材料和试剂
1. 50 mL Falcon管（ Sarstedt ，目录号： 62.559.001）
2. 21 G针（BD Microlance ，目录号： ND432）
3. 27 G针（BD Microlance ，目录号： 302200）
4. 1 mL注射器（BD Microlance ，目录号： 309628）
5. 1.5 mL低结合管（ Sarstedt ，目录号：72.706.600）
6. 0.5 mL Qubit 管（Invitrogen，目录号： Q32856）
7. 30 μm过滤器（ Miltenyi Biotech MACS，目录号：130-098-458）（室温）
8. 二甲苯（ Histolab ，目录号：2070）（室温）
9. 乙醇（VWR BDH Chemicals，目录号：VWRC20816.552）（室温）
10. 胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C9263）（-20°C）
11. 透明质酸酶（Merck Millipore，目录号：HX0154）（-20°C）
12. 氨苄青霉素（ Serva ，目录号：69-52-3）（+4°C）
13. 叠氮化钠（ Merck Millipore，目录号：822335）（室温）
14. BSA（ Miltenyi Biotech MACS，目录号：130-091-376）（+4°C）
15. IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich，目录号：I3021）（+4°C）
16. 1 M CaCl 2 （Alfa Aesar ，目录号：J63122）（室温）
17. 5 M NaCl（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：AM9759）（室温）
18. 1 M Tris-HCl pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：15568-025）
19. 1 M Tris-HCl pH 7.5（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号： 15567-027 ）
20. 1 M MgCl 2 （Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：AM9530G）（室温）
21. FBS（Life Technologies，目录号：10108-105）（-20 °C ）
22. RNase A（Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0531）（- 20 °C）
23. DTT（Thermo Fisher Scientific，目录号：20291）（+4°C）
24. 0.5 M EDTA（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：AM9260G）（室温）
25. 二甲基甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：D4551）（室温）
26. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G9012）（室温）
27. 脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）（室温）
28. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）（室温）
29. 人类基因组 DNA（Promega，目录号：G3041）（+4°C）
30. Qiagen miniElute PCR 纯化试剂盒（Qiagen，目录号：28004）
31. 6X加载染料（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0611）（-20°C）
32. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
33. 蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：11873580001）
34. 亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S2626）
35. 10% SDS（ Thermo Fisher Scientific， Invitrogen，目录号： 1553-035 ）
36. 抗H3K27ac抗体（Abcam，目录号：ab4729）
37. 抗 H3K27me3 抗体（Cell Signaling Technology，目录号：9733S）
38. 抗H3K4me1抗体（Abcam，目录号：ab176877）
39. 抗H3K36me3抗体（Abcam，目录号：ab9050）
40. 小鼠 IgG1，κ 单克隆（Abcam，目录号：ab18443）
41. 豚鼠抗兔IgG抗体（Antibodies-Online，目录号：ABIN101961）
42. 蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific，目录号： EO0491）
43. 苯酚（Thermo Fisher Scientific，目录号： 17914）
44. 氯仿（Sigma-Aldrich，目录号： C2432）
45. NEBNext高保真 2 × PCR 预混液（New England Biolabs，目录号：M0541S）（-20°C）
46. SPRIselect珠子（Beckman Coulter，目录号：B23317）（室温）
47. T7高产量RNA合成试剂盒（New England Biolabs，目录号：E2040S）（-20°C）
48. Zymo RNA纯化试剂盒（ Zymo Research ，目录号：R1013）（室温）
49. SMART MMLV 套件（TAKARA，目录号：639524）（-20°C）
50. RNAClean XP 珠子（Beckman Coulter，目录号：A63987）（+4°C）
51. 齐莫 ChIP DNA 清洁和浓缩试剂盒（ Zymo Research，目录号： D5205）（室温）
52. 40％丙烯酰胺：双-丙烯酰胺（Invitrogen，目录号：HC2040）
53. 10％过硫酸铵（Invitrogen，目录号：HC2005）
54. TEMED（Invitrogen，目录号：HC2006）
55. Digitonin （ Millipore ，目录号： 300410 ）
56. 无核酸酶水（Invitrogen，目录号：AM9932 ）
57. KOH（Sigma-Aldrich，目录号： 484016）
58. 50 bp DNA 梯（ ThermoFisher Scientific，目录号：10488099）
59. 安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒（安捷伦，目录号：5067-4626）
60. Tn5 转座酶 [根据先前的描述在当地蛋白质设施中生产（ Picelli 等人，2014 年）]
61. pA-Tn5 转座酶 [根据先前的描述在当地蛋白质设施中生产（ Picelli 等等，2019 年）]
62. 1 × PBS（pH = 7.4）（ Thermo Fisher Scientific，目录号： 10010023 )
63. SYBR 金（ ThermoFisher Scientific，目录号：S33102）
64. 10 × TBE缓冲液（ ThermoFisher Scientific，目录号：B52）
65. 小鼠肾脏/肝脏 FFPE 组织块（实验室制备）
66. 用于从 FFPE 组织中分离单核悬浮液的缓冲液（参见配方）
67. Tn5 组装和活性测定中使用的缓冲液（参见食谱）
68. 用于表位检索的缓冲液（参见配方）
69. 用于抗体结合和标记的缓冲液（参见配方）
70. 用于文库制备的缓冲液（参见配方）

设备

1. 切片机（ Leica， Histo Core MULTICUT 半自动旋转切片机，目录号：149MULTI0C1、14051856372 或类似的）
2. 立体显微镜（ Zeiss stemi DV4立体显微镜8x-32x，目录号：435421-0000-000或类似的）
3. ThermoMixer （ Eppendorf，Thermomixer F1.5，目录号：5385000016 或类似产品）
4. 热循环仪（ Applied Biosystems， Veriti ，目录号：4375786或类似的热循环仪）
5. NanoDrop （ Thermo Fisher Scientific ，Nanodrop 2000c，目录号： ND2000CLAPTOP或类似产品）
6. 细胞计数器（ Life Technologies，Countess II，目录号：AMQAF1000 或类似产品）
7. 离心机（ Eppendorf centrifuge 5415R，目录号：EP5415R 或类似的）
8. 旋转器（ Grant Instruments TM 360° Vertical Multi-function Rotator PTR 35 ，目录号：9.721028或类似产品）
9. 显微镜（ Zeiss Imager.Z2，目录号：490016-0001-000 或类似的）
10. DynaMag TM -2 磁架（ Thermo Fisher Scientific ，目录号：12321D 或类似的）
11. 安捷伦 DNA 生物分析仪（安捷伦，目录号： 5067-4626）
12. 聚丙烯酰胺凝胶托盘（Thermo Fisher Scientific ，目录号： HC1000S）
13. 凝胶文档系统（BIO-RAD，目录号：1708195EDU）

软件

1. 领结2（ http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtmL ）
2. Samtools ( http://samtools.sourceforge.net/ )
3. 深度工具（ https://deeptools.readthedocs.io/en/develop/content/installation.htmL ）
4. SICER ( https://zanglab.github.io/SICER2/ )
5. Picard 工具 ( https://broadinstitute.github.io/picard/ )
6. IGV ( https://software.broadinstitute.org/software/igv/ )
7. 斐济（ https://imagej.net/software/fiji/ ）

程序

A. 从 FFPE 块中分离单核悬浮液
1. 将 FFPE 块切成小块或卷曲
2. 脱蜡和再水化
3. 总组织碎裂
4. 分解
5. 过滤
B. TN5组装
1. TN5组装
2. T7-pA-Tn5 组件
3. Tn5 和 T7-pA-Tn5 活性测定
C. 抗体结合和标记
1. 表位检索
2. 一抗结合
3. 二抗结合
4. 标记和反向交联
D. DNA分离和体外转录
1. DNA纯化
2. 间隙填充
3. SPRI 珠纯化
4. 体外转录和 RNA 纯化
E. 逆转录和预PCR
1. 逆转录
2. 使用RNAClean纯化 cDNA XP珠
3. PCR前
F. 第二次标记和文库制备
1. 二次标记
2. PCR扩增
3. 尺寸选择和凝胶纯化
G. 精确定量和测序
1. 使用生物分析仪进行精确定量
2. 测序

A. 从 FFPE 组织块中分离单核悬浮液

FFPE 组织通过多个步骤进行处理：脱蜡、再水化、总组织破碎、酶消化、解聚和过滤以分离单核悬浮液。
1. 将 FFPE 块切片（或卷曲或幻灯片）并制备酶。
以不同的厚度对 FFPE 块进行切片：7 – 20 μm 。
提示：为了获得良好的切片而没有任何组织破损，切片前用湿乙醇无菌布擦拭，在组织块顶部添加一些乙醇。
2. 脱蜡和再水化
a. Falcon 管中取一个组织切片，加入 1 mL 二甲苯进行脱蜡，孵育 5 分钟。孵化后，吸出二甲苯并重复相同的步骤两次。
b. 脱蜡后，加入 1 mL 的 100% 乙醇并孵育 5 分钟，然后通过添加和吸入不同百分比的乙醇（1 mL）（95%、70%、50% 和 30%）连续补液。最后，加入 1 mL 的无核酸酶水进行补液并孵育 5 分钟。
3. 组织显微切割和酶消化
a. 补液后，将组织重新悬浮在 1 mL 的 PBS（室温）中，加入 0.5 mM CaCl 2 ，选择切片，然后使用镊子将组织转移到装有 200 μL PBS 和 0.5 mM CaCl 2的高压釜玻璃盘中。在立体显微镜下使用两个 21 G 针头进行总组织碎裂。
提示：要获得合适的细胞核，请使组织尽可能小。
b. 将碎片组织转移到带有 1 mL 移液器的 1.5 mL 管中，并在 3,000 × g （室温）下将样品离心10 分钟。离心后，吸出上清液，加入 500 μL 的 6 mg/mL 胶原酶（在 PBS 中用 0.5 mM CaCl 2稀释）、500 μL 的 600 unit/mL 透明质酸酶（在 PBS 中用 0.5 mM CaCl 2稀释）、50 μg钠叠氮化物（Merck Millipore, 26628-22-8），100 μg氨苄青霉素并在 37°C 下孵育 16 小时。
4. 分解
a. 准备新鲜的NST 缓冲液（ N onidet P40 与S alts 和Tris缓冲液）（NST 缓冲液配方参见表 8）。孵育 16 小时后，加入 400 μL NST 缓冲液并以 3,000 × g的速度将混合物离心10 分钟（室温），然后吸出并丢弃上清液。
b. 将 800 μL NST 缓冲液、10% 胎牛血清（88 μL ）（冰上）和 0.1% DNase-free RNase A （0.88 μL ）（冰上）加入颗粒中，并通过 2 个 7G 针头注射器至少分解 30 次。
5. 过滤
a. 分解后，将混合物以 3,000 × g离心10 分钟，吸出上清液，加入 800 μL NST 缓冲液，并使用 30 μm 过滤器过滤混合物两次。
b. 过滤后的混合物应以 3,000 × g离心10 分钟。然后，先弃上清，将沉淀重悬于 500 μL 1 × PBS 中，取 5 μL细胞核悬液用细胞计数器计数，取 20 μL细胞核悬液用 DAPI 染色细胞核，并可视化单个核群（图 1）。
注意： 500,000–1,000 000 个细胞核可以从一个 20 μm厚的小鼠肾脏切片中获得。

图 1. 分离的 FFPE 小鼠细胞核。
从 20 µm 厚的小鼠 FFPE 肾组织切片中分离出的代表性细胞核并用 DAPI 染色（比例尺 = 10 µm）。

B. TN5组装

Tn5 组装主要包括将 Tn5 适配器寡核苷酸加载到 Tn5 或 pA-Tn5 转座酶上并检查 Tn5 和 T7-pA-Tn5 活性的步骤（见表 1）。

表 1.组装 Tn5 的总结

姓名已加载适配器
Tn5 Tn5ME-A/Tn5MErev + Tn5ME-B/Tn5MErev
T7-PA-Tn5 T7-Tn5ME/Tn5MErev

提示：开始实验前准备 2 ×透析缓冲液、Tn5 和 T7-pA-Tn5。

1. Tn5 组件（表 2）
提示：组装的 Tn5 将用于第二个标记步骤。

表 2.用于 Tn5 组装的寡核苷酸

姓名寡核苷酸序列
Tn5MErev 5′-[磷酸] CTGTCTCTTATACACATCT -3′
TN5ME-A 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'
TN5ME-B 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'

a. 将所有 DNA 寡核苷酸（见表 1）制备至 100 μM 。
b. 在一个 PCR管中混合 5 μL的 Tn5ME- A和 5 μL 的 Tn5MErev，在另一个 PCR 管中混合 5 μL的 Tn5ME-B 和 5 μL 的 Tn5MErev 。寡核苷酸的DNA序列列于表 2。
c. 进行寡核苷酸退火，然后使用 PCR 机器以 -0.1°C/s 的升温速率缓慢升温至 25°C。
d. 之后，混合上述体积中的所有试剂：2 µL Tn5MErev/Tn5ME-A，2 µL Tn5MErev/Tn5ME-B, 20 µL 100% 甘油，15.24 2 µL 2 ×透析缓冲液（100 mM HEPES-KOH，pH 7.2，0.2 M NaCl，0.2 mM EDTA，2 mM DTT，0.2% Triton X-100，20% 甘油），2.15 µL Tn5 (46.55 μM ), 8.21 μL 水并在室温下孵育 1 小时（另请参阅表 9 了解 2 ×透析缓冲液的制备和表 10 了解 Tn5 组件的移液方案）。

2. T7-pA-Tn5 组件（表 3）
提示：组装的 T7-pA-Tn5 用于步骤 C.3.d。

表 3.用于T7-pA-Tn5组装的寡核苷酸

姓名寡核苷酸序列
Tn5MErev 5′-[磷酸] CTGTCTCTTATACACATCT -3′
T7-Tn5ME 5'-CATGAGATTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGATGTGTATAAGAGACAG-3'

a. 将所有寡核苷酸（来自表 2）准备到 100 μM 。
e. 混合 5 μL 5 µL 的 T7-Tn5ME 在 PCR 管中的 Tn5MErev。寡核苷酸的DNA序列列于表 3。
b. 通过将寡核苷酸置于 95°C 下 5 分钟进行寡核苷酸退火，然后使用 PCR 机器以 -0.1°C/s 的升温速率缓慢升温至 25°C。
c. 之后，混合上述体积中的所有试剂：4 µL T7-Tn5ME/Tn5MErev，20 µL 100% 甘油，15.58 µL 2 ×透析缓冲液（100 mM HEPES-KOH，pH 7.2，0.2 M NaCl，0.2 mM EDTA，2 mM DTT，0.2% Triton X-100， 20% 甘油），1.81 µL pA-Tn5 (55.55 μM ), 8.61 μL 水并在室温下孵育 1 小时（T7 pA-Tn5 组件的移液方案参见表 11，2 ×透析缓冲液制备参见表 8）。
3. Tn5 和 T7-pA-Tn5 活性测定
检查组装的 Tn5 和 T7 pA-Tn5 的活性，如表 4 中所述（另见表 12 以了解 2 × TD 缓冲液的制备）。
a. 在 55°C下孵育混合物7 分钟。孵育后，根据制造商的方案用 Qiagen MiniElute PCR 纯化试剂盒纯化混合物，并在 10 μL洗脱缓冲液中洗脱。

表 4. Tn5 或 T7-pA-Tn5 活性测定的混合物

试剂体积
2 × TD 缓冲器 10微升
人类基因组 DNA 50 纳克
Tn5 或 T7-pA-Tn5 (2 μM ) 1微升
水使最终体积为 20 μL /管

b. 最后，与 2 μL的 6 ×上样染料混合并在 1% 琼脂糖凝胶上运行，以检查标记 DNA 的大小以及DNA 阶梯（图 2）。
注意：标记后 DNA 片段的预期大小从 150 bp 到 2,500 bp开始，并且看起来像在凝胶泳道中扩散的涂片。

图 2. Tn5、pA-Tn5 和 T7-pA-Tn5 的活性测定。
此处显示了 Tn5 转座后的 DNA 大小分布。 T7-pA-Tn5 与 Tn5 和 pA-Tn5 具有相似的活性。

C. 抗体结合和标记

1. 表位检索
a. 核分离后，将适量的 FFPE 核 (1,000–1,500,000) 转移到新的 1.5 mL Lo-Bind 管中。然后在室温下以 3,000 × g离心 5 分钟并弃去上清液。
注意：实验中使用的核数取决于从核分离步骤中获得的核总数。该协议适用于 1,000 到 1,500,000 个原子核。
b. 要分析组蛋白修饰 H3K27ac 和 H3K4me1（常染色质标记），用 50 μL Epitope Retrieval Buffer-1（见下表 13）重悬 FFPE 核，并将悬浮液转移到 PCR 管中。在 50 °C 下孵育核悬浮液1 小时。要分析组蛋白修饰 H3K27me3（异染色质标记）和 H3K36me3（基因体标记），需要更苛刻的表位检索条件。因此，用 50 μL Epitope Retrieval Buffer-2 （见下表 14 ）重悬细胞核，并将悬浮液转移到 PCR 管中。在 65 °C 下孵育核悬浮液1 小时。
c. 在孵育期间，准备 FACT-seq 抗体缓冲液（查看配方部分的更多信息）并将其置于冰上。
d. 孵育后，将 10 μL的10% Triton X-100 添加到管中，并将混合物转移到 1.5 mL Lo-Bind 管中。将试管置于摇床上，在 37 °C下以 500 rpm 的转速孵育 30 分钟以淬灭 SDS。
e. 淬灭后，在室温下以 3,000 × g离心5 分钟，然后用 FACT-seq Antibody 缓冲液清洗沉淀一次。
f. 洗涤后，用 200 μL FACT-seq Antibody 缓冲液重悬细胞核颗粒，并使用 5 μL细胞核悬浮液通过细胞计数器计数细胞核数。
注：表位修复后平均回收率为62.94%。
2. 一抗结合
a. 计数核后，将 100,000 个 FFPE 核转移到新的 0.5 mL Qubit 管中。
注意：在隔夜旋转步骤中，细胞核往往会附着在管壁上并变干，应使用 0.5 mL 管而不是 1.5 mL 管。
b. 在室温下以 2,500 × g离心细胞核5 分钟，然后用移液器弃去上清液。
c. 用至少 1 体积的 FACT-seq 抗体缓冲液重悬细胞核。
d. 在室温下以 2,500 × g将细胞核离心 5 分钟，然后用移液器弃去上清液，并用 200 μL FACT-seq Antibody 缓冲液和 1:100 稀释的一抗重悬细胞核。
e. 在 4°C 下缓慢旋转 (8–10 rpm) 孵育过夜。
提示：适当设置转速，不要让溶液粘在管子的一侧。
3. 二抗结合
a. 在开始实验之前准备以下缓冲液，并将其保存在冰上或 +4°C 下。
提示：我们总是新鲜制备这些缓冲液。
i. FACT-seq Dig-洗涤缓冲液（见下表 15）
ii. FACT-seq Dig-300 缓冲液（见下表 16）
iii. FACT-seq标记缓冲液（见下表 17）
b. 与一抗孵育过夜后，在室温下以 2,000 × g离心 5 分钟，用 200 μL FACT-seq Dig-washing 缓冲液清洗细胞核颗粒。
c. 在 200 μL的 FACT-seq Dig 洗涤缓冲液中重新悬浮细胞核颗粒，并在室温下缓慢旋转孵育混合物 1 小时。
d. × g的速度旋转混合物室温下 5 分钟，用 200 μL FACT-seq Dig-washing 缓冲液洗涤 3 次，用 200 μL含有 1:100 稀释 T7 pA-Tn5的 FACT-seq Dig-300 缓冲液重悬细胞核沉淀（提示： T7-pA-Tn5 在 B.2 节中组装。）。并且T7 pA-Tn5的蛋白A结构域具有与哺乳动物免疫球蛋白结合的亲和力，该免疫球蛋白将与豚鼠的二抗结合。
e. 将试管在室温下旋转 1 小时。
4. 标记和反向交联
a. × g离心 5 分钟并用 FACT-seq Dig-300 缓冲液洗涤 3 次，用 200 μL FACT-seq标记缓冲液重悬细胞核，并在 37 °下孵育悬浮液 1小时C。
b. 之后，通过在每个管中加入 6.7 μL的0.5 M EDTA、22 μL的 10% SDS 和 2.2 μL的 20 mg/mL 蛋白酶 K 来停止标记，并通过轻轻上下吹打几次来混合。
c. °C下进行蛋白酶 K 消化，以 1，200 rpm 摇动 2 小时。
d. °C 下过夜进行反向交联在 H3K27ac 或 H3K4me1 的加热块中转速为 1,200 rpm（将 H3K27me3 或 H3K36me3 的过夜温度更改为80 °C）。
e. 过夜反向交联后，加入 2.2 µL 的 20 mg/mL 蛋白酶 K，再次进行蛋白酶 K 消化（65°C，1,200 rpm）1 小时。

D. DNA分离和体外转录

1. DNA纯化
a. 蛋白酶 K 消化后，使用 Qiagen 试剂盒纯化或苯酚-氯仿纯化对混合物进行纯化。（提示：使用这两种不同的纯化方法靶向 H3K27ac 时，我们没有发现文库质量存在差异。当靶向 H3K27me3（异染色质标记）时，建议使用苯酚-氯仿纯化）。
b. 对于 Qiagen 纯化，遵循Qiagen MiniElute PCR Purification kit的标准方案，最后在 20 μL洗脱缓冲液中洗脱 DNA。
c. 对于苯酚-氯仿纯化，蛋白酶 K消化后，向管中加入洗脱缓冲液或无菌水，使每管终体积为 300 μL 。加入 300 μL苯酚并全速混合涡旋约 2 秒。
d. 16,000 × g和 4°C 离心 15 分钟。通过移液到新的 1.5 mL 管中除去水层，并加入等量的氯仿。
e. 将试管倒置约 10 ×以混合，并在 16,000 × g和 4°C 下离心 15 分钟。
f. 将水层转移到新的 1.5 mL 试管中，然后加入 2.5 × –3 ×体积的无水乙醇和适量的 5M NaCl，使终浓度变为 200 mM (NaCl)。
g. 将试管转移至 -80 °C冰箱并沉淀 DNA 2-3 小时，然后在 16,000 和 4 °C 下将试管离心 20 分钟 × 克。
h. 弃去上清液，加入 700 μL的 70% 乙醇并轻轻涡旋。 16,000离心机 × g在 4°C 下保持 5 分钟，然后弃去上清液并将管风干 10-15 分钟。干燥后，加入 25 μL洗脱缓冲液（来自 Qiagen MiniElution PCR Purification kit）以溶解 DNA。
2. 间隙填充
提示：Tn5 标记后，马赛克末端和染色质链之间会有两个 9 bp 的间隙。而填空就是用高保真DNA聚合酶来填补这两个空缺。
a. DNA 纯化后，将样品转移到 PCR 管中，加入等体积的高保真2 × PCR 预混液。
b. 然后将混合物在热循环仪中于 72°C 孵育 8 分钟。
c. 使用 Qiagen MiniElute PCR 纯化试剂盒纯化样品。
3. SPRI 珠纯化
a. × SPRI 选择珠去除小于 150 bp 的片段。最初，将体积补足至 50 μL并加入 1.0 × SPRI ，然后将混合物在室温下孵育 15 分钟。
b. 孵化后，将管子转移到磁架上 10 分钟，然后用 150 μL的 80% 乙醇清洗珠子两次。
c. 洗涤后，让磁珠干燥，加入 25 μL水，室温孵育 10 分钟。
d. 将试管转移到磁架上，然后小心地将上清液转移到新试管中。
4. 体外转录和 RNA 纯化
a. μL反应系统的T7 RNA 合成试剂盒将 DNA 转化为 RNA，根据制造商的方案将混合物在 37°C 下孵育过夜，以获得大量的 RNA 。
b. 使用 ZYMO DNase RNA 纯化试剂盒纯化 RNA，最后用试剂盒中的 15 μL洗脱缓冲液洗脱。并使用 Nanodrop 2000c 测量 RNA 浓度（更多信息参见表 5）。
提示：我们遵循制造商标准方案进行体外转录和 RNA 纯化。有关详细程序，请参阅这两个套件的标准协议。

表 5.体外转录和纯化后的代表性 RNA 浓度
初始核数/管平均 RNA 浓度1 (ng/ μ L ) RNA总量（微克/管） 260/280 _
50000 8898.5 133.5 2.19
25000 8484.2 127.3 2.15
10000 7508.4 112.6 2.11
5000 3215.5 48.2 2.03
2500 1012.7 15.2 1.98
1000 139.0 2.1 1.97
1对于这个特定的实验，体外转录进行了 22 – 23 小时

E. 逆转录和预PCR

1. 逆转录
a. 将 100 ng RNA 转移到新试管中，并使用 TAKARA 逆转录试剂盒进行逆转录。逆转录终体积为 22.2 μL /管。
提示：我们按照制造商标准协议进行逆转录。有关详细程序，请参阅此套件中的标准协议。
2. g RNAClean XP 微珠纯化 cDNA
a. 补足体积至 40 μL并加入 1.8 × RNAClean XP 珠子，在室温下孵育混合物 15 分钟。
提示：“1.8 × RNAClean XP 微珠”是指体积的 1.8 倍。每 40 μL反应液中加入72 μL RNAClean XP 微珠。
b. 孵化后，将管子转移到磁架上 10 分钟，然后用 200 μL的 70% 乙醇清洗珠子两次。
c. 洗涤后，让磁珠干燥，加入 24.2 μL水，孵育 10 分钟，然后将试管转移到磁力架上。珠子与磁架结合，然后小心地将上清液转移到新试管中。
3. PCR前
a. μL PCR 预混液、0.8 μL反向引物（ 25 μM ）（寡核苷酸序列见表 6），将单链 cDNA 转化为双链 DNA 。
b. 然后进行 pre-PCR（98°C 10 s，63°C 30s，72°C 1 min，10°C 保持，仅一个循环）并使用 Qiagen纯化和洗脱 24.5 μL样品MiniElute PCR 纯化试剂盒。

表 6.反向引物序列

姓名寡核苷酸序列
反向底漆 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG -3'

F. 第二次标记和文库制备

1. 二次标记
a. 第二个标记旨在向 DNA 添加一对接头，以便 DNA 片段可以正确扩增和测序。
b. 通过添加 25 μL的 2 × TD 缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.6、10 mM MgCl 2 、 20% 二甲基甲酰胺）、0.5 μL的 2 μM Tn5 对样品进行标记，并在 55°C 下孵育 7 分钟.
c. ，使用 Qiagen MiniElute PCR 纯化试剂盒在 24.2 μL洗脱缓冲液中纯化和洗脱样品。
2. PCR扩增和文库制备
a. 标记和纯化后，通过添加 25 μL 2 × PCR 预混液、0.4 μL正向引物 (25 μM )、0.4 μL反向引物 (25 μM )进行最终文库扩增。
提示：正向和反向引物改编自之前报告中的 96 对引物 ( Buenrostro et al., 2015 )。请参阅原始论文以获取更多信息。
b. 进行 PCR 扩增（72°C 5 分钟，20 个循环，98°C 10 秒，63°C 30 秒，72°C 1 分钟并保持在 10°C）。
c. 使用 Qiagen MiniElute PCR 纯化试剂盒纯化样品。
3. 尺寸选择和凝胶纯化
a. 文库扩增和纯化后，文库在 8% 丙烯酰胺凝胶上运行。
b. 充分混合8%丙烯酰胺凝胶（参见表 7. 了解更多信息）中的所有组分。
c. 将混合物转移到相应的聚丙烯酰胺凝胶托盘中，使其在室温下固化 30 分钟。
d. 在等待期间，准备 DNA 梯并将所有样品与 6 × DNA 上样染料混合。
e. 将所有样品和 50 bp DNA 梯加载到凝胶上，并在 180 V 下运行15-20分钟。
f. 运行后，将凝胶转移到 1 × SYBR gold 中并在黑暗中染色 20 分钟。

表 7 。 8%丙烯酰胺凝胶（一凝胶）配方

试剂体积（10 毫升）
40%丙烯酰胺：双丙烯酰胺 2 毫升
10× TBE 缓冲液 1毫升
10% 过硫酸铵 50微升
TEMED 10微升
无菌水 6.94 毫升

g. 染色后，在凝胶记录系统下检查凝胶，并参考 50 bp DNA 梯从 220-1,000 bp切割每个凝胶泳道。
h. 将每个凝胶切入 0.5 mL 冲孔管中，然后浸入 2 mL Eppendorf 管中。然后将两个管以 16,000 × g离心5 分钟，并丢弃 0.5 mL 穿孔管。
注意：此步骤的目的是将整个凝胶通道变成小块。
i. 添加 300 μL 将粉碎浸泡缓冲液（500 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5% SDS [表 18]）加入凝胶中，并在 55°C 下孵育混合物至少 8 小时以溶解缓冲液中的 DNA 片段。
注意：此步骤的目的是溶解缓冲液中的 DNA 片段。
j. × g离心 5 分钟。
k. 然后收集通过 costar 过滤器的溶液并使用Zymo ChIP DNA Clean and concentrator 试剂盒对其进行纯化，最后在 15 μL中洗脱。
提示：我们按照制造商标准方案进行 DNA 纯化。有关详细程序，请参阅此套件中的标准协议。

G. 精确定量和测序

1. 使用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒按照制造方案精确定量 FACT-seq 文库的 DNA 浓度。
提示：有关详细程序，请参阅此套件中的协议。
2. 测序：在Illumina NovaSeq 6000测序仪或Illumina MiniSeq平台上对FACT-seq文库进行配对末端测序，部分结果（Zhao et al. , 2021）如图3所示。
提示：有关详细步骤，请参阅 Illumina 的协议。

图 3。小鼠肾核 H3K27ac 测序文库的代表性基因组浏览器轨迹，来自Zhao等人。（2021 年）。
结果来自小鼠 FFPE 肾核的 H3K27ac FACT-seq（- 表位检索）、小鼠 FFPE 肾核的 H3K27ac FACT-seq（+ 表位检索）、冷冻小鼠肾核的 H3K27ac CUT&Tag 、冷冻小鼠肾核的编码 H3K27ac ChIP - seq , 和CUT&Tag对小鼠肾细胞核的 IgG 对照。基因名称显示在底部。 Chr = 染色体。详细分析参考FACT-seq论文（赵等，2021）。

数据分析

1. 只有读取一个（R1）将参与下游分析。我们首先采用levenshtein距离算法将 T7 启动子序列映射到适配器修剪过程中的每个读取；然后可以使用内部脚本自定义脚本 ( https://github.com/pengweixing/FACT ) 从fastq文件中的每个读取中修剪 T7 启动子序列。
2. 参数 --end-to-end 的bowtie2 v.2.3.5 ( Langmead and Salzberg , 2012 )将修剪后的人类样本和小鼠样本的fastq文件分别映射到 hg19/hg38 参考基因组或 mm9/mm10 参考基因组--very-sensitive -I 10 -X 700。对齐的 BAM 文件由samtools v.1.9排序（李等人，2009 年）。使用 Picard v1.79 ( http://picard.sourceforge.net ) 删除重复读数，并以 >q2 的对齐质量进行过滤。对于峰值调用，可以使用 SICER ( Zhang et al ., 2008 ) 调用宽峰，其参数间隙大小 = 600 bp 和窗口大小 = 200 bp。可以使用具有以下参数间隙大小 = 400 bp 和窗口大小 = 200 bp 的 SICER 调用窄峰。 bigwig 文件是使用deeptools ( Ramirez et al ., 2014 ) 从 BAM 文件生成的，参数为 bamCoverage - normalizeUsing CPM。测序文库的峰值通过 IGV ( ( Thorvaldsdottir 等人，2013 年）软件。

笔记

1. 使用脱氧胆酸钠、洋地黄皂苷和 SDS 等洗涤剂时要格外小心。将脱氧胆酸钠和洋地黄皂苷粉末溶解在液体中时，请记住戴上口罩、实验室外套和手套。
2. 我们已经成功地分析了 FFPE 小鼠细胞核中的 H3K27ac，输入量有限（1,000 个细胞核/管或从含有大约 5,000 个细胞核的一小块组织开始细胞核分离）。因此，即使核输入少于 100,000 个核/管，FACT-seq 协议通常也可以工作。
3. 表位检索条件是获得良好文库质量的重要步骤。在这里，我们提供了 H3K27ac、H3K27me3、H3K4me1 和 H3K36me3 的最佳表位检索条件。此表位检索条件可直接用于其他组蛋白修饰，包括 H3K4me3、H3K9me2 或 H3K9me3。
4. 如果您想测试未知条件，则针对 H3K27ac 的 FACT-seq 可能是阳性对照。
5. 我们在标记和纯化后得到的 DNA 量范围为 100 ng–300 ng/管（每管从 100,000 个 FFPE 核开始）。除非 DNA 浓度太低（< 10 ng/管）或 DNA 纯度太差（A 260/280 < 1.5），否则我们将始终进行文库制备。
6. 我们已经成功地在 FFPE 人结肠直肠癌和 FFPE 人胶质母细胞瘤样本中进行了 FACT-seq。使用不同的样本或分析不同的标记时，体外转录后的 RNA 产量会有所不同。如果特定样本的 RNA 产量较低，您可以尝试将体外转录的时间从过夜（8 小时）延长到 16 小时甚至更长。我们进行的最长体外转录大约是 23 小时，而且我们仍然有很好的文库。
7. 对于RNA纯化，我们最初使用传统的TRIzol RNA纯化，取得了不错的效果。由于TRIzol纯化耗时，我们最终改用试剂盒纯化。

食谱

1. 从 FFPE 组织切片中分离单核悬浮液的缓冲液

表 8. NST 缓冲液配方（ N onidet P40 with S alts 和Tris缓冲液）
试剂初始浓度最终浓度稀释倍数最终体积 (10 毫升)
氯化钠 5,000 毫米 146 毫米 34.25 292微升
Tris-HCl pH 7.5 1,000 毫米 5毫米 200 50微升
Tris-HCl pH 8 1,000 毫米 5毫米 200 50微升
氯化钙2 1,000 毫米 1毫米 1000 10微升
氯化镁2 1,000 毫米 21 毫米 47.62 210微升
牛血清白蛋白 10% 0.05% 200 50微升
伊格帕尔 CA-630 10% 0.20% 50 200微升
无核酸酶水 / / / 9138微升

胶原酶：含 0.5 mM CaCl 2的 PBS 中 6 mg/mL
2的 PBS 中 600 单位/mL

2. 用于 Tn5 组装和活性测定的缓冲液

表 9 。 2 ×透析缓冲液配方

试剂初始浓度最终浓度稀释倍数最终体积 (10 毫升)
HEPES(K+) pH 7.2 500 毫米 100 毫米 5 2 毫升
氯化钠 5,000 毫米 200 毫米 25 400微升
乙二胺四乙酸 500 毫米 0.2 毫米 2500 4微升
数字地面电视 500 毫米 2毫米 250 40微升
海卫 X-100 10% 0.20% 50 200微升
甘油 100% 20% 5 2 毫升
无核酸酶水 / / / 5,356微升

表 10 。 Tn5组装配方

试剂初始浓度最终浓度稀释倍数最终体积 (50 μL )
Tn5MErev/Tn5ME-A 50微米 2微米 25 2微升
Tn5MErev/Tn5ME-B 50微米 2微米 25 2微升
甘油 100% 40% 2.5 20微升
2 ×透析缓冲液 / / / 15.24微升
Tn5 46.55微米 2微米 23.26 2.15微升
无核酸酶水 / / / 8.61微升

表 11 。 T7 pA-Tn5 组装配方

试剂初始浓度最终浓度稀释倍数最终体积 (50 μL )
Tn5MErev/Tn5ME-A 50微米 4微米 12.5 4微升
甘油 100% 40% 2.5 20微升
2 ×透析缓冲液 / / / 15.58微升
pA-Tn5 55.55微米 2微米 27.76 1.81微升
无核酸酶水 / / / 8.61微升

表 12. 2 × TD 缓冲液的配方

试剂初始浓度最终浓度稀释倍数最终体积 (10 毫升)
Tris-HCl pH 7.5 1,000 毫米 20毫米 50 200微升
氯化镁2 1,000 毫米 10毫米 100 100微升
二甲基甲酰胺 100% 20% 5 2 毫升
无核酸酶水 / / / 最多 10 毫升

3. 用于表位检索的缓冲液

表 13。 Epitope Retrieval Buffer-1的配方

试剂初始浓度最终浓度稀释倍数最终体积 (10 毫升)
乙二胺四乙酸 500 毫米 10毫米 50 200微升
Tris-HCl pH 8 1,000 毫米 50毫米 20 500微升
安全数据表 10% 0.10% 100 100微升
无核酸酶水 / / / 9.2 毫升

表 14. Epitope Retrieval Buffer-2 的配方

试剂初始浓度最终浓度稀释倍数最终体积 (10 毫升)
乙二胺四乙酸 500 毫米 10毫米 50 200微升
Tris-HCl pH 8 1,000 毫米 50毫米 20 500微升
安全数据表 10% 0.10% 100 100微升
脱氧胆酸钠 10% 0.10% 100 100微升
无核酸酶
水 / / / 9.1 毫升

4. 用于抗体结合和标记的缓冲液

表 15. FACT-seq Dig-washing 缓冲液的配方（用于 8 个文库）

试剂初始浓度最终浓度稀释倍数最终体积 (15 毫升)
HEPES(K+) pH 7.6 500 毫米 20毫米 25 600微升
氯化钠 5,000 毫米 150 毫米 33.33 450微升
亚精胺 2,000 毫米 0.5 毫米 4,000 3.75微升
洋地黄皂苷 5% 0.05% 100 150微升
伊格帕尔 CA-630 10% 0.01% 1,000 15微升
牛血清白蛋白 10% 1% 10 1,500微升
无核酸酶水
（添加蛋白酶抑制剂） / / 12.28 毫升

要制备 FACT-seq 抗体缓冲液（用于 8 个文库），将 4 mL的 FACT-seq Dig-washing 缓冲液转移到新试管中，加入 16 μL的 0.5 M EDTA，充分混合并保持在冰上。

表 16。 FACT-seq Dig-300 缓冲液配方（适用于 8 个文库）

试剂初始浓度最终浓度稀释倍数最终体积 (10 毫升)
HEPES(K+) pH 7.6 500 毫米 20毫米 25 400微升
氯化钠 5,000 毫米 300 毫米 16.67 600微升
亚精胺 2,000 毫米 0.5 毫米 4,000 2.5微升
洋地黄皂苷 5% 0.05% 100 100微升
伊格帕尔 CA-630 10% 0.01% 1,000 100微升
牛血清白蛋白 10% 1% 10 1,000微升
无核酸酶水
（添加蛋白酶抑制剂） / / 7.89 毫升

表 17。 FACT-seq 标记缓冲液的配方（用于 8 个库）

试剂初始浓度最终浓度稀释倍数最终体积 (2 毫升)
HEPES (K+) pH 7.6 500 毫米 20毫米 25 80微升
氯化钠 5,000 毫米 300 毫米 16.67 120微升
亚精胺 2,000 毫米 0.5 毫米 4,000 0.5微升
洋地黄皂苷 5% 0.05% 100 20微升
伊格帕尔 CA-630 10% 0.01% 1000 2微升
氯化镁2 1,000 毫米 10毫米 100 20微升
无核酸酶水
（添加蛋白酶抑制剂） / / 1,757.5微升

5. 用于文库制备的缓冲液

表 18.挤压浸泡缓冲液配方

试剂初始浓度最终浓度稀释倍数最终体积 (10 毫升)
氯化钠 5,000 毫米 500 毫米 10 1,000微升
乙二胺四乙酸 500 毫米 1毫米 500 20微升
安全数据表 10% 0.50% 20 500微升
无核酸酶水 / / / 8,480微升

致谢

该协议源自 Chen Lab (Zhao et al. , 2021) 之前的出版物 FACT-seq。我们要感谢参与这项工作的所有陈实验室成员的贡献。我们要感谢卡罗林斯卡研究所的蛋白质科学设施提供纯化的 Tn5 和 pA-Tn5。我们的资金来源包括：瑞典研究委员会 [VR-2016-06794, VR-201702074 to XC]；奥克维伯格斯僵硬[M20-0007 至 XC ]；北尔基金会（至 XC）；杰森基金会（至 XC）； Petrus och Augusta Hedlunds Stiftelse （至 XC）； Göran Gustafsson 的年轻研究人员奖（授予 XC）； Vleugel基金会（至 XC）； Linnéstiftelsen for medicinsk 分叉（到 XC）；乌普萨拉大学（至 XC）；瑞典癌症协会 (CAN 2021-1449Pj, 22 0491 JIA to XC)。

利益争夺

Xingqi Chen 、Vamsi Krishna Polavarapu和Linxuan Zhao已提交与先前发表的 FACT-seq 论文和此处描述的协议相关的专利申请。专利申请的标题是 “从福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织样本中制备 DNA 的方法”。瑞典临时申请于 2021 年 6 月 28 日在瑞典提交，专利申请号2150823-9 。作者声明没有竞争的经济利益。

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