材料和试剂

1.微量移液器吸头（Thermo Fisher Scientific ，目录号： 11752584 [ 10 µL ]；10731194 [ 20 µL ]；16641953 [ 100 µL ]；11782584 [ 200 µL ]；11749855 [ 1,000 µL ]）
2.1.5 mL 管（Eppendorf，Dutscher，目录号：033305）
3.µ-Slide 8 孔玻璃底部（Ibidi 细胞聚焦，目录号：80827）
4.台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：T10282）
5.兔血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：16120099）
6.细胞系
a.MS5 (DSMZ ACC 441)
b.KG1 (ATCC CCL-246)
7.IMDM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：12440053）
8.HBSS，含钙和镁，不含酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：14025092）
9.L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM 25030149，目录号：15430614）
10.青霉素和链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15140122 和 15140148）
11.β-巯基乙醇（PanReac AppliChem，目录号：A1108）
12.HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15630080）
13.胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10270106）
14.丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11360070）
15.抗体：
a.抗 JAM-B：内部兔多克隆抗体，克隆 829
b.抗 JAM-C，阻断：小鼠 IgG（研发，目录号：MAB1189，克隆 208206）
c.抗 JAM-C，非阻断：内部大鼠 IgG，克隆 19H36
d.Alexa Fluor 488 缀合的抗兔 IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11008）
e.Alexa Fluor 594 缀合的抗小鼠或抗大鼠 IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号： A-11001 或 A-11006）
f.量子点655缀合的抗小鼠IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q-11021MP）
g.量子点655缀合的抗大鼠IgG（Thermo Fisher Scientific，目录号： Q-11621MP ）
16.MS5 细胞培养基（见配方）
17.KG1 细胞培养基（见配方）

设备

1.微量移液器 20、100 和 1000（Eppendorf，Thermo Fisher Scientific ， c目录号：05-403-152，型号：Research)
2.离心机（Eppendorf， Thermo Fisher Scientific，目录号：5805 000.010）
3.CO 2培养箱 Forma Scientific 3548（Labexchange，Forma Scientific，目录号：B00032422）
4.4°C冰箱
5.-80°C 冰箱
6.血细胞计数器（Ozyme，C-Chip，目录号：DHC-M01）
7.Axio Observer Z1 倒置显微镜 (Zeiss)，带37°C 恒温培养箱
8.横河转盘装置
9.491 和 561 nm 激光器（ILas2 或 Cobolt Calypso 1358, 100 mW）
10.100× α Plan Neofluar NA 1.45 油浸物镜 (Zeiss) 或同等物镜，具有高 NA
11.过滤器立方体 n°15 和 44 (Zeiss)，带有 120-W 金属卤化物灯 (X-cite) 用于目视检查
12.405/488/568/647 nm Yokogawa 四波段二向色分束器（Semrock，目录号：Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5）
13.BS 573 二向色分束器（Semrock，目录号：FF573-Di01-25x36），在两个相机之间
14.525/50 nm（绿色通道）和 641/75 nm（红色通道）发射滤光片（Semrock，目录号：FF03-525/50-25 和 FF02-641/75-25）
15.两台 Evolve 512 EMCCD 相机（Photometrics）或同等产品，例如 Prime 95B sCMOS 相机（Photometrics）

软件

1.Metamorph 软件（版本 7.4.8，Molecular Devices）
2.MTT2col 一组 MATLAB 函数和脚本，使用 Image Processing Toolbox with Statistics and Machine Learning Toolbox（任何版本）（The Mathworks）

程序

图 1. 实验概述。
( A ) 实验程序的步骤：准备、采集和数据分析。（乙）值得注意的是，可以通过多种策略来标记感兴趣的分子。

A.视频纳米镜检查前 24 小时或 48 小时制备细胞
1.通过 MS5 细胞（贴壁）：在 1-cm 2面积的 Ibidi 玻璃底孔中以 30,000 个细胞在 300-µL 培养体积中过夜。根据 DSMZ 指南，这种细胞密度允许在实验当天达到约 50% 的汇合度（约 50,000 个细胞）。值得注意的是，玻璃底孔可能需要特殊处理，例如细胞外基质涂层，以使某些细胞系正确粘附。
2.根据 ATCC 指南，以适当的培养密度（在 100,000 到 1,000,000 个细胞/mL 之间）通过 KG1 细胞（悬浮液）。
3.在 37°C 5% CO 2空气加湿培养箱中培养培养物。
如果使用其他类型的腔室，它们必须有一个玻璃底才能进行荧光成像，并且细胞数量应根据该区域进行调整。

B.MS5 细胞的免疫荧光染色（图 1）
1.根据确定的最佳浓度，在 100 μL 新鲜细胞培养基中稀释一抗和二抗。最佳抗体浓度以最小背景提供最佳染色。它是通过在滴定实验中使用一系列稀释度确定的：在补充有血清的 IMDM 中，抗 JAM-B 829 和 Alexa Fluor 488 偶联抗兔抗体（或等效物，例如量子点偶联抗体）为 10 nM ，这是饱和和限制非特异性结合所必需的。
2.从待染色的活细胞的孔中吸出培养基，然后将含有稀释抗体的培养基直接加入 100 μL 的孔中。
3.在室温下孵育细胞 10 分钟。
4.吸出上清液并用 1% HEPES 的 HBSS（或新鲜培养基——为了限制自发荧光，使用不含酚红的培养基）轻轻洗涤细胞两次。

C.KG1细胞的免疫荧光染色
1.在 100 µL新鲜细胞培养基中稀释一抗、封闭与否、二抗和二抗，抗 JAM-C 为 10 nM（封闭：小鼠 RnD 208206，非封闭：自制大鼠 19H36) 和 Alexa Fluor 594 补充 IMDM 中的缀合抗小鼠（或等效物，如量子点缀合抗体）。
2.使用血细胞计数器确定细胞总数和细胞活力百分比：将 0.4% 台盼蓝与细胞悬液以 1:1 的比例（或其他比例，使用适当的稀释因子进行计算）混合。将这两种溶液和移液器 20 μL 彻底混合到一个血细胞计室中。将血细胞计数器置于显微镜下。计算未染色（活）和染色（死）细胞（根据所用血细胞计数器的数据表）。将活细胞总数乘以 2（或适当的稀释因子，如果对台盼蓝使用不同的稀释度）。
3.移取适当的体积以获得 50,000 个细胞（低密度：多达 MS5 细胞，以在每个视野中成像一个 KG1 细胞，允许逐个细胞测量）或 500,000 个细胞（高密度：比 MS5 细胞多 10 倍，以成像每个视场有几个 KG1 单元，可以为每个视频提供更多统计信息）。
4.将细胞转移到 1.5 mL Eppendorf 管中。
5.以 88 × g短暂离心 3 分钟。
6.重悬于 1 mL 培养基中并用 10% 兔血清饱和，在 37°C的 5% CO 2培养箱中培养 60 分钟。
7.88 × g短暂离心3 分钟。
8.在含有稀释抗体的 100 μL 培养基中重新悬浮（参见步骤 1）。
9.在室温下孵育细胞 10 分钟。
10.以 88 × g短暂离心3 分钟，吸出上清液，然后用 1 mL 含 1% HEPES 的 HBSS（或不含酚红的新鲜培养基）轻轻洗涤细胞两次。用 1% HEPES 在 200 μL 的 HBSS 中重新悬浮细胞颗粒。
11.从 MS5 细胞中取出上清液，加入 200 μL 的 KG1 细胞悬浮液。
12.使用设置为 37°C 的恒温培养箱和适当的过滤器（参见设备，第 7 至 15 项）使用旋转圆盘荧光显微镜检查细胞。染色后应立即对细胞进行成像，以限制内吞作用（图 2）。

图 2. 具有代表性的视频纳米镜采集和 MTT2col 轨迹图。
(A)视频纳米镜采集的第一张图像，两种颜色组合成 RGB 图像。 MS5 细胞上的 JAM-B 染色位于绿色通道中，而 KG1 细胞上的 JAM-C 染色位于洋红色通道中。 (B)视频的最大投影。 (C) JAM-B 和 JAM-C 单分子轨迹根据时间分别由绿色和品红色梯度表示，并叠加在细胞的透射图像上（右）。插入显示白血病 KG1 细胞周围框架区域的放大图。时空共定位由白色圆圈表示，其大小与持续时间成正比。几个同心圆对应于附近位置的连续共定位事件。
有代表性的视频可以从相关文章的补充数据中看到（Gorshkova et al. , 2021）。

D.在共聚焦显微镜上进行采集
1.创建一个文件夹，通常以日期和实验的简要说明命名。
2.在传播的 MS5 细胞顶部选择一个具有 KG1 细胞的视野。
3.首先，获取允许进一步检查细胞方面和空间限制的明场图像（与所有轨迹结合使用，在图 2C 中）。
4.使用与视频相同的名称（时间堆栈）将此图像保存在名为“trans”的子文件夹中。通过这种约定，算法可以自动为每个堆栈找到匹配的明场图像。
5.接下来，采集一个（或多个）视频（时间堆栈），通常以 36 毫秒或 100 毫秒的速率。将视频文件保存在为实验创建的文件夹中，为tif或stk文件格式。对于每个视频，通常获取 300 帧（参见图 2A 示例）。视频速率和长度可以针对给定的实验进行调整。例如，实验可能需要更快的视频速率或更长的轨迹。
6.最后，可选地，在 MS5 和 KG1 单元的整个高度（通常超过 10 μm）上获取 z 堆栈。将 z 堆栈保存在名为“z”的子文件夹中。
7.根据需要多次重复步骤 2-5。细胞应在含有 1% HEPES 的 HBSS 中保存不到一小时。

数据分析

A.运行 MTT2col（图 1）（Gorshko va 等人，2021 年）
1.启动 Matlab（或 Octave，或者，至少对于 MTT）。
2.在 Matlab 环境中，导航到包含要分析的数据的文件夹（在本地驱动器或网络上）。使用 Matlab 或 Octave 评估给定数据集本质上需要选择包含视频文件的目录的路径。
3.然后，在 Matlab 中键入命令 MTT_2_colors，首先显示一个图形界面，列出所有使用的参数，然后运行全自动分析（图 3）。
4.值得注意的是，在分析单色和双色的混合数据集时，Matlab 的补充函数 MTT_1_or_2_colors 可以确定数据是否对应于一种颜色（正方形图像，例如 512 x 512 像素）、两种颜色（双正方形，意味着宽度是高度的两倍，例如 1024 x 512 像素）或任何其他可能性。如果可以确定无歧义，该函数会自动运行一种或两种颜色的分析。否则将跳过该文件。

图 3. MTT2col 图形用户界面。
图形用户界面 (GUI) 列出了用于分子检测和估计、轨迹重新连接和进一步分析的所有输入参数，以及它们的默认值（在 Matlab 函数MTT23_dialog_box MTTparams_def和MTT_param中定义）。

B.MTT2col 算法概述(Sergé et al. , 2008; Rouger et al. , 2012)
1.每个视野的输入
该程序希望使用本地路径中的以下文件和子文件夹来运行分析：
●双色时间堆栈（即左：绿色/右：洋红色）
●双色 'DIC' 图像（透射光，在名为'dic'的子文件夹中，可选但用于配准）
●双色 z 堆栈（在名为'z'的子文件夹中，可选）

2.分析
MTT2col 算法的主要功能称为 MTT_2_colors。下面是 MTT2col 中主要的 Matlab 函数和子函数的列表。关键步骤用粗体表示，变量用紫色表示，注释用绿色表示。这个完全自动化的过程允许从双色视频采集中构建轨迹（图 2），并提取几个描述符（图 4），如正文中所述。有关算法过程和输入/输出参数的详细描述，请参阅原始文章（Sergé等人，2008；Rouger等人，2012；Gorshkova等人，2021）。

MTT_2_colors % MTT 专用于 2 种颜色
默认情况下， MTT23i % with method = 'coloc'
MTT23_dialog_box, MTTparams_def, MTT_param % 用户界面列出输入参数
检测_reconnex_23 % 轨迹 (Sergé et al. , 2008; Rouger et al. , 2012)
sort_traces % 选择足够长且足够快的轨迹
ct4_by_file, ct5_by_file 峰值和轨迹描述符的百分比直方图，例如数量、长度、扩散系数
fit_directed_by_file % 对D和γ的轨迹进行排序
卡托比夫 % 映射所有文件
reg_2_colors % 从 DIC 图像计算配准，保存mean_tform.mat
traj_xy_coloc % 带有共定位的地图，记录洋红色轨迹
coloc3 % 计算从绿色到洋红色 SM 的距离
merge_colors % 洋红色/绿色堆栈和最大值。投影
detect_cell_contact % 仅在单元格接触时的统计信息
cd(zdir) % 分析 z 堆栈数据
MTT23i % 在 z 堆栈上运行 MTT
gradient_z2 % z 堆栈的z轮廓
merge_colors %

3.输出
MTT2col 为每个视频（时间堆栈或 z 堆栈）生成多个文件，放置在不同的文件夹中：
●'output23' ：此文件夹包含原始数据，作为轨迹参数矩阵。每列对应一个轨迹，行对应参数：帧数、x 和 y 位置、信号、半径、偏移量、闪烁和噪声。每组 8 行对应一个给定的帧。因此，矩阵的列数与轨迹一样多，行数是视频中帧数的 8 倍。 dat文件包含所有轨迹， mat文件针对长度和扩散系数高于输入参数列表中定义的阈值的轨迹进行过滤。参见代码检测_reconnex_23 了解更多详情（Sergé等人，2008 年）。
●'ct4_by_file'、'ct5_by_file' ：这些文件夹包含峰值和轨迹描述符 (ct4) 和轨迹形状 (ct5) 的直方图，作为每个文件和所有拉在一起的文件的png图像，以及包含表格的文本文件每个参数和文件的平均值。
●'carto' ：此文件夹包含地图，即叠加在细胞图像上的轨迹图像，保存在 'dic'文件夹（或视频的第一帧，否则）。颜色代码对应于输入参数中选择的方法：共定位（2 种颜色）、线性 (SCI)、强度、时间、相对或绝对限制水平或速度。

4. MTT2col的代表性结果。
（一）定位图（左上），z-stack的横向视图，每个单元由白色虚线（左下）分隔，JAM轴向位置的z轮廓，具有均匀重新分配的预期理论分布在一个球体上（右）。（乙）具有代表性的轨迹，说明布朗、线性或受限运动的多样性。 ( C ) 反常指数γ与反常扩散系数D γ的点图，由模拟的每个轨迹的均方位移计算得出（上）、JAM-C（中）和 JAM-B（下） .

C.数据和代码可用性
MTT 和 MTT2col 的源代码可作为开源软件在 GitHub 上下载，网址为https://github.com/arnauldserge1/MTT2col 。
arnauld.serge@univ-amu.fr )提出合理要求，支持本研究结果的数据可用于学术和非营利研究。

笔记

1.可以通过以下方式增强荧光图像的信噪比：
●增加激光功率，但避免光漂白和光损伤。
●使用明亮（以及稳定）的染料：高横截面和量子产率。
●增加采集时间，但这受到分子动力学的限制：位移（随时间增加，根据布朗运动的 r 2 = 4Dt）应保持小于像素大小以生成衍射限制信号。
●使用 EMCCD 相机时，增加增益，同时避免饱和。
2.图像中的像素大小由相机的像素大小决定，除以物镜和管透镜（optovar）的放大倍数，再乘以 binning。我们使用像素大小为 16 µm 的相机、100 倍镜头、无 optovar 和无合并，从而在图像中产生 160 nm 的像素大小。理想情况下，根据香农-奈奎斯特定理，像素大小应等于（或小于）衍射极限的一半，即0.3λ/NA（λ：荧光发射波长，NA：透镜的数值孔径）。
●太大的尺寸会导致单分子信号的采样不足（即显微镜的点扩散功能，大小由衍射设定）。
●尺寸太小会稀释相邻像素上的信号，导致信号较弱（每个像素收集的光子数量较少）。
3.科学相机可以生成 8、12、14、16 或 32 位图像（以及彩色相机的 24、36 或 48 位图像，此处不适用）。 MTT 默认用于 16 位图像。它可能用于其他格式，但要仔细检查结果。
4.一个典型的实验会生成大约数十个视频，每帧大约有数百个分子，每个视频有数百个帧。因此，要分析的数据的总规模存在很大差异。类似地，计算机处理能力至少可以改变一个数量级。值得注意的是，计算时间与视频数量以及帧的数量和大小呈线性关系，但与目标（标记分子）的密度呈指数关系，当分子越来越接近时，这导致连接可能性的计算增加对彼此。在标准计算机（例如，6–8 核、3–3.5 GHz 处理器和 16–32 Gb RAM）上对几十个视频文件运行 MTT2col 分析通常需要几个小时（例如，0.5–6 小时） .因此，一天进行的实验可以在一夜之间进行分析，第二天就可以得到结果。
5.可以使用适当的 Matlab 脚本自动执行统计测试。

食谱

1.MS5 细胞培养基
Iscove 改良 Dulbecco 培养基 (IMDM)
10% 胎牛血清
1% HEPES，必需氨基酸
1% 丙酮酸钠
25 µM β-巯基乙醇
1% L-谷氨酰胺
2.KG1 细胞培养基
Iscove 改良 Dulbecco 培养基 (IMDM)
10% 胎牛血清
1% L-谷氨酰胺

致谢

我们感谢 Jessica Chevallier (TAGC, CIML, LAI, Aix-Marseille Univ) 对手稿的批判性阅读。我们感谢 Martine Biarnes-Pelicot (LAI, Aix-Marseille Univ) 为细胞培养提供技术帮助。我们感谢 Dalia El Arawi 博士和 Laurent Limozin 博士（LAI，艾克斯-马赛大学）为显微镜设置提供技术帮助。我们感谢 Rémi Torro 和 Pierre-Henri Puech 博士（LAI，艾克斯-马赛大学）为 Github 提供技术帮助。我们还感谢 CRCM 的显微镜、细胞仪和统计研究设施，以及 Tien Tien Nguyen 为 LAI 的细胞培养设施提供的出色技术支持。
这项工作得到了癌症研究基金会（PJA 20131200238 至 AS）、马赛成像研究所以及 INSERM 和艾克斯-马赛大学的机构资助的支持。 LM 得到了 GdR Imabio（Bourse Accueil Master Interdisciplinaire）和 Ligue contre le Cancer (IP/SC/SK - 17250) 的资助。该协议最初是在 Gorshkova等人中开发的。 J细胞科学。 2021 年。

利益争夺

我们声明没有竞争利益。

参考

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