材料和试剂
1.10厘米细菌培养皿（Falcon，目录号： 351029）
2.细胞过滤器100 µm（Falcon，目录号：352360）
3.5 毫升注射器（BD，Discardit TM II 309050）
4.无菌楔形吊具（Microspec，目录号： 211738）
5.注射器（30G × ½'' 0.3 mm × 12 mm，Braun，Omnican F 9161502S）
6.1.5 mL Eppendorf Tubes（Eppendorf，目录号：T9661）
7.96孔圆底板（BRAND，目录号：781600）
8.冷冻管2 mL圆底（Simport，目录号：T311-3）
9.沙门氏菌鼠伤寒血清型 ATCC14028 (ATCC)
10.LB Broth Lennox（Roth，目录号：X964.2）
11.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Lonza，目录号： 17-515 F）
12.Agar-Agar Kobe I（Roth，目录号： 5210.3）
13.多聚甲醛（Sigma-Aldrich，福尔马林溶液，中性缓冲 10%，HT501128）
14.APC 抗小鼠 CD11b（BioLegend，目录号： 101212）
15.FITC 抗小鼠 CD45（BioLegend，目录号： 103108）
16.BV421 大鼠抗小鼠 F4/80（BD Biosciences，目录号： 565411）
17.BV510 抗小鼠 Ly6C（BioLegend，目录号： 128033）
18.PerCP-eFluor TM 710 抗小鼠 Ly6G（Invitrogen，目录号： 46-9668-82）
19.PerCP/Cyanine5.5 抗小鼠 MHCII（BioLegend，目录号： 116416）
20.BV421抗小鼠CD11c（BioLegend，目录号： 117330）
21.PE-Cyanine7抗小鼠iNOS（Invitrogen，目录号： 25-5920-80）
22.抗小鼠 ARG1（Invitrogen，目录号：17-3697-82）
23.甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
24.胎牛血清热灭活（FBS）（PAN Biotech，目录号：P30-3031）
25.乙酸（EDTA）（ Sigma-Aldrich，目录号： E9884）
26.氯化铵（ NH 4 Cl）（ Sigma-Aldrich，目录号： 254134)
27.碳酸氢钾 ( KHCO 3 ) （ Sigma-Aldrich，目录号：237205）
28.乙二胺四乙酸二钠盐（ Na 2 EDTA）（ Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
29.Triton X-100（Roth，目录号：3051.3）
30.LB-琼脂板（见食谱）
31.ACK 裂解缓冲液（参见配方）
32.FACS 缓冲液（见配方）
33.Triton 缓冲液（见配方）
34.LB琼脂板（见食谱）
35.LB培养基（见食谱）
36.4% PFA（见食谱）
37.含有 30% 甘油的 LB 培养基（参见食谱）

设备

1.培养箱37°C（ELOS Breed，目录号：B110N）
2.摇动培养箱（VWR，GFL，目录号：3031）
3.光度计（Eppendorf，BioPhotometer D30，目录号：6133000001）
4.离心机（Hettich Micro 200R，目录号：Z652113）
5.CytoFLEX S V4-B4-R2-I2 流式细胞仪（13 个检测器，4 个激光器，Beckman Coulter，目录号：C01161）
6.CASY TT 计数系统（OMNI Life Science，目录号：TT-20A-2571）

软件

1.FlowJo v10.7.0（BD Biosciences， https: //www.flowjo.com/solutions/flowjo ）
2.GraphPad Prism V8.4.1 ( https://www.graphpad.com/scientific-software/prism )

程序

A.沙门氏菌鼠伤寒血清型ATCC14028 在锥形瓶中，直到它们达到对数生长期

1.打开原始小瓶并在 1 mL 的 LB 培养基中重新水合整个颗粒。
2.通过上下移液充分混合。
3.移液器 10 μL 在 10 mL 的 LB 培养基中作为预培养。

4.将预培养物在旋转培养箱中以 200 rpm 在 37°C 下孵育过夜。
5.第二天，在锥形瓶中的 10 mL LB 培养基中吸取 50 μL 的这种过夜预培养物。
6.在 37°C 下以 200 rpm 在n 轨道摇床上孵育1-2 小时，直到 OD 600为0.5（在光度计中使用 LB 介质作为空白测量）。

B.计数活的肠沙门氏菌鼠伤寒血清型使用例如 CASY TT 计数系统

1.使用 45 µm 毛细管。
2.通过在测量单元下方放置一个装有新鲜 Casy ton 缓冲液的新 Casy 杯来测量背景。
3.选择背景测量程序（表 1）。
4.测量背景。这应该低于 30 个计数和 1 µm 大小。否则，清洗系统。
5.用 10 mL 的 Casy ton 缓冲液准备一个新的 Casy 杯，并添加 5 μL 的S。鼠伤寒溶液。
6.轻轻摇晃。
7.将样品放在测量单元下方。
8.选择测量 1 – 3 µm 的程序（表 1）。
9.措施。
10.单击下一步以获取每毫升的存活计数 = 存活S.tm /mL。
11.测量完成后，取出样品杯，加入一个新的装有 10 mL Casy ton 缓冲液的 Casy 杯。
12.最多执行五次 Casy Clean。
13.选择洗涤程序（表 1）。
14.洗涤完成后，检查背景。
15.如果背景低于30，可以关闭Casy计数系统；否则，继续洗涤。

表 1. CASY TT 计数系统程序

背景测量测量鼠伤寒沙门氏菌洗涤程序

毛细管45 µm X 轴：5 µm45 µm X 轴：3 µm45 µm X 轴：5 µm
样品量200 µL 循环：1200 µL 循环：3200 µL 循环：10
稀释1.00 × 10 02.00 × 10 31.00 × 10 0
Y轴汽车汽车汽车
评估光标1.00–4.89 µm0.75–2.93 µm0.00–5.00 µm
规范。光标0.5–4.89 µm0.3–2.93 µm0.00–5.00 µm
％计算%通过碎片：开%通过碎片：开%通过碎片：开
聚合校正汽车汽车汽车
界面Par P.Feed：开Par P.Feed：开Par P.Feed：开
打印模式手动图形：开手动图形：开手动图形：开

C.小鼠腹腔注射

使用Omnican F 注射器 (30G × ½'' (0.3 mm × 12 mm)，在 200 µL PBS 中腹膜内 (ip) 向小鼠注射 1000 个细菌。
阴性对照小鼠注射 200 µL PBS。
可在以下位置找到演示该过程的视频：小鼠腹腔内注射： https ://researchanimaltraining.com/articles/intraperitoneal-injection-in-the-mouse/ 。

D.在感染期间监测小鼠

1.体重：
应每天在同一时间测量体重，以避免因食物摄入而导致行为改变。使用可上锁的盒子和可以消毒的精密秤很重要。
2.体温：
每天在同一时间用红外线温度计测量体温。
拿起鼠标的尾巴中间，露出它的腹部。让老鼠用前爪抓住笼子的网格，这样老鼠就可以伸展上半身并露出腹部。握住扳机测量温度，注意在腹部的同一位置进行测量。
3.小鼠的一般外观：
小鼠的一般外观应每天记录两次，例如根据Lilley等人的 M-CASS 评分表。 (2015)，以及您的实验动物许可证。必须防止严重的疼痛、痛苦和痛苦。

E.脾细胞的分离

1.感染 72 小时后，分离脾脏，并用 5 mL 注射器的柱塞将器官通过 100 μm 细胞过滤器压到带有 5 mL 冷 PBS 的培养皿上。
2.以300 × g离心 4°C 5 分钟，然后用 5 mL PBS（300 × g 4°C 5 分钟），弃去上清液。
3.通过在 2 mL 的 ACK 裂解缓冲液中重新悬浮，使细胞颗粒进行红细胞裂解。
4.在 RT 孵育 2 分钟。
5.用 5 mL 的 FACS 缓冲液（300 × g 4°C 下 5 分钟）。

F.先天免疫细胞的流式细胞仪染色

所有程序均在 1.5 mL Eppendorf 管中进行。
1.细胞外染色（表 2）
a.在每个样品的 100 μL FACS 缓冲液中制备适当的抗体混合物（1：200）（表 2）。

表 2. 流式细胞术抗体——细胞外染色

抗体克隆公司目录编号表达于
CD11b APCM1/70生物传奇101212中性粒细胞、单核细胞
CD45 FITC30-F11生物传奇103108白细胞
F4/80 BV421T45-2342BD 生物科学565411巨噬细胞
Ly6C BV510HK1.4生物传奇128033单核细胞
Ly6G PerCP-eFluor TM 7101A8-Ly6g英杰公司46-9668-82中性粒细胞
MHCII PerCP/Cyanine5.5AF6-120.1生物传奇116416树突状细胞
CD11c BV421N418生物传奇117330树突状细胞

a.重悬此混合物中的细胞沉淀。
b.4°C 避光孵育 15 分钟。
c.用 1,000 μL 的 FACS 缓冲液（300 × g 4°C 下 5 分钟）。
d.在 4% 多聚甲醛 (PFA) 中重新悬浮颗粒，以固定细胞进行细胞内染色。
e.转移到 96 孔圆底板中。
f.直接在流式细胞仪中分析。
2.细胞内染色（表 3）
a.- d中的说明制备细胞外染色剂。
b.在 4% PFA 中重新悬浮颗粒。
c.在黑暗中在 4°C 下孵育 15 分钟。
d.离心并在 Triton 缓冲液中溶解沉淀。
e.充分混合并在黑暗中在室温下孵育 15 分钟。
f.在每个样品的 50 μL Triton 缓冲液中制备适当的抗体混合物（1：100）（表 3）。

表 3. 流式细胞术抗体 - 细胞内染色

抗体克隆公司目录编号表达于
iNOS PE-花青7长鑫通英杰公司25-5920-80促炎巨噬细胞
ARG1 装甲运兵车A1exF5英杰公司17-3697-82抗炎巨噬细胞

g.重悬此混合物中的细胞沉淀。
h.在 4°C 下孵育 45 分钟。
i.用 1,000 µL Triton 缓冲液（300 × g 4°C 下 5 分钟）。
j.在 4% PFA 中重新悬浮颗粒。
k.转移到 96 孔圆底板中。
l.直接在流式细胞仪中分析。

数据分析

FlowJo 软件可用于分析数据。绘制线性 FSC（前向散射）与 SSC（侧向散射）点图，并创建一个门以选择所有单元格。使用这些细胞，选择 CD45 +细胞（泛白细胞），并遵循图 1 中描述的门控策略。
在 GraphPad Prism 中执行和生成统计分析和图表。当数据呈正态分布时（使用直方图和统计工具进行评估，例如 Shapiro-Wilk 检验），通过未配对的学生 t 检验分析具有相等方差s 的样本，或通过双向 ANOVA（ F检验）进行分析。当数据不是正态分布时，可以执行 Mann-Whitney U 或秩检验的 ANOVA。

图 1. 先天免疫细胞分析的门控策略（感染小鼠 - 上图，未感染小鼠 - 下图）。
(A) 前向散射 (FSC) 对抗侧向散射 (SSC)，(B) 排除双峰，(C) 白细胞：CD45 + ，(D) 中性粒细胞：CD45 + Ly6G + CD11b + ，(E) 巨噬细胞：CD45 + CD11b - Ly6G - F4/80 + ，(F) 促炎巨噬细胞表达 iNOS，(G) 抗炎巨噬细胞表达精氨酸酶，(H) 树突状细胞：CD45 + Ly6G - CD11c + MHCII + ，(I) + (J) 单核细胞：CD45 + Ly6G - F4/80 + CD11b + ，(K) 炎症和驻留单核细胞：分别为 Ly6C高或 Ly6C低。

食谱

1.流式细胞仪缓冲器
PBS 含0.5% 热灭活 FBS
2 毫米乙二胺四乙酸

2.ACK（氯化铵-钾）裂解缓冲液
150 毫米NH 4氯
10 毫米碳酸氢钾3
0.1 mM Na 2 EDTA
pH 7.2–7.4

3.海卫一缓冲液
PBS 和 0.05%海卫 X-100

4.LB琼脂板
2% LB-肉汤
1.5% 琼脂
高压灭菌器（121°C 20 分钟），冷却，移取 15 mL 移液器到 10 cm 细菌培养皿中。
储存于 4°C。

5.LB培养基
2% LB-肉汤
高压灭菌器（121°C 20 分钟）。

6.4% PFA
将 40 μL 的 PFA 添加到 960 μL 的 PBS 中。

7.含 30% 甘油的 LB 培养基
将 300 μL 的甘油添加到 700 μL 的 LB 培养基中。

致谢

作者 GW 得到了基督教多普勒协会的资助和 FWF（EPICROSS，I-3321）的 ERA-NET 资助，NB 得到了 FWF 博士学院项目 W1253 HOROS 的支持。该协议在Nairz等人之后进行了调整和修改。（2009 年）。

利益争夺

作者声明，该研究是在没有任何可能构成潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

伦理

动物实验由奥地利联邦科学与研究部根据指令 2010/63/EU 批准。

参考

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