材料和试剂
1. 96 孔透明底板（Corning，目录号：3631）（图 1）

图 1. 96 孔微孔板的照片，底部透明，盖子透明。
2. 用于 96 孔微孔板的聚苯乙烯盖（Corning，目录号：3931）
3. 1–200 µL 移液器吸头（VWR，目录号：53508-810）
4. 100–1,000 µL 移液器吸头（VWR，目录号：83007-376）
5. 1.5 mL微量离心管（VWR，目录号：20170-038）
6. 14 mL无菌培养管（VWR，目录号：60818-725）
7. 大肠杆菌菌株 K-12 MG1655 用质粒 pOEGFP2 转化，编码氨苄青霉素抗性基因和绿色荧光蛋白（实验室收藏），以前使用过（Haque等人，2017；Niyonshuti等人，2020；Krishnamurthi等人，2021 ) . （图2）
注意：其他表达荧光蛋白的菌株预计与当前协议兼容。

图 2.本协议中使用的质粒 pOEGFP2 的地图。
该质粒是多伦多大学 David McMillen 博士的礼物。使用SnapGene Viewer (GSL Biotech LLC) 生成质粒图谱。

8. 胰蛋白胨（Bio Basic Inc，目录号：TG217）
9. 酵母提取物（Bio Basic Inc，目录号：G0961）
10. 氯化钠（VWR International，LLC，目录号：7647-14-5）
11. 氨苄青霉素（VWR，目录号：AAJ60977-06）
12. Triton X-100（VWR，目录号：AAA16046-AP）
13. 乙醇（VWR，目录号：89125-188）
14. 去离子水（>17.6 MΩ，来自 Barnstead 超纯水净化系统 [型号：D4641]）
15. Triton X-100（VWR，目录号：AAA16046-AP）
16. 液体 LB 培养基 (200 mL)（参见食谱）
17. 氨苄青霉素原液（10 mL）（见配方）
18. Python 代码（见补充文件）

设备

1. 2–20 µL 单通道机械移液器（VWR，目录号：89079-964）
2. 20–200 µL 单通道机械移液器（VWR，目录号：89079-970）
3. 能够测量吸收和荧光的多模式酶标仪（BioTek Instruments，型号：Synergy H1）
4. 高压釜（ Tuttnauer ，型号：2540E-B/L）
5. 生物安全柜（ Labconco ，型号：Purifier Logic+ Class II Type A2）

软件

1. Gen5 酶标仪和成像软件（BioTek Instruments， https ://www.biotek.com/ ）
2. Microsoft Excel 电子表格软件（Microsoft Corporation， https://www.microsoft.com/ ）
3. Python ( https://www.python.org/ )

程序

细菌生长：
A. 细菌初始液体培养物的制备
1. 准备液体 LB 培养基，然后高压灭菌（120°C，41 分钟）并冷却至室温。
2. 将细菌菌株的单个菌落接种到培养管中的 7 mL LB 培养基中，辅以氨苄青霉素或适当的抗生素，最终浓度为 50 μg/mL。注意：如果需要更多重复，可以使用单独培养管中的几个菌落。
3. 在 37°C 的摇动培养箱中孵育液体培养物，并以 250 rpm 的转速摇动过夜。

B. 96 孔板和盖子的预处理
1. 通过将 1 mL 的 Triton X-100 与 9 mL 的乙醇混合，在乙醇中制备 10% 的 Triton X-100。
2. 将 10 mL 稀释的 Triton X-100 倒入新的微孔板盖中。
3. 在室温下用稀释的 Triton X-100 孵育盖子 15 秒。
4. 取一个新的 96 孔板，并用 100% 乙醇（每孔 400 μL）填充每个孔。在室温下孵育 15 分钟。
5. 从微孔板孔中丢弃乙醇，并从微孔板盖中丢弃稀释的 Triton X-100。
6. 将微孔板孔和微孔板盖在室温下风干，将它们留在生物安全柜内 30 分钟。
7. 打开生物安全柜的紫外线灯，进一步消毒微孔板孔和盖子 15 分钟。
笔记：用乙醇和紫外线处理是为了灭菌，而用 Triton X-100 处理是为了防止测量过程中盖子上的水凝结。

C. 酶标仪和软件的设置
1. 打开酶标仪并打开 Gen5 软件。
2. 在 Gen5 中设置新的程序/协议（图 3）。
a. 板类型：96 孔板。
b. 使用盖子：检查。
c. 温度：37°C。
d. 摇动：0:10 的轨道。
e. 所需总时间（例如，16 小时、24 小时或 48 小时）和 10 分钟间隔的动力学测量，并带有连续的轨道振动。
f. 读数：600 nm 处的吸收，激发时的荧光 = 488 nm 和发射 = 525 nm。

图 3。在 Gen5 软件中设置程序/协议的示例，用于使用酶标仪测量细菌的生长曲线。

D. 使用酶标仪测量生长曲线
1. 在补充有氨苄青霉素 50 µg/mL 的新鲜 LB 中将过夜液体细菌培养物稀释 100–500 倍。
笔记：
a. 如果有光度计，测量过夜培养物的光密度，并将稀释液稀释到所需的光密度（通常 <0.05）。
b. 如果需要，可以使用其他介质或附加成分（例如离子、纳米颗粒和可能影响细菌生长的感兴趣的药物）。例如，在代表性数据的样品 S2 中，银离子以 40 µg/mL 的最终浓度添加到 LB 介质中（图 4）。
2. 200 μL稀释培养物移液到 96 孔板的单孔中作为样品。样品应至少一式三份地制备。
3. 将 200 μL 的 LB 培养基与氨苄西林移液到 96 孔板的单孔中作为空白。空白应至少准备三次。
4. 加载所有样品和空白后，用准备好的盖子盖住 96 孔微孔板。
5. 在 Gen5 软件中启动程序/协议。出现提示时，将微孔板正确放置在微孔板支架上，并开始记录细菌生长曲线。

E. 整理起来
1. 数据采集完成后，从微孔板读取器中取出 96 孔板。
2. 对样品进行消毒并正确丢弃微孔板。
3. 将结果保存在 Gen5软件中，并将数据导出为 Excel 电子表格文件。
4. 关闭 Gen5软件，然后关闭酶标仪。

数据分析

1. 将 Excel 电子表格中的数据重新组织为文本文件，以便每个文本文件都包含单个样品（或空白）的吸收数据（或荧光）数据。请注意，文本文件中的每一列对应于微孔板单个孔的读数。荧光数据和吸收数据应该分开到不同的文件中。
2. 运行提供的 Python 代码（请参阅补充文件）以：
a. 计算样品的平均吸收（或荧光），并绘制结果。
b. 平滑生长曲线，计算样品吸收的平均一阶时间导数（或荧光的二阶时间导数），并绘制结果。
c. 确定时间导数的峰值位置和高度。
3. 比较峰位置（和/或高度）以量化样品之间的相对变化。

代表性数据

图 4。由酶标仪及其时间导数测量的大肠杆菌生长曲线的代表性数据。
A.吸收增长曲线。 B.荧光生长曲线。 C.吸收增长曲线的一阶时间导数。 D.荧光生长曲线的二阶时间导数。样品 S1：在 LB 培养基中带有 pEOGFP2 质粒的 MG1655 菌株。样品 S2：MG1655 菌株与pEOGFP2 质粒在 LB 培养基中，银离子为 40 µg/mL。在所有子图中，“ au ”。代表任意单位。

食谱

1. 液体 LB 培养基 (200 毫升)
2 克胰蛋白胨
1克酵母提取物
2克氯化钠（NaCl）
用去离子水填充高达 200 mL 并高压灭菌。
2. 氨苄青霉素原液 (50 mg/mL)
500毫克氨苄青霉素粉（钠盐）
10毫升水
过滤对氨苄青霉素溶液进行消毒，并将 1 mL 管储存在 -20°C。

致谢

我们感谢多伦多大学的 David McMillen 博士慷慨赠予编码增强型 GFP 和氨苄青霉素抗性 (pOEGFP2) 的质粒。这项工作得到了阿肯色大学、阿肯色州生物科学研究所 (Grant No. ABI-0189, No. ABI-0226, No. ABI-0277, No. ABI-0326, No. ABI-2021, No. ABI- 2022）和国家科学基金（批准号 1826642）。原始协议是在Krishnamurthi等人中开发和使用的。 (2021) 和 Niyonshuti等人。（2020 年）。

利益争夺

没有宣布竞争利益。

参考

1. 安德鲁斯，JM（2001 年）。最低抑菌浓度的测定。 J Antimicrob Chemother 48 增刊 1：5-16。
2. Bollenbach , T., Quan, S., Chait, R. 和Kishony , R. (2009)。微生物对抗生素的非最佳反应是抑制药物相互作用的基础。单元格139（4）：707-718。
3. Goldman, E. 和 Green, LH (2021)。微生物学实用手册（Taylor & Francis Group）。 CRC出版社。 IBSN：9780367567637。
4. Haque, MA, Imamura, R., Brown, GA, Krishnamurthi, VR, Niyonshuti, II, Marcelle, T., Mathurin, LE, Chen, J. 和 Wang, Y. (2017)。基于实验的模型量化银纳米粒子对大肠杆菌的抗菌活性。 RSC 进展7(89)：56173-56182。
5. Krishnamurthi, VR, Niyonshuti, II, Chen, J. 和 Wang, Y. (2021)。一种用酶标仪评估细菌生长的新分析方法。公共科学图书馆一号16（1）：e0245205。
6. Mandelstam, J.、Dawes, IW 和 McQuillen, K. (1982)。细菌生长的生物化学。纽约，威利。
7. Niyonshuti, II, Krishnamurthi, VR, Okyere, D., Song, L., Benamara , M., Tong, X., Wang, Y. 和 Chen, J. (2020)。聚多巴胺表面涂层协同银纳米粒子的抗菌活性。 ACS 应用程序接口12(36)：40067-40077。
8. Stevenson, K., McVey, AF, Clark, IBN, Swain, PS 和Pilizota , T. (2016)。酶标仪中微生物生长的一般校准。科学代表6：38828。