细胞（Invitrogen，目录号：C640003）试剂盒说明设置五个电穿孔反应，直至并包括生长步骤。一瓶含有 100 µL 电感受态细胞，每次电穿孔需要 20 µL。每个 20 µL 电穿孔使用 1 µL 的柱纯化组装反应。包括所有指定的电穿孔条件和生长步骤，以最大限度地提高转化效率。预计每 20 µL 电穿孔至少有约 3000 万个转化子。旨在以至少 500倍的覆盖率覆盖给定的库，因为这将确保库具有足够的多样性，并且gRNA 的覆盖率相当均匀。
8. 记下生长物的总体积（5 mL，如果遵循 100 µL 电感受态细胞的MegaX协议），并分别铺板两个单独的稀释液，分别等于总细胞的 1:1,000,000 和 1:10,000,000，在生长物上表示LB-羧苄青霉素选择性板。稀释平板将用于计算菌落形成单位的总数，并估计文库大小和多样性。在 37°C 下孵育过夜。
9. 将剩余的生长物接种到 4-L-Erlenmeyer 烧瓶中的 500 mL 无菌 LB-羧苄青霉素选择性培养基中。
10. 在 30°C 下摇动 (250 rpm) 孵育 500 mL 液体培养物。当培养物的 OD 600达到 2 时，以 4,000 × g离心10 分钟以沉淀细胞。吸出并丢弃培养基，并在 -20°C 下冷冻大肠杆菌颗粒。

11. 计数选择性平板稀释液中的转化菌落以确定文库覆盖率。文库覆盖率 =（计数的菌落形成单位数） × （步骤 8 中使用的稀释度）。如果文库覆盖率至少为 500 × （例如，对于包含 60,000 个独特引导的文库，至少 3000 万计算的菌落形成单位），则在步骤 10 中从沉淀的大肠杆菌中提取质粒文库 DNA 。如果文库覆盖率不足，仍然可以提取质粒文库 DNA 并将其添加到重复的转化中（步骤 7 - 10），以满足文库覆盖指南。文库覆盖率是附加的，目的是确定几个合并的质粒提取物是否满足必要的覆盖率。如果合并来自不同转化的多个质粒文库提取物，则应以与其估计的文库覆盖率成比例的方式合并提取物（例如，一个具有 100 ×覆盖率的质粒文库和一个具有 400 ×覆盖率的质粒文库应以 1:4 摩尔浓度混合比率，分别）。
12. 根据制造商的说明（Qiagen，目录号：12643），使用HiSpeed Plasmid Midi Kit 从冷冻细胞颗粒中提取质粒文库 DNA。
13. 通过测序确认 gRNA 插入。根据质粒小量制备试剂盒说明，从稀释板中挑选 20 个单独的菌落，创建液体培养物并纯化质粒。使用定制测序引物 RM377 对这 20 种质粒纯化和纯化的质粒池进行 Sanger 测序。几乎所有单个菌落（20 个菌落中至少有 18 个）都应包含一个正确的 gRNA 插入，并且质粒池测序应报告 20 个“N”碱基，然后是可变 gRNA 序列后的正确定相载体序列。

B. gRNA平均约 4 个条形码
14. 退火和延伸寡核苷酸 RM720 和 RM721 以生成双条码插入。图 3 显示了寡核苷酸 RM720 和 RM721 如何相互退火。根据制造商的说明设置 8 个 50 μL 的 Q5 PCR 反应，对寡核苷酸 RM720 和 RM721 使用 0.5 μM 的最终浓度。

图 3. 双条码插入的构造。
双条码插入是通过退火和延伸两个寡核苷酸构建的。最终产品包含两个 26 随机核苷酸条形码、一个用于下游插入不同启动子的 Asc1 限制性位点和 Gibson 同源臂。

使用以下热循环仪条件：
98°C 30 秒
98°C 15 秒
[68°C 15 秒，72°C 5 秒] × 6
12°C 保持

这种不寻常的协议故意排除了六个循环中的变性步骤，以避免异源双链体的形成和条形码混合。目标是准确捕获每个条形码一次。
15. 使用 DNA Clean and Concentrator 试剂盒纯化退火和扩展的条形码 PCR 扩增子。用 13 μL 的无核酸酶水洗脱。该 PCR 产物包含带有侧翼同源臂的双 N 26条形码，如图 3 所示。
16. 确定哪些限制性内切酶将用于下游质粒文库制备、最终测序文库制备的任何体外转录反应（如果准备 DNA 条形码文库）、PacBio 文库构建以及任何其他下游操作。由于随机核苷酸条形码可能偶然包含限制性酶切位点，因此在这些下游限制性消化过程中，一些条形码将从群体中丢失。因此，使用下游工作流程中使用的任何限制性内切酶预消化双条形码 PCR 扩增子将清除您最终的双条形码文库中的限制性内切酶条形码伪影。对于这个实验设置，建议的酶是HindIII -HF 、 PmeI 、 BglII和XhoI （用于下游长读长 PacBio 测序文库制备）和MfeI -HF或PvuII -HF （用于在体外线性化质粒DNA 条形码文库制备的转录步骤）。
17. 在 200 μL 反应中使用一组选定的限制性内切酶和合适的 NEB 消化缓冲液消化双条形码 PCR 扩增子，以优化选定的一组限制性内切酶的反应条件。对于使用HindIII -HF 、 PmeI 、 BglII 、 XhoI 、 MfeI -HF和PvuII -HF的消化，使用以下数量和缓冲液条件。在 37°C 下消化双条形码 PCR 扩增子 2 小时。

分量体积
10 × rCutSmart TM缓冲液 20 µL
柱纯化的双条形码 PCR 扩增子 13 µL
HindIII -HF 0.5 µL
甲基丙烯酸甲酯 0.5 µL
BglII 0.5 µL
XhoI 0.5 µL
MfeI- HF 0.5 µL
PvuII -HF 0.5 µL
无核酸酶水至 200 µL

18. 使用Zymo DNA Clean and Concentrator 试剂盒纯化消化反应。
19. AscI消化 5 μg gRNA 质粒库，在 37°C 下孵育 4 小时，以确保完全消化。使用Zymo DNA Clean and Concentrator 试剂盒纯化消化的 DNA。
20. 请参阅步骤 5 和 6，将双条形码库组装到消化的 gRNA 质粒库中。在 DNA HiFi 组装反应中，使用 12:1 摩尔比的双条形码产品与质粒骨架。
21. 使用一瓶 NEB ® 10-beta Competent E.coli （高效）C3019H 和 3 µL 步骤 20 中纯化的 DNA 组装反应进行转化。按照制造商的说明进行操作，包括在 37°C 下 1 小时的生长步骤。此步骤使用热激转化代替MegaX电感受态细胞的电穿孔，因为热激转化的转化效率较低，更便于控制文库多样性。在 LB-羧苄青霉素选择性平板上将转化产物中代表的总细胞的 1:100,000 和 1:1,000,000 分别稀释两次，并在 37 ° C下孵育。
22. 在这一步，通过将不同数量的转化产物等分到单独的烧瓶中来控制总库的多样性，如图 4 所示。用以下转化分数接种单独的烧瓶：4%、6%、8%、22%，和 44%。对于每个分数，在烧瓶中添加比例量的 LB-卡比西林液体介质，每 1 mL 的转化产物添加 500 mL 介质。因此，例如，将 20 mL 介质添加到 4% 接种（40 μL 的 1 mL 生长）。在 30 ° C下以 250 rpm 的速度摇动培养瓶，直到培养物达到接近 2的 OD 600 。

图 4. 在双条码插入步骤中控制总库大小。
可变文库覆盖率的转化产物部分用于获得目标文库大小，该文库大小覆盖每个 gRNA，平均有四个条形码。合并生长部分以达到所需的文库大小。只要目标库大小小于全套生长部分中独特质粒的总数，此处描述的策略就可以将选定的库大小控制在 2% 以内。

23. 使用步骤 21 中的稀释板来估计总菌落形成单位的数量，从而估计每个烧瓶中代表的独特质粒的总数。例如，表明转化产物中有 200 万个总转化子的稀释铺板意味着 4% 级分烧瓶包含 80,000 个质粒。相应地确定所需的总库多样性和池分数。对于包含 60,000 个独特 gRNA 的质粒库，建议每个 gRNA 平均使用四个条形码，以便为每个 gRNA 提供足够数量的条形码测量复制，同时仍保持可管理的总库大小。在指示 200 万个总转化子的示例中，将 4% 分数瓶（80,000 个条形码 gRNA 质粒）和 8% 分数瓶（160,000 个条形码 gRNA 质粒）组合达到 240,000 个条形码 gRNA 质粒的目标。通过在 4,000 x g下离心10 分钟来收获汇集的液体培养物。丢弃培养基并在-80 ° C下冷冻大肠杆菌颗粒。
24. 根据制造商的说明（Qiagen，目录号：12643），使用HiSpeed Plasmid Midi Kit从细胞沉淀中提取质粒文库 DNA 。
25. 对双条码插入进行排序，包括从一个稀释板收集的约 20 个单独菌落，以及整个提取的质粒池。 20 个独立菌落中至少有 18 个应包含正确的双条形码插入，并且批量质粒测序应在每个双条形码注释处报告 26 个“N”碱基，然后是条形码序列后的正确定相载体序列。使用引物 KS533 对双条码区域进行排序。
26. 有关准备 PacBio 测序库以将条形码分配给 gRNA 的详细信息，请参阅“条形码到 gRNA 分配”协议。质粒文库的设计方式使得可以模块化插入不同的启动子，并且可以为每个不同的启动子质粒文库使用相同的条形码-gRNA分配。

C. 将发散启动子报告基因插入条形码 gRNA 质粒库
27. AscI位点两侧的条形码 gRNA 文库相匹配（在双条形码之间）。这可以通过 PCR 扩增或模板质粒的限制性消化来完成。用于此目的的 P(PGK1)-P(HIS4) 发散启动子模板质粒可在Addgene （质粒，目录号：164917，pNTI757 P[PGK1]-citrine P[HIS4]-mCherry ）上获得，用BciVi消化将产生每个末端都包含必要的 Gibson 同源臂的片段（图 5A）。 pNTI757 中每个启动子两侧的限制酶位点有助于在其他感兴趣的调节 DNA 序列中进行克隆。如果计划使用BciVI限制性消化来生成 DNA 片段插入，则调节序列不应包含BciVI切割位点。如果通过 PCR 扩增插入片段，请确保反应产生预期大小的一条带。如果它们具有相同的 Gibson 同源臂，则引物二聚体或较短产物的 PCR 扩增仍然可以插入。作为可选的附加考虑，DNA 片段可以在每个末端包含一个 5-nt 标识符，位于 3 ' UTR 条形码的上游，在TruSeq接头序列的 50 个核苷酸内。这允许在同一个汇集实验中分析多个报告库。使用不同的核苷酸标识符，单端读取可以通过 26-nt 条形码以及 5-nt 报告 ID 进行测序。
28. AscI切入两个 26 nt 随机核苷酸条形码之间，这样插入的发散启动子将分别驱动每个条形码的表达。根据制造商的说明，用AscI消化 5 μg 条形码 gRNA 库池，并进行两个修改：缩放反应以适应 5 μg 质粒，并将消化时间增加到 3 小时，以确保完全消化。 AscI酶切后，加入0.2单位T5核酸外切酶（NEB，目录号：M0663S），30 ℃酶切20分钟。 AscI和 T5 方便地使用相同的缓冲条件，因此可以将 T5 酶直接添加到消化反应中。 T5 核酸外切酶咀嚼AscI留下的突出端并防止 DNA 组装反应过程中的重新连接。使用Zymo DNA 清洁和浓缩试剂盒清洁和浓缩主干。
29. 根据制造商关于 HiFi DNA 组装的说明（NEB，目录号：E2621L），将步骤 27 中准备好的发散报告插入物组装到步骤 28 中的 1 μg 消化主干中。使用 5 ×摩尔比的插入物与骨架。将 DNA 组装缩放到 50 μL 反应。不要用标准的 Gibson 预混液代替，因为这会降低所需 DNA 组装的效率。在 50 ° C 下孵育 1 小时。
30. 使用Zymo DNA 清洁和浓缩试剂盒清洁和浓缩 DNA 组装反应。在 6 μL 的无核酸酶水中洗脱，以最大限度地提高浓度。
31. 请参阅步骤 7-12 以电穿孔 DNA 组装反应并从液体培养物中纯化最终的质粒库。
32. 对来自稀释板的约 20 个单独菌落的集合以及整个提取的质粒库中的不同启动子插入进行测序。 20 个单独的菌落中至少有 17 个应包含不同的启动子插入，并且批量质粒测序应在每个双条形码注释处报告 26 个“N”碱基，然后是条形码序列后的适当定相载体序列。使用引物 KS533 和 RM336 在每一端对不同的启动子插入进行排序。质粒序列应与图 5B 所示的设计相匹配。该质粒文库可用于酵母表达 dCas9-Mxi1 的文库实验（Muller等人， 2020）。

图 5. 最终质粒库的组装和布局。
pNTI 757中提到的条形码 gRNA 质粒库示意图，该模板用于不同的记者。注意到限制位点允许从pNTI 757 切割不同的启动子并通过 Gibson 组装插入到带条形码的 gRNA 质粒库中。 B) 最终报告质粒库的示意图。发散的启动子驱动荧光蛋白（ mCherry或 Citrine）和嵌入 3 ' UTR 的 26-nt 条形码的表达。侧翼TruSeq序列有助于下游测序应用量化条形码表达。

2. PacBio 图书馆准备

1. 因为 PCR 扩增会引入人工产物和 PCR 介导的交换，所以通过对带条形码的 gRNA 质粒库进行限制性消化来生成带条形码的 gRNA DNA 片段。对于在 pNTI743 主干中构建的库，根据制造商的限制消化协议，用HindIII - HF 和PmeI消化 5 μg双条形码 gRNA 质粒库。根据制造商的协议，分别用限制酶BglII和XhoI消化 5 μg双条形码 gRNA 质粒库。在质粒文库构建过程中，双条形码序列用HindIII -HF 、 PmeI 、 BglII和XhoI预消化，以避免包含至少一个这些限制位点的随机条形码丢失。（有关条形码预消化的更多详细信息，请参阅“质粒库构建”协议）。然而，gRNA 文库仍然包含可以被这些限制性内切酶消化的序列。因此，两组单独的限制性酶确保几乎所有 gRNA 序列都可以在至少一个限制性消化组中恢复。
2. 在 1% 琼脂糖 TBE 凝胶的单独通道上运行两个限制性消化反应。忽略以 4,080 bp 运行的主干 DNA 片段，并为每个车道提取 ~1,200-bp 片段，该片段对应于包含双条形码和 gRNA 的消化片段。根据制造商的说明，使用Zymoclean凝胶 DNA 恢复试剂盒（ Zymo ，目录号：D4001）从凝胶片中提取 DNA 片段。在 12 μL 的无核酸酶水中洗脱。
3. 通过将 1.5 μL 的样品放在 nanodrop分光光度计上来量化两个纯化 DNA 片段的浓度。等摩尔混合两个样品。使用 1,000 ng 的等摩尔混合物作为哑铃适配器结扎反应的输入。保存 50 ng 每个凝胶纯化的片段，以便在步骤 5 中通过TapeStation进行下游片段分析。按照制造商的说明使用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0 (#100-938-900) 执行哑铃接头连接。本研究使用了版本 02 部件号 101-791-800（2020 年 4 月）协议。多步骤试剂盒方案将执行 DNA 损伤修复、DNA 末端修复和 A 加尾以及哑铃接头连接反应。
4. Ampure XP 微珠结合核酸的大小范围由微珠比例决定。使用Ampure XP 珠粒大小选择来纯化测序文库，并去除未连接的哑铃接头。遵循Ampure XP 微珠制造商的说明，该说明可在SPRIselect用户指南 B24965AA 版本中找到。 Ampure XP/SPRI-select 文档推荐使用0.6 ×珠比的左侧大小选择，以从免费接头 (<100bp) 中纯化测序文库 (>1,000bp)。在无核酸酶水中进行最终洗脱。
5. TapeStation对步骤 3 中的输入对照和步骤 4 中的 PacBio 文库执行 DNA 片段分析。低于 1000 bp 的片段大小应使用高灵敏度 D1000 ScreenTape进行分析。应使用Denomic DNA ScreenTape分析超过 1,000 bp 的片段。有关分步说明，请参阅相应的安捷伦ScreenTape快速指南。样品需要稀释到快速指南中指定的建议线性范围内的浓度。将步骤 4 中的 PacBio 文库与步骤 3 中保存的两个输入对照进行比较。输入文库和最终文库之间约 150 bp 的峰值偏移表明哑铃接头连接，如图 6 所示。样本已准备好使用 Sequel II 进行测序系统。有关测序的更多详细信息，请参阅 PacBio 文档。

图 6. 输入文库和组装的 PacBio 文库的片段分析。
ScreenTape分析显示的示例库。输入库以 1,208bp 运行，并在哑铃接头连接后显示上移至 1,382bp。

3. 表达 RNA 条形码库的制备

RNA提取：

1. 将 Thermomixer 置于通风橱中并设置为 65 ° C。
2. 将微量离心机冷却至 4 ° C（所有离心步骤应在 4 ° C 下进行）。
3. 准备 10 mL 的 AE 缓冲液（有关详细信息，请参阅食谱部分）。
4. 在冰上解冻冷冻的酵母颗粒。每个颗粒应含有约 250–5 亿个酵母细胞，对应于 25–50 mL 在 OD = 1 时旋转下来的单倍体酵母（在 OD 600 = 10 7 个细胞处的 1 mL 单倍体酵母）。这足以覆盖至少 1,000 ×覆盖率的 240,000 个条形码指南库。

5. 将颗粒细胞重新悬浮在 400 μL的 AE 缓冲液中，然后转移到 1.5 mL 的无 RNase 微量离心管中。
6. 加入 40 μL 10% SDS 和 400 μL苯酚-氯仿-异戊醇（PCA）（ Ambion ，目录号：AM9730）。将caplock夹放在管子上。快速涡旋混合物，然后将试管放入设置在 65 ° C的热混合器中。
7. 在 2,000 rpm 的温度混合器上在 65 ° C 下孵育细胞 15 分钟。
8. 从热混合器中取出，在冰上孵育细胞 5 分钟，同时盖锁夹仍然打开。
9. 中以 20,000 × g在 4°C 下将样品离心 5 分钟。离心后，有机相将与水相分离。 RNA 将在上层水相中。
10. 使用移液器将顶部水相转移到单独的无 RNase 管中。避免转移任何界面，即顶部水相和底部有机相之间的白色层。中间相含有 DNA，会干扰下游文库制备步骤。优选获得较少的水相而不是用来自界面的DNA污染回收的材料。丢弃较低的有机相。
11. 在该顶部（水）相中加入 400 μL的氯仿。摇动 10 s 混合。该步骤从水相中除去溶于水的有机溶剂。再次以 20,000 × g和 4°C 离心 5 分钟。
12. 加入 400 μL氯仿并再次摇动。最后一次以 20,000 × g和 4°C 离心 5 分钟。
13. 小心地将顶部水相转移到新的 1.5 mL 微量离心管中，并通过微量移液器量化体积。

RNA沉淀：
14. 加入 50 μL的 3 M NaOAc 、pH 5.2 和 1 μL 的Glycoblue 。
15. 计算添加到水相时达到 70% 乙醇最终浓度所需的 100% 乙醇体积。不要过度填充管子。如果所需的体积超过了试管的大小，则在添加乙醇之前将水相分散到多个试管中。确保盖子适合，然后通过颠倒数次充分混合。在此浓度下，RNA 应该很容易沉淀，因此不需要冷却乙醇（如果需要，这是一个很好的停止点；RNA 可以在 -20 ° C 的乙醇中储存过夜）。
16. 在 4°C 下以 20,000 × g离心 10 分钟。您应该在试管底部获得一个 RNA 沉淀。颗粒应该大部分是白色的，来自GlycoBlue的一些浅蓝色。由于这种 RNA 提取的规模，您应该有一个相当大的颗粒，大致相当于 10–15 μL水的大小。
17. 吸出乙醇并用 70% 乙醇冲洗颗粒。在 4°C 下以 20,000 × g离心 5 分钟。
18. 移去 70% 乙醇洗涤液。以 20,000 × g离心30 秒，收集管底部残留的乙醇洗涤液，使用较小的吸头尺寸将残留的乙醇从 RNA 颗粒中吸走。打开管子并将它们横向放在架子上，以防止碎屑落入。让颗粒在室温下风干，大约需要 15 分钟。不要将颗粒干燥超过 1小时，因为这会导致过度干燥。在进行 RNA 再悬浮之前，确认所有残留的乙醇都从颗粒中消失。

RNA重悬：
19. 将颗粒重新悬浮在 100 μL的无核酸酶 H 2 O 中。涡旋或用移液器研磨直至完全溶解。 RNA 溶解可能需要一些时间，因此请耐心等待，将 RNA 保持在冰上。仔细检查样品以确保没有透明的 RNA 沉淀块。
提示：在此步骤后将 RNA 溶液冷冻一次有助于使溶液均质化。
20. 一旦颗粒完全重新溶解，进行 Nanodrop 测量以量化 RNA。如果 RNA 是纯的，A260:A280 的比例应该是 1.8–2.2，A 260 :A 230的比例应该在 2 以上，A 280永远不能高于 A 260的值；否则，有潜在的苯酚污染。
21. 将 RNA 储存在 -80 ° C 的 H 2 O 中。它应该可以稳定数年。

条形码 RNA 测序文库的制备
该协议专门设计用于从用双条形码表达盒 gRNA 文库转化的酵母中制备 RNA 测序文库，例如Muller等人使用的双黄水晶/ mCherry表达盒。（2020 年）。该质粒构建有用于两个不同表达盒的 5-nt 标识符，以允许在单个实验中汇集多个酵母菌株和/或文库。不使用 citrine 或mCherry的表达盒将需要此协议中未提供的自定义引物来添加TruSeq适配器。如图 7 所示，TruSeq R2 定制引物应在 26-nt 条形码上游大约 300 个核苷酸处与所选盒退火，并包括TruSeq R2突出端。

图 7. 从表达的条形码制备测序文库的实验工作流程。表达的条形码通过 PCR 进行逆转录和扩增，以引入必要的接头和TruSeq序列以进行高通量测序。

22. 在冰上解冻提取的 RNA。
23. 根据制造商的说明使用 Turbo DNase I 处理 20 µg RNA，并使用Zymo RNA 清洁和浓缩试剂盒纯化 RNA。在 30 μL 的无核酸酶水中洗脱 RNA。量化 RNA 浓度，应约为 500 ng/µL。
24. 根据Protoscript II 制造商的协议，为每个样品逆转录4 µg 纯化RNA 。（这将是一个 4倍缩放的 80 µL 逆转录反应，因为该协议建议每 20 µL 反应 1 µg RNA）。用 oligo dT启动逆转录反应。
25. 在逆转录反应的热变性步骤之后，将 0.5 µL RNase A 和 0.5 µL RNase H 直接加入到 80 µL 逆转录反应中，并在 37 ° C 下孵育 1 h。（这对于去除未逆转录的 RNA 很重要，例如 rRNA 和 tRNA，因为它们会与柱结合竞争。）根据制造商的说明，使用Zymo DNA 清洁和浓缩试剂盒纯化逆转录的 DNA ，使用 ssDNA 7:1 比例的结合缓冲液。在 13 μL 的无核酸酶水中洗脱。
26. 根据制造商的说明，使用 Q5 聚合酶设置 50 μL PCR 反应，以在 cDNA 模板上放大约 300-nt 的一段，包含表达的条形码。此步骤为下游库准备添加 i7 退火站点。使用标准 Q5 缓冲条件，无需额外的高 GC 增强剂。使用六个延伸循环以避免 PCR 过度扩增，并将步骤 25 中纯化的逆转录产物的一半用作模板。如有必要，保存另一半柱纯化的逆转录产物以重复该过程。使用引物 RM511 和 RM810 扩增由 citrine 表达盒表达的条形码（退火温度 70 ° C）。设置单独的50 µL PCR 反应，使用引物 RM812 和 RM810，以扩增mCherry表达盒表达的条形码（退火温度为 68 ° C）。在 72 ° C 下使用延长10 秒。

热循环仪条件：
初始变性 98°C 30 秒
6个周期 98°C
68°C 或 70°C
72°C 10 秒
15 秒
10 秒
最终扩展 72°C 2 分钟
抓住 4–10°C

27. 根据Zymo DNA 清洁和浓缩试剂盒说明对 PCR 产物进行柱纯化，并在 13 µL 无核酸酶水中洗脱。
28. 纯化的 PCR 产物现在具有引物退火位点，允许随后使用 NEB i5/i7 双索引引物（NEB，目录号：E7600S）进行 PCR 扩增。为每个样品分配唯一的双索引引物对，确保选择一组与混合测序兼容的双索引引物，并允许通过适配器序列分离样品。有关详细信息，请参阅双索引引物手册。根据制造商的说明，使用 Q5 聚合酶设置 50 μL PCR 反应，将步骤 27 中的一半柱纯化产物作为模板。如有必要，留出另一半柱纯化产品以重复该过程。使用标准 Q5 缓冲条件，无需额外的高 GC 增强剂。使用 72 ° C 的退火温度和 10 秒的延伸时间。旨在减少 PCR 循环数，以避免 PCR 产物过度扩增。对于高表达的基因，比如那些由PGK1启动子驱动的基因，8-10 个循环就足够了，但低表达的转录本可能需要更多的循环。可以通过确定其相对于PGK1 mRNA 转录物的丰度来估计给定转录物的适当循环数。例如，以PGK1 mRNA丰度的1/16 表达的转录本应再扩增四个循环（2 4 = 16），总共 12-14 个循环。

热循环仪条件：
初始变性 98°C 30 秒
8–14 个周期 98°C
72°C
72°C 10 秒
15 秒
10 秒
最终扩展 72°C 2 分钟
抓住 4–10°C

29. 根据Zymo DNA 清洁和浓缩试剂盒说明对 PCR 产物进行柱纯化，并在 13 µL 无核酸酶水中洗脱。
30. 在 Tape Station/Bioanalyzer 上对 PCR 产物进行 1:10 稀释，以确定每个扩增条码库的浓度和大小。预期扩增子大小的一个尖峰约为 330bp，表明样品制备成功。以高分子量运行的附加峰可能表明过度扩增，因为在不匹配的条形码序列处熔化和重新退火形成气泡的扩增子往往在 Tape Station 上运行较慢（图 8）。该过度放大峰应小于约 330bp 峰的摩尔浓度的 10%。使用步骤 27 中保存的剩余 PCR 产物作为模板，可以通过减少 PCR 循环次数并重复步骤 28 和 29 来重新制备过度扩增的样品。样品中的游离引物和引物二聚体应使用AMPure XP 大小选择或类似的大小选择策略去除，因为它们会影响下游测序的质量。

图 8. RNA 条形码库的片段分析。
最终的条形码测序库在TapeStation示例中以 359 bp 运行。 534 bp 处的峰值代表条形码文库 PCR 扩增子已熔化并重新退火至不匹配的条形码。不匹配的双链在TapeStation上以更高的分子量运行。

31. 成功制备的样本可以合并并提交给HiSeq或NovaSeq 。条码文库的测序深度应至少为每个样本每个条码 100 个序列读数。例如，一个跨越四个样本的实验，每个样本包含 240,000 个条形码，应至少使用 9600 万次读取进行测序。

4. 从酵母颗粒制备 DNA 文库

1. 在冰上解冻冷冻、颗粒状的酵母文库样品。收获、沉淀和冷冻（在-80 ° C）额外的酵母是很好的，这样您就可以重复文库制备，以防过程失败。作为参考，1 mL OD 600为 1的单倍体酵母对应于 10 7 个细胞，因此来自 50 mL OD 600为 1 的培养物的沉淀包含大约 5 亿个细胞。这样一个 5 亿个细胞沉淀应该覆盖一个包含 240,000 个条形码的文库，每个条形码大约有 2,000 个细胞。请注意，酵母微量制备的产量可能很低，因此在质粒回收效率低下的情况下，以 5 亿个细胞为目标仍应提供足够的覆盖率。
2. 根据制造商从酵母液体培养物中提取质粒的说明执行Zymo酵母小量制备，并进行以下协议调整。将颗粒重新悬浮在 1 mL 的溶液 1（消化缓冲液）中，并加入 30 μL 的酶解酶。消化 3 小时并在 900 rpm 的温度混合器中混合，以确保有效的质粒提取。将溶液 2 和溶液 3 的体积放大5 倍，以匹配溶液 1 的 5倍规模。分布在多个微量离心管中，因此可以将整个反应离心，然后将每个管中的上清液依次通过同一列。为了最大限度地提高 DNA 回收率，请使用 20 μL 加热至 37 ° C的无核酸酶水进行最终质粒洗脱。
3. 用MfeI -HF （如果在您的文库中使用 citrine 表达盒）、 PvuII -HF（如果在您的文库中使用mCherry表达盒）或适当的限制酶（如果使用自定义表达盒）消化所有提取的质粒，以线性化质粒。如果使用自定义表达盒，请选择不会在嵌入的 T7 启动子和TruSeq R2 引物的退火位点之间切入的限制性内切酶，如图 9 所示。执行 3 小时消化以确保完全消化。根据制造商的说明，使用Zymo DNA 清洁和浓缩器纯化消化的 DNA ，并使用 20 µL 加热至 37 ° C 的无核酸酶水洗脱，以最大限度地提高 DNA 回收率。

图 9. 从提取的质粒制备条形码测序文库的实验工作流程。
测序文库通过线性化提取的质粒、体外转录条形码、逆转录体外转录产物和 PCR 扩增制备的 cDNA 来制备，以添加必要的接头和TruSeq位点用于下游测序应用。

4. 根据制造商对小长度产物的建议（30 µL 反应，短转录本，在 37ºC 过夜），使用 T7 HiScribe试剂盒进行体外转录 (IVT) 反应。在培养箱中在 37 ° C 下孵育反应，以防止盖子顶部的蒸发/冷凝。

使用以下数量的试剂。
试剂量
NTP 缓冲液混合物 10 µL
纯化质粒消化 18 µL
T7 RNA 聚合酶混合物 2 µL
总计 30 µL

5. 使用 T7 HiScribe建议的 DNase I 处理去除模板 DNA。从试剂盒中加入 18 µL 无核酸酶水和 2 µL DNase I，在 37 ° C 下消化 15 分钟。根据制造商的说明，使用Zymo RNA 清洁和浓缩试剂盒（ Zymo ，目录号：R1017）纯化 RNA。
6. Protoscript II（NEB，目录号：M0368L）制造商的协议，通过 Nanodrop量化体外转录的 RNA，并逆转录 2 μg 的 IVT 产品。这将是一个 2倍规模的逆转录反应，因为该协议建议每个反应 1 µg RNA。使用与您的质粒库相对应的引物（511 DNA_IVT_RT 用于 citrine 表达盒，546 mcher IVT_RT 用于mCherry表达盒，或自定义引物）进行 RT 反应。该引物为下游文库制备添加了 i7 退火位点。质粒已包含与随机核苷酸条形码相邻的 i5 ( TruSeq R1) 引发序列。

7. 在逆转录热变性步骤之后，将 0.5 μL RNase A 和 0.5 μL RNase H 添加到逆转录反应中。在 37 ° C 下孵育 1 小时。根据制造商的 ssDNA 纯化说明（ Zymo ，目录号：D4013），使用 DNA Clean & Concentrator-5 纯化 cDNA，结合缓冲液与样品的比例为 7:1 。
8. 纯化的 cDNA 现在包含使用 NEB i5/i7 双索引引物进行扩增所需的两个序列。为每个样本分配不同的引物对，确保选择一组与合并测序兼容的双索引引物，并允许根据其 i5/i7 适配器序列分离样本。有关详细信息，请参阅双索引引物手册。根据制造商的说明，使用步骤 7 中的一半柱纯化产物作为模板和 NEB i5/i7 双索引引物进行 Q5 PCR 扩增。保存另一半柱纯化产物以在必要时重复扩增。使用 72°C 的退火温度和 10 秒的延伸。尽量减少扩增循环数，以避免 PCR 产物过度扩增——理想情况下为 6-10 个循环，但如果产量不足，可能需要更多循环）。
9. 根据Zymo DNA 清洁和浓缩试剂盒说明对 PCR 产物进行柱纯化，并在 13 µL 无核酸酶水中洗脱。
10. 在 Tape Station 或 Bioanalyzer 上对步骤 9 中的扩增库样本进行 1:10 稀释，以确定每个扩增条码库的浓度和大小。有关评估库质量的详细信息，请参阅 RNA 库准备协议的第 30 步。有关条形码库的TapeStation示例，请参阅图 8 。
11. 样本可以在 Illumina HiSeq或NovaSeq上汇集和测序。条码文库的测序深度应至少为每个样本每个条码 100 个序列读数。例如，一个跨越四个样本的实验，每个样本包含 240,000 个条形码，应至少使用 9600 万次读取进行测序。

食谱

1. 自动曝光缓冲
试剂 10 毫升的数量最终浓度
乙酸钠 ( NaOAc ; 3 M pH5.5) 0.167 毫升 50毫米
EDTA (O.5M, pH 8.0) 0.2 毫升 10毫米
无核酸酶 H 2 O 9.63 毫升

致谢

这项工作由 NIH 赠款 DP2 CA195768、R01 GM130996 和 R01 GM135233 资助。这项工作使用了加州大学伯克利分校的 Vincent J. Coates 基因组学测序实验室，得到了 NIH S10 OD018174 仪器拨款的支持。这些协议集源自 Muller等人。（2020 年）。所有源代码均可在https://github.com/ingolia-lab/CiBER_seq获得并在Zenodo存档d doi ：10.5281/zenodo.4035711。质粒已通过Addgene提供，质粒库将在等待内部AddGene处理之前提供。

利益争夺

作者报告没有竞争的财务或非财务利益。

参考

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