材料和试剂

1.康宁组织培养处理的培养培养皿100 × 20 mm（Merck，目录号：CLS430167）
2.移液器
3.Axygen 滤芯吸头 10 μ L、20 μ L、200 μ L、1,000 μ L（Corning，目录号：TF-1000-LRS、TF-200-LRS、TF-20-LRS、TF-10-LRS）
4.Greiner Bio-One 6孔悬浮培养板（Interpath，目录号：657185）
5.Corning TM迷你生物反应器离心管（Corning，目录号：431720）
6.Nunc 50 mL锥形无菌离心管（Thermo Fisher Scientific ，目录号：339652）
7.离心管10 mL 100 × 16 mm（Sarstedt，目录号：62.9924.284）
8.Tube Micro 1.5 mL离心机聚丙烯透明高压灭菌（Eppendorf，目录号：0030121872）
9.Nalgene TM Rapid-Flow TM无菌一次性真空过滤装置（ Thermo Fisher Scientific，目录号：564-0020）
10.人肠类器官生长培养基（Stemcell Technologies，目录号：6010）
11.Primocin（Invivogen，目录号：ant-pm-1）
12.青霉素-链霉素（10,000 U/mL）（Life Technologies，目录号：15140122）
13.Gibco TM庆大霉素（50 mg/mL）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15750078）
14.Gibco Advanced DMEM/F-12（Thermo Fisher Scientific，目录号：12634028）
15.Gibco GlutaMAX TM补充剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：35050061）
16.HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375-1KG）
17.烟酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：72340-1KG）
18.N-乙酰基-l-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A7250-1KG）
19.B-27 补充剂（50 × ）（Life Technologies，目录号：17504001）
20.N-2 补充剂（100 × ）（Life Technologies，目录号：17502001）
21.Normocin（Invivogen，目录号：ant-nr-2）
22.人重组碱性 FGF（FGF2）（Life Technologies，目录号：PHG0263）
23.人重组EGF（ Life Technologies，目录号：PHG0313）
24.Y-27632（Stemcell Technologies，目录号：72308）
25.Corning ® Matrigel ® Basement 膜基质，*不含 LDEV，10 mL（Corning，目录号：356234）
26.Dispase II（蛋白酶）（Merck，目录号：D4693-1G）
27.Gibco 胶原酶 IV（Life Technologies，目录号： 17104019）
28.TrypLE Express酶（1 × ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12604021）
29.CryoStor ® CS10（Stemcell Technologies，目录号：07930）
30.Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（Life Technologies，目录号：14040182）
31.Gibco DMEM/F12（Life Technologies，目录号：11320082）
32.Gibco DMEM/F12 + GLUTAMAX（Life Technologies，目录号：10565042）
33.乙二胺四乙酸（EDTA）（Merck，目录号：E9884）
34.二硫苏糖醇（DTT）（Merck，目录号：11583786001）
35.A83-01（Tocris Bioscience，目录号：2939）
36.SB202190（Sigma-Aldrich，目录号：S7067）
37.牛血清白蛋白（BSA）（Merck，目录号：A9418）
38.抗粘附冲洗溶液（Stemcell Technologies，目录号：07010）
39.组织培养基（见食谱）
40.EDTA 螯合缓冲液（见配方）
41.结直肠类肿瘤原代培养基（见食谱）
42.结直肠类肿瘤维持培养基（见食谱）

设备

1.生物安全柜（组织培养罩）
2.解剖钳和剪刀
3.Corning CoolCell LX 细胞冷冻容器（Biocision，型号：BCS-405）
4.台式离心机 5424（Eppendorf，型号：5424）
5.台式离心机 5810R（Eppendorf，型号：5810R）
6.明场倒置组织培养显微镜
7.HERAcell VIOS 160i CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：HEA51030287）
8.超低温冰箱（-80°C）

程序

A.人体组织样本的处理

1.手术切除后收集的组织将保存在 4 mL 的组织培养基中（参见食谱）。

2.在室温下，在含有 100 μg/mL Primocin 和 100 μg/mL庆大霉素的 10 mL PBS 中清洗正常和肿瘤组织 15 分钟。

3.在台式离心机中以 200 × g和 4 °C离心5 分钟，弃去上清液。
4.庆大霉素的冰冷 PBS ，在 200 ℃下离心 × g和 4 °C 5 分钟。

B.来自正常结肠组织的类器官的原代培养

1.在室温下将组织样本在 5 mL EDTA 螯合缓冲液（参见配方）中孵育30-60分钟。
2.将样品从 EDTA 螯合缓冲液转移到 20 mL 的冰冷 PBS 中。
3.用镊子夹住样品并用力摇晃，将结肠隐窝释放到 PBS 中（视频 1 和图 1）。

视频 1. 从切除的结肠组织中摆脱隐窝的过程。

图 1. 孤立的结肠直肠隐窝片段的代表性图像。比例尺，200 µm。

4.取出剩余的组织，在台式离心机中以 500 × g和 4 °C将隐窝悬浮液离心3 分钟，然后弃去上清液。
5.II 和 10 μMY-27632的 2 mL 新鲜制备的 DMEM/F12 中重新悬浮分离的结肠隐窝。
6.在 37 °C 下孵育5-10分钟，直到隐窝被消化成碎片。

7.使用 1,000 μL 尖端移液器 10–30 次，以帮助生成隐窝碎片。
8.台式离心机中以 500 × g离心悬浮液，然后 4 °C 3 分钟。
9.丢弃上清液，将颗粒重新悬浮在含有 10 μMY-27632 的 3 mL DMEM/F12 中。
10.台式离心机中以 500 × g离心悬浮液，然后 4 °C 3 分钟。
11.丢弃上清液并将颗粒重新悬浮在含有 10 μMY-27632的 0.3 – 5 mL 的 DMEM/F12中。
12.使用血细胞计数器（图 2）计算隐窝碎片的数量（大小约为 50 μm），并计算所需的培养基体积，如下所示：
a.12,000–24,000 个片段，每孔 3.5 mL，用于 6 孔悬浮板。
b.3,000–6,000 个片段，1.5 mL/孔，用于 24 孔悬浮板。
c.24,000–50,000 个片段在 5 mL/生物反应器管中，如图 3 所示。

图 2。在电镀前用血细胞计数器计数隐窝碎片。红色箭头表示地穴碎片。比例尺，200 µm。

图 3. 组织培养箱中生物反应器管中的类器官/类肿瘤培养物。

13.含有 5% Matrigel 和10 μMY-27632 的人类 IntestiCult 类器官生长培养基中悬浮隐窝片段，然后转移到板孔中。

14.在37 °C的 5% CO 2培养箱中孵育。
15.每两天用含有10 μMY-27632的新鲜人类 IntestiCult 类器官生长培养基更换培养基。要更换培养基，让培养板在组织培养罩中沉淀 5 分钟，然后去除上清液。在不干扰有机体的情况下去除一半的培养基（ 2-3毫升）。如有必要，倾斜板以方便去除培养基。加入 2 – 3 mL 的新鲜培养基，用 1,000 µL 吸头吹打大约 10 次，不要接触井底，以打乱有机体。当使用生物反应器管进行培养时，管子放在培养箱的架子上。每 24 小时用力摇动管子以充分混合。在培养箱中用摇床搅拌生物反应器可以通过充分的空气交换改善培养条件。

C.结直肠癌 (CRC) 组织中类肿瘤的原代培养

1.用镊子和剪刀在冰上的培养皿中将 CRC 组织切成小块。

2.将切碎的组织重新悬浮在 2 mL 新鲜制备的 DMEM/F12 中，该 DMEM/F12 含有 0.1 mg/mL Dispase II、200 U/mL 胶原酶 IV 和 10 μMY-27632。在 37 °C下消化 30-60 分钟，每 10 分钟用 1,000 µL 吸头吸管消化混合物和组织片，直到组织片可以轻松通过吸头。
3.台式离心机中以 500 × g离心悬浮液和4 °C 5分钟。

4.洗涤颗粒，在 500 时含有 10 μMY-27632 × g和4 °C 5 分钟。
5.将颗粒重新悬浮在 0.5 mL 的结肠直肠肿瘤原代培养基中（参见食谱）。
6.使用血细胞计数器计算碎片数，并计算介质体积，如下所示：
a.12,000–24,000 个片段，每孔 3.5 mL，用于 6 孔悬浮板。
b.3,000–6,000 个片段，1.5 mL/孔，用于 24 孔悬浮板。
c.24,000–50,000 个片段在 5 mL/生物反应器管中。
7.含有 5% Matrigel 和10 μMY-27632 的结肠直肠肿瘤样原代培养基（参见食谱）中悬浮隐窝片段。转移到板孔。

8.在37 °C的 5% CO 2培养箱中孵育。
9.每两天用含有10 μMY-27632的新鲜结肠直肠肿瘤原代培养基更换培养基。要更换培养基，让培养板在组织培养罩中沉淀 5 分钟，然后去除上清液。在不干扰有机体的情况下去除一半的培养基（ 2-3毫升）。如有必要，倾斜板以方便去除培养基。加入 2 – 3 mL 的新鲜培养基，用 1,000 µL 吸头吹打大约 10 次，不要接触井底，以打乱有机体。当使用生物反应器管进行培养时，管子放在培养箱的架子上。每 24 小时用力摇动管子以充分混合。在培养箱中用摇床搅拌生物反应器可以通过充分的空气交换改善培养条件。

D.传代

1.结直肠类器官最初呈圆形生长（ 1-2周）；如我们之前的出版物(Hirokawa et al. , 2021)中详述的那样，使用长期培养的结肠直肠类器官形成隐窝芽 ADDIN EN.CITE 。具有暗核的类器官/类肿瘤已准备好进行传代（图 4）。如果没有传代，死细胞将开始从类器官/类肿瘤中出现。

图 4。培养 2 周后准备传代的结直肠类器官和类肿瘤的明场图像。比例尺，200 µm。

2.在台式离心机中以 500 × g和 4°C 离心 5 分钟。
3.丢弃上清液，将颗粒重新悬浮在 1 mL 的 PBS 中。
4.在台式离心机中以 8,000 rpm 和室温离心 1 分钟。
5.将颗粒重新悬浮在 1 mL的TrypLE Express 酶中，并在37 °C下孵育10-15分钟（取决于类器官的大小）。
6.在台式离心机中以 6,000 rpm 和室温离心 1 分钟。
7.在 DMEM/F12 中将颗粒重新悬浮在 1 mL 的 1% (m/v) BSA 中。
8.在台式离心机中以 6,000 rpm 和室温离心1 分钟。
9.将颗粒重悬在 0.5 – 1 mL 的人类 IntestiCult 类器官生长培养基或结肠直肠肿瘤维持培养基中（参见食谱）含有 10 µM Y-27632，用 200 µL 吸头移液，在 DMEM/F12 中用 1% BSA 预冲洗，将类器官解离成单细胞或小碎片。
10.用血球计数器计算碎片的数量，并计算所需的培养基体积如下：
a.100,000 – 300,000 个细胞，或 1,000 – 5,000 个片段，每孔 3.5 mL，适用于 6 孔悬浮板。
b.500,000 个细胞或 10,000 个片段在 17.5 mL 生物反应器管中。
11.含有 5% Matrigel 和 10 µMY-27632的人类IntestiCult 类器官生长培养基或结肠直肠类肿瘤维持培养基（参见食谱）中重悬单个细胞和/或片段。转移到孔或生物反应器管中。
12.在37 °C的 5% CO 2培养箱中孵育。
13.在人IntestiCult 类器官生长培养基或结肠直肠肿瘤维持培养基中用新鲜的人代替培养基每两天含有10 µMY-27632 。要更换培养基，让培养板在组织培养罩中沉淀 5 分钟，然后去除上清液。在不干扰有机体的情况下去除一半的培养基（ 2-3毫升）。如有必要，倾斜板以方便去除培养基。加入 2 – 3 mL 的新鲜培养基，用 1,000 µL 吸头吹打大约 10 次，不要接触井底，以打乱有机体。当使用生物反应器管进行培养时，管子放在培养箱的架子上。每 24 小时用力摇动管子以充分混合。在培养箱中用摇床搅拌生物反应器可以通过充分的空气交换改善培养条件。

E.冷冻保存

1.将类器官/类肿瘤收集到离心管中。
2.在台式离心机中以 500 × g离心和4 °C 5分钟。
3.丢弃上清液，用 5 mL 的 PBS 重新悬浮颗粒。
4.在台式离心机中以 500 × g离心和4 °C 5分钟。
5.弃去上清液。

6.在 1 mL CryoStor ® CS10冷冻介质中悬浮颗粒，以确保均匀悬浮。

7.CoolCell LX 细胞冷冻容器以 1°C/分钟的速率冷冻保存类器官/类肿瘤。在将冷冻管转移到液氮气相中之前，将冷冻容器在 -80°C 冰箱中放置 8 小时以上，以便长期储存。

F.解冻

1.在 37°C 水浴中解冻冷冻的类器官/类肿瘤。
2.使用 1,000 µL 移液器将有机体悬浮液轻轻转移到离心管中。
3.添加 9 mL 的 DMEM/F12，其中包含 10 μMY-27632 介质。
4.在台式离心机中以 300 – 500进行离心 × g和4 °C 3 分钟。
5.在含有 5% Marigel 和 10 μMY-27632 的 3.5 mL 新鲜人类 IntestiCult 有机体生长培养基或结肠直肠肿瘤维持培养基中丢弃上清液并重新悬浮颗粒。转移到 6 孔悬浮培养板。
6.在 37 °C的 5% CO 2加湿培养箱中孵育。

食谱

1.组织培养基（一旦准备好，保持在 4 °C ）

试剂最终浓度数量
Y-27632 (10 毫米)10微米500微升_
Primocin (50 毫克/毫升)100微克/毫升1毫升
庆大霉素 (50 毫克/毫升)50微克/毫升500 µL
DMEM/F12+GLUTAMAX不适用500 毫升
全部的不适用500 毫升

2.EDTA 螯合缓冲液（使用前添加 DTT）

试剂最终浓度数量
乙二胺四乙酸3毫米876.72 毫克
二硫苏糖醇 (DTT)50微米7.71 毫克
PBS不适用1,000 毫升
全部的不适用1,000 毫升
3.结直肠肿瘤原代培养基
（一旦准备好，在 4 °C下保存长达 2 周。强烈建议使用新鲜制备的培养基。使用前添加新鲜的人重组 EGF 和 FGF2。）

试剂最终浓度数量
Y-27632 (10 毫米) **10微米500微升_
Primocin (50 毫克/毫升)100微克/毫升1毫升
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)100 U/mL 和 100 µg /mL5 毫升
庆大霉素 (50 毫克/毫升)50微克/毫升500 µL
人重组表皮生长因子 (EGF) (100 µg/mL)50 纳克/毫升250 µL
人重组碱性成纤维细胞生长因子 ( FGF2 ) (20 µg/mL)20 纳克/毫升500 µL
烟酰胺 (1 M)10毫米5 毫升
N-乙酰基-l-半胱氨酸 (500 mM)1毫米1毫升
HEPES (1 M, pH 7.4)10毫米5 毫升
Gibco GlutaMAX TM补充剂 (100 × )100 ×5 毫升
B-27 补充 (50 × )50 ×10 毫升
N-2 补充 (100 × )100 ×5 毫升
Gibco 高级 DMEM/F-12不适用461.25 毫升
全部的不适用500 毫升
**，建立类器官或类肿瘤后不需要 Y-27632。

4.结直肠类瘤维持液
（一旦准备好，在 4 °C下保存长达 2 周。强烈建议使用新鲜制备的培养基。可在使用前添加人重组 EGF 和 FGF2。）

试剂最终浓度数量
Y-27632 (10 毫米) **10微米500微升_
诺莫星 (50 毫克/毫升)100微克/毫升1毫升
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)100 U/mL 和 100 µg /mL5 毫升
人重组表皮生长因子 (EGF) (100 µg/mL)50 纳克/毫升250 µL
人重组碱性成纤维细胞生长因子 ( FGF2 ) (20 µg/mL)20 纳克/毫升500 µL
烟酰胺 (1 M)10毫米5 毫升
N-乙酰基-l-半胱氨酸 (500 mM)1毫米1毫升
HEPES (1 M, pH 7.4)10毫米5 毫升
Gibco GlutaMAX TM补充剂 (100 × )100 ×5 毫升
B-27 补充 (50 × )50 ×10 毫升
N-2 补充 (100 × )100 ×5 毫升
Gibco 高级 DMEM/F-12不适用461.75 毫升
全部的不适用500 毫升
**，仅当类器官或类肿瘤被分解成单细胞进行传代时才需要 Y-27632。

致谢

该协议源自Hirokawa等人。（2021 年）。这项研究得到了 NHMRC 项目澳大利亚癌症 (APP1145907) 资助的 2017 年优先驱动的协作癌症研究计划的支持 Grant (APP1092788)，北京基因组研究所 (BGI) 基因组解码程序格兰特，斯塔福德福克斯医学研究基金会，杰夫卡夫先生的捐款代表 Shirley Cuff 癌症研究基金会和 Shane Murphy 先生，独立研究机构基础设施支持计划赠款和维多利亚时代的州政府运营基础设施支持补助金。 OMS 是国民健康和医学研究委员会 (NHMRC) 高级研究员 (APP1136119)。这工作得到广东省人类疾病企业重点实验室的支持基因组学（2020B1212070028），由中国国家基因库与计算和测序资源。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

这项研究是根据赫尔辛基宣言进行的， NHMRC 关于人类研究和机构道德行为的声明人类研究伦理批准（HREC 2016.249，Walter and Eliza Hall Institute 医学研究）。所有患者均知情同意。

参考

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