材料和试剂

1.CellTrics 50 μm无菌一次性过滤器（Sysmex，目录号：04-004-2327）
2.96孔板（ Ibidi ， 15 μ -Plate 96 Well Black）
3.12孔细胞培养板（ Corning，目录号：3513）
4.25 或 75 cm 2细胞培养瓶（Corning，目录号：430639或430641U）
5.15 mL管锥形底座（ Sarstedt ，目录号：62.554.205）
6.IDT 的 DNA 寡核苷酸引物
7.GeneArt Precision gRNA 合成试剂盒（Invitrogen，目录号：A29377）
8.Tracr Fragment + T7 Primer Mix（包含通用 PCR 扩增引物和 crRNA/ tracrRNA的 80-nt 恒定区）（Invitrogen，目录号：A29377）
9.Phusion TM High-Fidelity PCR Master Mix（2 × ）（Invitrogen，目录号：A29377）
10.无核酸酶水
11.dNTP 混合物（ dATP 、 dGTP 、 dCTP 、dTTP 各 10 mM）（NEB，目录号：N0447）
12.5 × TranscriptAid TM反应缓冲液（Invitrogen，目录号：A29377）
13.TranscriptAid TM酶混合物（Invitrogen，目录号：A29377）
14.DNase I（Invitrogen，目录号：A29377）
15.来自 IDT 的单链 DNA (ssDNA) 寡核苷酸
16.NEBuilder ® HiFi DNA Assembly Master Mix（NEB，目录号：E2621）
17.pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) 质粒（ Addgene质粒 # 62988）
18.BbsI （NEB，目录号：R0539）
19.NEB缓冲器2（NEB，目录号：B7002S）
20.NEB®5 - α感受态大肠杆菌（高效）（NEB，目录号：C2987 ）
21.氨苄青霉素琼脂平板和卡那霉素琼脂平板
22.NEB缓冲区2.1（NEB，目录号： B7202）
23.QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen，目录号：28104）
24.来自 IDT 的合成双链供体 DNA
25.Phusion 高保真 DNA 聚合酶（NEB，目录号：M0530）
26.Phusion GC缓冲液5 × （NEB，目录号：B0519）
27.Zero Blunt TM TOPO TM PCR Cloning Kit（Invitrogen，目录号：45-1245）
28.EcoRI -HF（NEB，目录号：R3101）
29.CutSmart Buffer 10 × （NEB，目录号： B6004）
30.QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen，目录号：28704 ）
31.XbaI （NEB，目录号： R0145）
32.Easy-Fusion Halo 质粒（ Addgene质粒#112850）
33.EcoRI -HF（NEB，目录号： R3101）
34.AvaI （NEB，目录号： R0152）
35.HincII （NEB，目录号： R0103）
36.具有 10% FBS（Invitrogen，目录号： 16140071）的DMEM（Gibco，目录号： 11965-092）
37.DPBS（不含 Ca 2+或 Mg 2+ ）（Gibco，目录号： 14190-144）
38.胰蛋白酶（Gibco，目录号：25200-056）
39.氖转染系统（Invitrogen，目录号： MPK5000）
40.Neon Transfection System 10 μL Kit （Invitrogen，目录号：MPK1025）
41.缓冲器 R
42.嘌呤霉素（Sigma-Aldrich，目录号： P8833）
43.Platinum Cas 9（Invitrogen，目录号： A36498）
44.配备 488 个 100 mW Trigon 激光器和 100 μ m喷嘴的BD FACSAria III分拣机（BD Biosciences）
45.诺考达唑（Sigma-Aldrich，目录号：M1404）
46.Lipofectamine 3000（Invitrogen，目录号：L3000001）
47.OptiMEM （Invitrogen，目录号： 31985062）
48.重组 KRAS 兔单克隆抗体（Thermo Fisher Scientific，目录号：703345）
49.细胞分选缓冲液（参见食谱）
50.TGH 缓冲液（见配方）

软件

1.https://www.benchling.com/ 。 Benchling是一个基于云的信息学平台，对学术研究人员免费。它为 DNA、寡核苷酸和氨基酸提供设计工具。
2.https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/ 。该网站由美国马萨诸塞州布罗德研究所的遗传扰动平台托管。
3.http://chopchop.cbu.uib.no/ 。 CHOPCHOP 是一个基于网络的工具，由挪威卑尔根大学的Valen小组设计。该网站仅供非营利和学术用途。
4.https://nebuilder.neb.com 。该网络工具可用于设计 HiFi DNA 组装或 Gibson组装的引物。

程序

实验设计

图 1.在KRAS 、 NRAS和Grb2中插入mNG的示意图。
mNG序列插入KRAS和NRAS基因的氨基末端（A）和Grb2基因的羧基末端（B）。为所有三个基因生成了供体 DNA，同源臂范围从 500 到 1,000 bp。 ATG，起始密码子； STOP，终止密码子； HA，同源臂； mNG , mNeongreen ; gRNA-引导 RNA；空框代表KRAS 、 NRAS和Grb2的外显子。

表 1 。用于标记基因的成分的来源

克拉斯NRASGrb2
Cas9商业纯化酶商业纯化酶质粒-PX459
gRNA体外转录体外转录克隆到质粒-PX459
捐赠者合成基因片段合成基因片段同源臂和mNG片段
运输方式电穿孔电穿孔通过 Lipofectamine转染

A.KRAS、NRAS生成 gRNA ，和Grb2

1.KRAS和NRAS的 gRNA的体外合成
a.目标 gRNA 的鉴定
我们使用KRAS和NRAS基因的氨基末端来标记mNeonGreen荧光蛋白序列，因为所有 RAS 蛋白都在其羧基末端进行处理（图 1）。在线提供了几种引导 RNA 设计工具。我们经常使用Benchling 、Broad Institute GPP（现为CRISPick ）和 CHOPCHOP 等来设计目标 gRNA。使用这些工具， KRAS和NRAS的两个目标都被确定，它们非常接近两个基因的起始密码子。为每个目标订购两个互补引物（表 2）。

表 2. gRNA 体外翻译的引物

底漆序列 5'--- 3'
Kras_1FTAATACGACTCACTATAGGAATATAAACTTGTGGTAGT目标 1
Kras_1RTTCTAGCTCTAAAACACTACCACAAGTTTATATTC目标 1
Kras_2FTAATACGACTCACTATAGAATGACTGAATATAAACTTG目标 2
Kras_2RTTCTAGCTCTAAAACCAAGTTATTATATTCAGTCATT目标 2
Nras_1FTAATACGACTCACTATAGGACTGAGTACAAACTGGTGG目标 1
Nras_1RTTCTAGCTCTAAAACCCACCAGTTTGTACTCAGTC目标 1
Nras_2FTAATACGACTCACTATAGAATGACTGAGTACAAACTGG目标 2
Nras_2RTTCTAGCTCTAAAACCCAGTTTGTACTCAGTCATT目标 2

i.在 1 × TE 缓冲液中将目标引物稀释至 100 μM的储备溶液。
ii.μM正向和反向目标引物各10 μL添加到 80 μL的无核酸酶水中，制备 10 μM库存溶液的目标引物混合物。
iii.μL的无核酸酶水中稀释 3 μL的 10 μM目标引物混合原液，制备 0.3 μM目标引物混合工作溶液。

b.gRNA DNA 模板的组装
体外转录所需的 DNA 模板。在冰上解冻GeneArt Precision gRNA 合成试剂盒中的试剂。混合并离心所有小瓶的内容物。在 25 μL 体积中设置以下 PCR 组装反应，按给定顺序添加反应组分（表 3）。

表 3. 制作 gRNA DNA 模板的组件

Phusion TM高保真 PCR 预混液 (2 × )12.5微升
Tracr片段 + T7 底漆混合物1微升
0.3 μM Target F/R 寡核苷酸混合物1微升
无核酸酶水10.5微升

由于 PCR 产物预计非常短（120 bp），因此使用以下参数执行两步组装 PCR（表 4）。

表 4. 生成 gRNA DNA 模板的 PCR 参数

循环步骤温度时间循环
初始变性98°C10 秒1 ×
变性98°C5 秒32 ×
退火55°C15 秒32 ×
最终延期72°C1分钟1 ×
抓住4°C抓住1 ×

c.体外转录 (IVT)
使用步骤 A.1.b 中生成的 gRNA DNA 模板进行 gRNA的体外转录。按给定的顺序如下设置反应（表 5）。

表 5. IVT 反应成分

NTP 混合物（ATP、GTP、CTP、UTP 各 100 mM）8微升
gRNA DNA 模板（来自 PCR 组装）6微升
5 × TranscriptAid TM反应缓冲液4微升
TranscriptAid TM酶混合物2微升

彻底混合内容物并离心。在 37°C 下进行 3 小时的 IVT 反应。

d.通过 DNase I 消化去除 DNA 模板
从 IVT 反应中去除 DNA 是有帮助的，这样它就不会干扰 RNA 转录本的后续应用。
i.用 1 μL的 DNase I (1 U/ μL ) 孵育 IVT 反应混合物，并在 37°C 下孵育 15 分钟。

e.使用试剂盒中提供的色谱柱和缓冲液纯化 gRNA
i.将 IVT 反应稀释至 200 μL ，然后加入 100 μL结合缓冲液。通过移液混合。
ii.加入 300 μL乙醇 (>96%) 并通过移液器混合。
iii.将混合物转移至GeneJET TM RNA Purification Micro Column（预装收集管）并以 14,000 × g离心 30-60 秒。丢弃流出物
iv.μL洗涤缓冲液 1 和洗涤缓冲液 2 洗涤结合的 RNA 。
v.× g将空纯化柱再离心 60 秒，以完全去除任何残留的洗涤缓冲液。
vi.将纯化柱转移到干净的 1.5 mL 收集管中。
vii.加入 10 μL无核酸酶水，以 14,000 × g离心 60 秒以洗脱 RNA。
viii.将洗脱的 gRNA 储存在 –20 °C 直至使用。如需长时间储存，请将 gRNA 储存在 -80°C。
注意：在使用 RNA 时，请遵循所有必要的预防措施，以避免其降解或污染，并参阅制造商的说明以获取生成 gRNA 的详细指南。

2.克隆用于标记Grb2的 gRNA
a.目标 gRNA 的鉴定
Grb2在其羧基末端用 mNG标记。使用NEBuilder HiFi DNA 组装混合物进行 Grb2 gRNA 的克隆，该混合物允许组装线性质粒和单链 DNA 片段，就像组装多个 DNA 片段一样。与RAS 蛋白类似，使用Benchling和Broad Institute GPP（现为CRISPick ）鉴定了 Grb2 的两个目标 gRNA 。以下目标 gRNA 序列寡核苷酸从 IDT 订购为 ssDNA（表 6）。带下划线的序列代表实际的目标 gRNA 序列，其两侧是来自 PX459 的 BbsI 限制性酶切位点周围的重叠序列。

表 6. Grb2 gRNA 的 ssDNA 寡核苷酸

grb2-RNA_T1ATCTTGTGGAAAGGGACGAAACACCGG GTTAGACGTTCCGGTTCACGG GTTTTAGAGCT AGAAATAGCAAGTT
grb2- gRNA_T2ATCTTGTGGAAAAGGACG AAACACCGG GCTTAG ACGTTCCGGTTCACG GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT

b.用 BbsI 消化PX459
在 37°C 下用BbsI消化 4 小时来线性化 PX459 质粒（表 7）。使用QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化消化的质粒。
表 7. PX459 消解装置

PX459 质粒 (500 ng/ μl )10微升
10 ×缓冲器 2.12微升
BbsI (10 U/ 微升)1微升
ddH 2 O7微升

c.将 ssDNA 连接到消化的 PX459 中
离心 ssDNA oligo 沉淀并在 1 × TE 中重悬至最终浓度为 100 μM ，在 NEB 缓冲液 2 中进一步稀释至 0.4 μM工作储备液。按给定顺序设置线性化 PX459 和 ssDNA oligo 的连接反应下文（表 8）。

表 8. HiFi DNA 组装设置

线性 PX459 质粒 (50 ng)1微升
0.4 μ M ssDNA 库存5微升
ddH 2 O4微升
NEBuilder ® HiFi DNA 组装预混液10微升

50 °C 下孵育组装反应1 小时，并将 2 μL的反应混合物转化为NEB 5 -α感受态大肠杆菌细胞。通过将转化的大肠杆菌细胞电镀到氨苄青霉素琼脂板上来选择氨苄青霉素抗性菌落。

d.筛选和确认阳性克隆
从氨苄青霉素板中选择几个菌落进行质粒分离。通过 Sanger 测序确认含有 gRNA 序列的阳性克隆。

B.生成用于标记KRAS、NRAS和Grb2的供体 DNA

1.克隆供体 DNA 以标记 KRAS 和 NRAS
具有mNG序列的供体DNA侧翼为约500 b的5'和3'同源臂，作为基因片段从IDT获得。使用引物扩增片段并使用 TOPO PCR 克隆试剂盒将其克隆到pCRBluntII -TOPO 质粒中。
a.供体 DNA 的扩增
离心含有基因片段的小瓶，将沉淀物收集在 50 μL 1 × TE 中。使用Phusion聚合酶（表 10 和 11）和下面提到的引物（表 9）扩增合成 DNA。

表 9. 用于扩增 KRAS 和 NRAS 合成供体 DNA 的引物

引物5'------------3'
KRas_5HAFAGGTGGGGGTCCACTAGGAA
KRas_3HARCATATGATGTCACAATACCAAGAAAC
NRas_5HAFCAGAGGCAGTGGAGCTTG
NRas_3HARACAATCAGACAGTCTCGCTACTAT

表 10. 扩增 KRAS 和 NRAS 合成供体 DNA 的 PCR 设置

KRAS 供体 DNANRAS 供体 DNA
供体基因片段5微升5 微升
Phusion GC 缓冲液 5 ×10 微升10 微升
10mM dNTP1 微升1 微升
5HAF2.5 微升2.5 微升
3HAR2.5 微升2.5 微升
Phusion聚合酶1 微升1 微升
无核酸酶水28微升28微升

表 11. 扩增 KRAS 和 NRAS 合成供体 DNA 的 PCR 参数

循环步骤温度时间循环
KRAS 供体NRAS 供体
初始变性98°C98°C1分钟1 ×
变性98°C98°C15 秒30 ×
退火61.6°C64.7°C15 秒30 ×
延期72°C72°C1分钟30 ×
最终延期72°C72°C10 分钟1 ×
抓住4°C4°C抓住1 ×

对来自 KRAS 和 NRAS 扩增供体 DNA 的 1.68 kb PCR 产物进行凝胶纯化。

b.扩增供体 DNA 和pCRBluntII -TOPO 质粒的连接
如下在 6 μ L体积中设置凝胶洗脱的 KRAS 和 NRAS 供体 DNA 和pCRII -Blunt-TOPO 质粒的连接反应（表 12）。

表 12. 供体 DNA 和pCRBluntII -TOPO 连接设置

KRAS 捐赠者NRAS 捐赠者
凝胶洗脱片段2微升2 微升
盐溶液1 微升1 微升
无核酸酶水2 微升2 微升
pCR -II-Blunt-TOPO1 微升1 微升

在室温下孵育连接反应 5 分钟。将 1 – 2 μ L的连接混合物转化为感受态大肠杆菌，并在含有卡那霉素的板上进行选择。

c.供体 DNA 的筛选和确认
从卡那霉素板中选择几个菌落并培养它们以分离质粒。通过EcoRI消化和 Sanger 测序确认阳性克隆，以确保供体序列没有变化。

d.从阳性克隆中消化和凝胶洗脱供体 DNA 序列
将片段插入pCRII -Blunt-TOPO 中，使EcoRI位点位于插入片段的末端，从而通过EcoRI消化恢复插入片段。用EcoRI消化含有供体序列的阳性克隆，如下所示（表 13）。

表 13. pCR -II-Blunt-TOPO-Donor 质粒的消化

克拉斯NRAS
pCR -II-Blunt-TOPO-Donor (1 μ g / μL )20微升20 微升
CutSmart 缓冲器 10 × 5 微升5 微升
EcoRI -HF (10 U/ μL )3 微升3 微升
无核酸酶水22 微升22 微升

72°C 下消化 3 小时。凝胶从两个样品中洗脱 1.68 kb 条带。将洗脱的供体碎片储存在-20 °C。
注意：克隆供体 PCR 片段是为了便于使用 Sanger 测序确认正确的供体序列并避免重复扩增。纯化的 PCR 片段可直接用作供体 DNA，从而减少克隆时间。

2.标记Grb2的供体 DNA 克隆
NEbuilder算法 (NEB)设计的引物从 HeLa 基因组 DNA 中扩增 5' 和 3' 同源臂 (HA) ，而使用 KRAS 供体 DNA 作为模板来扩增mNG ORF。引物将重叠序列添加到产生的 PCR 片段中，然后使用NEBuilder ® HiFi DNA Assembly Master Mi x 将这些片段与 Easy-Fusion Halo 质粒组装（表 14）。

表 14. HiFi DNA 组装的组件片段

姓名长度 (bp)由。。。生产
5HA片段793聚合酶链反应
3HA片段743聚合酶链反应
mNG片段755聚合酶链反应
EasyFusion halo 质粒作为骨架载体2,927限制消化

a.同源臂 (HA) 和mNG ORF的扩增
NEBuilder算法设计具有重叠序列的引物（表 15）。如下扩增构建供体 DNA 所需的所有三个片段（表 16、17 和 18）。

表 15. 用于扩增 Grb2 同源臂和mNG ORF的引物

底漆5'……………… .. 3'
Grb2-5HA_fTATCGATAAGCTTGATATCGAGAGGCAGTTGTGTAGCCAG
Grb2-5HA_rCTCCTCCTAAGACGTTCCGGTTCACGGG
Grb2-Neon_fCCGGAACGTCTTAGGAGGAGGAGGATCAG
Grb2-Neon_rTTGACTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG
Grb2-3HA_fGCTGTACAAGTAAGAGTCAAGAAGCAATTATTTAAAG
Grb2-3HA_rCCACCGCGGTGGCGGCCGCTTCTCGAACTCCTGACCTTG

的PCR 设置

5HA片段3HA 片段
HeLa 基因组 DNA (100 ng/ μL )3微升3微升
Phusion GC 缓冲液 5 ×10 微升10 微升
10 毫米 dNTP1 微升1 微升
Grb2-5/3HA_f2.5 微升2.5 微升
Grb2-5/3HA_r2.5 微升2.5 微升
Phusion聚合酶1 微升1 微升
无核酸酶水30微升30微升

mNG ORF的 PCR 设置

mNG片段
mNG -KRAS 供体 (100 ng/ μL )3微升
Phusion GC 缓冲液 5 ×10 微升
10mM dNTP1 微升
Grb2-Neon_f2.5 微升
Grb2-Neon_r2.5 微升
Phusion聚合酶1 微升
无核酸酶水30微升

mNG ORF扩增的 PCR 参数

循环步骤温度时间循环
5HA3HAmNG
初始变性98°C98°C98°C1分钟1 ×
变性98°C98°C98°C15 秒30 ×
退火64.4°C60°C59.6°C15 秒30 ×
延期72°C72°C72°C25 秒30 ×
最终延期72°C72°C72°C10 分钟1 ×
抓住4°C4°C4°C抓住1 ×

QIAquick Gel Extraction Kit凝胶洗脱PCR 产物并估计洗脱片段的 DNA 浓度。

b.EasyFusion -Halo 质粒的限制性内切酶消化。
EcoRI和XbaI消化EasyFusion -Halo 质粒，在 37°C 下 4 小时去除 Halo 插入片段（表 19）。

表 19. 消化EasyFusion -Halo 质粒以去除 Halo 插入片段

EasyFusion -Halo (5微克)10微升
CutSmart 缓冲器 10 ×2 微升
生态研究所2 微升
XbaI2 微升
无核酸酶水2 微升

QIAquick Gel Extraction Kit凝胶洗脱消化质粒的 2.9 kb 片段，并估计洗脱片段的 DNA 浓度。

c.HiFi DNA 组装连接反应
将生成 Grb2 供体 DNA 所需的所有四个片段混合至 10 μL的最终体积。在冰上彻底解冻 HiFi DNA 组装混合物并涡旋。将等量的 HiFi DNA 组装预混液添加到片段中（表 20）。

表 20. 用于产生 Grb2 供体 DNA 的连接设置
0.1 pmol 5HA 50 ng0.8微升
0.1 pmol mNG 50 ng0.9微升
0.1 pmol 3HA 50 ng1.1微升
0.1 pmol消化载体 185 ng2微升
HIFi DNA 组装预混液10微升
无核酸酶水5.2微升

在 50 °C 下进行 1 小时的连接反应。将 2 μL的反应混合物转化为合格的大肠杆菌。使用限制性内切酶消化和 Sanger 测序筛选包含所有三个片段 (5HA-mNG-3HA) 的阳性克隆的几个菌落。

C.在 HeLa 细胞中递送 gRNA 和供体 DNA

1.将 RNP 复合物电穿孔以标记KRAS和NRAS
a.2烧瓶中将 HeLa 细胞生长在 10% FBS 到 90% 融合的 DMEM中。用 100 ng/mL 诺考达唑处理细胞 12 小时。
b.在电穿孔当天，解冻并储存缓冲液 R、KRAS 和 NRAS 特异性体外转录的 gRNA，以及冰上的供体 DNA。在无核酸酶水中稀释 gRNA 和供体 DNA 至适当浓度。
c.× DPBS洗去诺考达唑。用胰蛋白酶拆分细胞并通过添加含有 DMEM 的 FBS 使其失活。将单细胞悬液以 300 × g离心5 分钟。用 10% FBS 将颗粒重新悬浮在 10 mL 的 DMEM 中。使用血细胞计数器进行细胞计数。
d.在 1.5 mL 微量离心管中为每个基因编辑反应准备 RNP 混合物，如下所示（表 21）。

表 21. 用于电穿孔的 RNP 混合物的成分

缓冲器 R1微升
铂 Cas9 （1微克）0.5微升（1微克）
gRNA (500 纳克)2微升

e.在室温下孵育 RNP 复合物 20 分钟。
f.当 RNP 孵育时，准备电穿孔装置，并通过在 300 下将细胞离心以保持细胞为电穿孔做好准备 × g 5 分钟。吸出 DPBS 并将细胞沉淀重悬至缓冲液 R 中 8 × 10 7 个细胞/ml的最终细胞密度。
g.在霓虹吸管站中加入 3 mL 的电解缓冲液（缓冲液 E）。
h.中加入 5 μL细胞（最终 4 × 10 5 个细胞）和 1 μg各自供体 DNA 片段。确保最终混合物的体积为 10 μL 。使用 Neon 移液器吸出 Neon Tip 中的最终混合物，不加入气泡，并以 1,005 V 的脉冲电压、35 ms的脉冲宽度、2 个脉冲进行电穿孔。
i.将电穿孔的细胞转移到 12 孔板中，该板含有预热的 DMEM 和 10% FBS，不含抗生素，并在 CO 2培养箱中继续在 37°C 下孵育板。

2.转染 gRNA 和供体以标记Grb2
a.在 DMEM 中培养 HeLa 细胞，在 12 孔板中具有 10% FBS 至 90% 的汇合度。用 100 ng/mL 诺考达唑处理细胞 12 小时。
b.在转染当天，将 PX459-Grb2-gRNAs 和 Grb2-mNG 供体 DNA 质粒稀释至无核酸酶水中的适当浓度。
c.× DPBS洗去诺考达唑。添加含有 DMEM 的 1 mL 新鲜 FBS。
d.按照给定的顺序在 1.5 mL 微量离心管中制备 DNA-脂质混合物（表 22）。

表 22. 标记 Grb2 的转染混合物的成分

管 1
OptiMEM50微升
PX459-Grb2-gRNA (250 纳克)0.5微升
Grb2-mNG 供体 (750 ng)1微升
P3000 试剂2微升
管 2
OptiMEM50微升
Lipofectamine 3000 试剂1.5微升

e.将管 1 中的内容物添加到管 2。在 RT 下孵育混合物 10 分钟。
f.将质粒-脂质混合物逐滴添加到细胞中。
g.转染后第二天，用 2 μ g /mL 嘌呤霉素处理转染细胞 48 小时，通过杀死未转染细胞来丰富转染细胞。
h.去除含有 DMEM 的嘌呤霉素，用 DPBS 洗涤细胞两次，让细胞恢复。拆分幸存的单元格并展开它们以进行流分选分析。

D.mNG阳性细胞的流式分选

1.2烧瓶中展开带有 10% FBS 的 DMEM 中标记的 HeLa 细胞。
2.在排序当天，使用胰蛋白酶拆分细胞，并用含有 DMEM 的 FBS 将其灭活。离心细胞并用 PBS 洗涤一次。重悬细胞分选缓冲液中的最终颗粒。
3.将细胞悬浮液通过一次性过滤器，以在分选前去除细胞聚集体。使用阳性（亲代 HeLa 细胞瞬时或稳定表达mNG ）和阴性（亲代未标记的 HeLa 细胞）对照来校准分选仪器。
4.在 96 孔板或 15 mL 锥形管中收集单个分类的细胞，作为混合种群，使用 10% FBS 和抗生素的预热 DMEM，以防止污染。

E.阳性克隆的确认

1.在使用它们进行确认之前，至少冷冻一瓶单细胞克隆作为备份。
2.mNG抗体通过蛋白质印迹分析确认克隆。正确的融合蛋白应具有比亲本蛋白大约 25 kD的表观分子量。对mNG序列插入位点周围的区域进行测序也很重要，以确保在同源修复过程中没有不需要的插入或缺失。
注意：未对不同交付方式的效率进行直接比较。在所有情况下，流式分选过程中测定的mNG阳性细胞的产量为 0.1% 至 0.5%。由于我们对用于筛选的单细胞集落感兴趣，因此一个 96 孔板的单分选细胞足以筛选它们。应该注意的是，流式分选可能会无意中导致克隆表达更高产量的融合蛋白。
数据分析

1.标记细胞系克隆的表征

选择从流排序种群中产生的几个菌落。处理菌落以进行 DNA 分离以进行 Sanger 测序和制备裂解物以进行蛋白质印迹分析。要生成用于 Sanger 测序的 PCR 产物，请设计可以放大同源臂之外的区域的引物。测序应显示正确插入的mNG序列以及接头和起始/终止密码子。蛋白质印迹应揭示融合蛋白的正确分子量。例如，使用蛋白质印迹法筛选 HeLa/ mNG -KRAS 克隆如图 2 所示。菌落在 TGH 缓冲液中裂解，裂解物电泳并转移到硝酸纤维素膜上。我们在筛选的 24 个菌落中检测到两个纯合克隆。加载来自亲本细胞系的裂解物作为 WT 未标记蛋白的对照。必须确保在 Cas9 介导的基因编辑过程中发生的脱靶变化不会以不适合研究的方式影响细胞。由于我们的重点是研究 EGFR-RAS-MAPK 通路，我们选择了在 HeLa 亲本中表现出相似 ERK1/2 磷酸化动力学的克隆，并在存在 EGF 的情况下标记了 KRAS 和 NRAS 细胞（Surve等人，2021）。

图 2. HeLa/ mNG -KRAS 单细胞克隆的筛选。
从稀释转染细胞的 10 厘米板或从 96 孔板中的流式细胞仪分选的群体中获得单细胞集落。第一次筛选是通过使用共聚焦显微镜检查细胞荧光来完成的。通过使用带有 KRAS 抗体的蛋白质印迹 (WB)探测亲本 (Par) HeLa 和单细胞克隆的 HeLa/ mNG -KRAS 细胞的裂解物来进行第二次筛选，以确定表达mNG -KRAS 的克隆的接合性。从 10 cm 平板获得2 到 10 个（在A中）的克隆，而剩余的克隆通过流式分选获得。以 T1 开头的克隆名称来自 Target 1 gRNA，而带有 T2 的克隆名称是 Target 2 gRNA 转染的结果。 A和B中的上箭头表示mNG -KRAS 融合蛋白，而下箭头表示未标记的 KRAS 蛋白。带有星号的克隆是纯合克隆，因为它们缺少对应于未标记的天然 KRAS 的条带。

2.内源性标记 KRAS、NRAS 和 Grb2 的本地化示例

在筛选和确认标记细胞系后，我们使用旋转圆盘共聚焦显微镜对活标记细胞系进行成像（图 3）。

图 3。用mNG在 HeLa 细胞中定位内源性标记的 KRAS、NRAS 和 Grb2 。
使用旋转圆盘共聚焦显微镜通过 488 nm（绿色； mNG ）通道进行活细胞成像。显示了单个共焦部分。一种。 mNG -KRAS 主要位于质膜（实心箭头），一小部分也位于囊泡中（空心箭头）。 B.大部分mNG -NRAS 位于质膜上。 mNG -NRAS 也位于近核区域（虚线圆圈）和管状结构（空心箭头）。 C. Grb2-mNG 定位于细胞质和细胞核。

食谱

1.细胞分选缓冲液
1 × PBS（不含 Ca/Mg++）
2%热灭活FBS
1 毫米乙二胺四乙酸

2.TGH 缓冲液
1% 海卫 X-100
10% 甘油
50 毫米 HEPES
2 毫米 EGTA
磷酸酶和蛋白酶抑制剂

致谢

作者感谢马萨诸塞州剑桥市 Broad 研究所的 Feng Zhang 博士和加拿大安大略省多伦多病童医院Peter Gilgan研究和学习中心的 Janet Rossant博士提供的质粒。这项研究得到了 NIH 赠款 CA089151 和 GM124186 的支持。 S. Surve也得到了国家癌症中心的奖学金的支持。该协议改编自Surve 等。（2021 年）。

利益争夺

作者声明没有竞争的经济利益。

参考

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