材料和试剂
带盖的无菌白色384孔µClear平底细胞培养板（Greiner Bio-One， Kremsmünster ，Austria，目录号：781098）
带盖的无菌384孔平底测定板（Corning，NY，USA，目录号：3701）
移液器吸头 200 µL（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA，目录号：AM12650）
Eppendorf管（Sigma-Aldrich，Saint-Louis，MO，USA，目录号：T2795）
50 mL试剂容器无菌聚苯乙烯（Merck， Overijse ，Belgium，目录号：CLS4870）
HEK-293T hACE2（ Invivogen ，San Diego，CA，USA，目录号：HKB-hACE2）
SARS-CoV-2 Pseudoviral Particles（E-enzyme，Gaithersburg，MD，USA，目录号：SCV2-PsV-001）
Dulbecco's Modified Eagle培养基（DMEM），含有L-谷氨酰胺和葡萄糖（Lonza， Bâle ，Switzerland，目录号：LO BE12-604F）
FireFly萤光素酶试剂盒（E-enzyme，Gaithersburg，MD，USA，目录号：CA-L165-10）
色氨酸蓝（Invitrogen by Thermo Fisher Scientific， Waltham，MA，USA，目录号：T10282）

设备

Spectramax 3 iD（ Molecular Devices, LLC, CA, USA ）
层流罩（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA，MSC Advantage 1.8 目录号：51025413 ）
电子多通道 5–125 µL 移液器（品牌， Transferpette -12 electronic，目录号：705453）
单通道 5–50 µL 移液器（Socorex，Ecubens，瑞士，目录号：825.0050）
Centrifuge 5702（Eppendorf，Hamburg，Deutschland，目录号：5702000320）
Neubauer 计数玻片（Hecht Assistant， Altnau ， Switzeland ，目录号：40441）
Julobo ED水浴（Sigma Aldrich，Saint-Louis，MO，USA，目录号：Z615498）

软件

GraphPad Prism 软件（版本 9.1.0，San Diego，CA，USA）

程序

在 384 孔板上接种细胞

为了确定所需的细胞悬液量，必须进行这种类型的计算：
在 384 孔板的每个孔中接种15 μ L体积为± 8.5 × 10 3 个细胞的细胞悬液。要制备的细胞悬液量为 15 µL × 384 × X，其中 X 是要制备的板数。
要制备这种细胞悬浮液，在计数和离心后，添加每微升 566 个细胞所需的体积。
为了准备计数幻灯片，板条用水粘在幻灯片上。
在Eppendorf中，加入 50 μL 的细胞溶液放入孔中，并加入 50 μL 的台盼蓝。混合。
将 10 μL 的这种混合物放在计数幻灯片的每个部分。在显微镜下，正方形内的活细胞被计数。活细胞呈透明状，死细胞呈蓝色。
要计算每毫升的细胞数，必须使用以下公式，其中 n 是使用 Neubauer 计数玻片计数的细胞数。

Cells/ml=(n × 10 000)/((4×1)/2)

新的细胞悬液保存在苏格兰威士忌瓶中，并以中等功率持续搅拌。然后使用电子多通道微量移液器以每孔 15 µL 的体积将细胞悬液填充到 384 孔板中。
-传代次数-操作员姓名首字母”对板进行注释，并在校准的烘箱中在 37°C下孵育 24 小时以进行细胞培养。

血清稀释

在 56°C 的水浴中加热灭活血清 30 分钟。
26 份血清可在 384 孔板上稀释。稀释是在线进行的，从 1:2 稀释开始，直至 1:5120 稀释。如果需要进一步稀释，则应使用第二个 384 孔板。
在进行血清稀释之前，每孔必须填充 30 µL 稀释培养基（DMEM + 10% HyClone FetalClone Serum）使用电子多通道微量移液器，第 2 列和第 12 列除外，它们填充了 50 µL。
单通道移液器 5–50 µL在第一口井中加入 10 µL 血清。然后可以开始血清的连续稀释，并进行如下：
在等分试样中冲洗 15 次。
取 30 μL 的体积并将其放入第一口井中。
在第一口井中冲洗 15 次。
更改提示以从第一口井收集液体到第二口井。
重复前面的步骤，直到连续稀释结束。
在最后一口井中，必须去除 30 μL，以便所有井包含相同的体积。
必须执行细胞控制(CC) 和病毒检查(VC)。细胞对照 (CC) 是一种将细胞与培养基一起孵育的试验。病毒检查包括在没有任何血清的情况下孵育病毒，在步骤 C.1 中，17.9 µL SARS-CoV-2-PP 必须与 7.1 µL 培养基一起孵育。
以 161 × g离心5 分钟。

抗体与假病毒颗粒之间的相互作用

稀释假病毒在培养基中3次，以获得分析所需的体积。
在 384 孔板的每个孔中，加入 17.9 μL 稀释的 SARS-CoV-2-Pseudoviral Particles 和电子多通道微量移液器，以及 7.1 μL 先前使用手动多通道微量移液器（5 μL–50 μL）执行的稀释血清。每个样品一式两份进行。对于一种稀释血清，进行两次测试。
然后将板用“操作员姓名首字母”注释并在校准的烘箱中孵育，以便在 37°C 下进行细胞培养。 2 小时。

接种到细胞上

首先，首先从含有细胞的 384 孔板中清空培养基。完成此操作后，使用手动多通道微量移液器 (5 µL–50 µL)将含有血清稀释液和病毒颗粒的板中的每列 17.5 µL 转移到细胞盘中。重复该过程，在每种血清之间更换提示。
在每口井中加入 7.5 μL 的 DMEM + 10% FC。
在 37°C下孵育42 小时。

信号测量

取出上清液，用电子多通道微量移液器将 20 μL 的eEnzyme荧光素酶检测试剂添加到每个孔中。
在发光板阅读器中阅读。发光和稀释度之间必须存在比例关系，稀释度越高，信号越高。事实上，萤光素酶可以检测受感染的细胞，抗体越多，受感染的细胞就越少。

数据分析

根据每个样品的相对光单位 (RLU) 值，可以计算抑制百分比。以下公式必须适用于每个样品的每次稀释：

Relative inhibition= □((RLU sample X-RLU negative control)/(RLU viral control-RLU cell control))

不同的抑制百分比用于绘制作为血清稀释函数的相对抑制的演变。通过对获得的 S 曲线进行内插，可以确定实现 50% 抑制的稀释度，称为 RI50 。通过统计软件获得的结果为我们提供了稀释度与 1:10 稀释度相比的对数，考虑了我们的初始条件。然后将该对数转换为所达到范围内的数值稀释。如果该样品的 RI50 值低于 1:20 稀释度，则认为该样品为阴性。预期结果的示例如图 1 所示。

与 1:10 稀释相比，作为 log 10函数的相对抑制百分比。
致谢

我们承认聂等人。 (2020b) 论文“通过基于假型病毒的检测方法对 SARS-CoV-2 中和抗体进行量化”，我们的协议源自。

利益争夺

所有作者都无需声明。

伦理

该方案符合赫尔辛基宣言，并获得了 Saint-Luc Bouge医学伦理委员会（比利时Bouge ，批准号 B0392020000005）的批准。所有受试者均获得知情同意。

参考

Lau，EHY，Tsang，OTY，Hui，DSC，Kwan，MYW，Chan，WH，Chiu，SS，Ko，RLW，Chan，KH，Cheng，SMS，Perera，R.，等。（2021 年）。中和 SARS-CoV-2 感染中的抗体滴度。国家通讯12(1): 63。
Lee，WT，Girardin，RC，Dupuis，AP，Kulas，KE，Payne，AF，Wong，SJ，Arinsburg，S.，Nguyen，FT，Mendu，DR，Firpo-Betancourt，A.，等。（2021 年）。中和 COVID-19 恢复期血清中的抗体反应。感染病杂志 223（1）：47-55 。
Muruato , AE, Fontes- Garfias , CR, Ren, P., Garcia-Blanco, MA, Menachery , VD, Xie , X. 和 Shi, PY (2020)。用于 COVID-19 诊断和疫苗评估的高通量中和抗体测定。国家通讯11（1）：4059 。
Nie , J., Li, Q., Wu, J., Zhao, C., Hao, H., Liu, H., Zhang, L., Nie , L., Qin, H., Wang, M., Lu, Q.、Li, X.、Sun, Q.、Liu, J.、Fan, C.、Huang, W.、Xu, M. 和 Wang, Y. (2020a)。 SARS-CoV-2 假病毒中和试验的建立和验证。新兴微生物感染9（1）：680-686 。
Nie , J., Li, Q., Wu, J., Zhao, C., Hao, H., Liu, H., Zhang, L., Nie , L., Qin, H., Wang, M., Lu, Q.、Li, X.、Sun, Q.、Liu, J.、Fan, C.、Huang, W.、Xu, M. 和 Wang, Y. (2020b)。通过基于假型病毒的测定法定量 SARS-CoV-2 中和抗体。国家协议15（11）：3699-3715 。
Perera ，RA， Mok ，CK，Tsang，OT， Lv ，H.，Ko，RL，Wu，NC，Yuan，M.，Leung，WS，Chan，JM， Chik ，TS，等。（2020 年）。严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 的血清学检测，2020 年 3 月。欧洲监测25(16): 2000421。